Caratterizzazione e predizione funzionale dei batteri nei tessuti ovarici
October 23rd, 2021
La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S (gene rRNA 16S) sono stati eseguiti al fine di scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compositiva e funzionale dei batteri sono state previste utilizzando BugBase e Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).
Questo protocollo è progettato per scoprire i batteri nei tessuti ovarici e prevedere le loro funzioni. La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento dell'rRNA 16S sono stati utilizzati per scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compensatrici e funzionali dei batteri sono previste utilizzando BoP e indagini cellulare-genetiche delle comunità mediante ricostruzione di giorni non osservati.
Il nostro protocollo mira a estrarre batteri dai tessuti ovarici in situ. Può anche essere usato per scoprire batteri in tumori di qualsiasi tipo. I principali vantaggi del nostro protocollo sono che è facile e conveniente, che può essere realizzato in quasi tutti i laboratori.
È anche rapido ottenere i risultati. Durante la pratica nel protocollo, è importante escludere eventuali batteri fuori sede tessuti tumorali. Pertanto, tutte le procedure in questo protocollo devono essere sterili.
Durante l'intervento chirurgico, separare le ovaie resecate in campioni di tessuto spessi circa un centimetro con un paio di nuove pinzette sterili. Evitare di toccare qualsiasi altra cosa durante l'intera procedura. Dopo la separazione, rimuovere il campione in un tubo sterile e metterlo in azoto liquido per la trasmissione.
Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Fissare i tessuti con la formalina e quindi incorporarli con la paraffina. Questo protocollo può essere messo in pausa qui.
I tessuti possono essere conservati a temperatura ambiente per una conservazione più lunga. Per eseguire ulteriori passaggi, tagliare i campioni in sezioni seriali a cinque micrometri. Quindi, asciugare i campioni.
Fare de-paraffina e reidratazione ai campioni. Per recuperare l'antigene, è necessario un trattamento a microonde di 10 minuti nel tampone EDTA. Immergere i campioni in PBS che contiene lo 0,3% di idrogeno.
Perossidizzare per 20 minuti per interrompere l'attività della perossidasi endogena. Eseguire l'anticorpo EMA al nucleo LPS, ad una concentrazione di 1 su 300. E mantenerlo per una notte a quattro gradi Celsius.
Per scoprire i batteri, utilizzare un kit di substrato DAP per rilevare l'esistenza di HRP. Sulla base delle istruzioni di un produttore, utilizzare il polimero HRP, l'anticorpo anti-coniglio. Utilizzare il concentratore da tavolo per consentire agli anticorpi di combinarsi completamente.
Utilizzare PBS per eliminare gli anticorpi non pettinati. Eseguire la colorazione chimica secondo le istruzioni del produttore, quindi lavare i campioni sott'acqua. Fai disidratazione ai campioni.
Campioni di abiti firmando. E inserisci come campione utilizzando la libreria di imaging Pro Plus Prepare basata sul protocollo del produttore. Pratica il modello di primer, che consiste nelle sequenze specifiche del gene e nelle sequenze nucleotidiche di sporgenza dell'adattatore Illumina.
Per amplificare i tassi di natalità per la regione V4 di 16s batterici su sequenze di geni rRNA, amplificare il modello dall'input del campione di DNA utilizzando amplicon PCR. Utilizzare perle magnetiche Mag-Bind RxNPure Plus per rimuovere la miscela di reazione dal prodotto PCR. Eseguire l'amplificazione PCR indicizzata per la seconda volta.
Utilizzare Agilent 2200 TapeStation per controllare la libreria. Utilizzare QuantiFluor dsDNA System per quantificare la libreria. Con un ciclo 600, la cella a flusso standard v3 produce circa 100.000 estremità accoppiate.
2 volte 300 base 3. Le librerie vengono denormalizzate, raggruppate e sequenziate. Le velocità grezze di ogni campione sono filtrate sulla base della qualità del sequenziamento da parte di Trimmomatic.
Le sequenze di primer e adattatore devono essere entrambe rimosse. Le letture di sequenza con entrambe le coppie e le qualità inferiori a 25 dovrebbero essere abbreviate. Analizza l'rRNA 16s dal pacchetto software QIIME.
Raccogliere sequenze per formare OTU con un cutoff di somiglianza al 97% Per le OTU, l'abbondanza relativa dovrebbe essere calcolata in ciascun campione. Utilizzare un classificatore bayesiano, che si trova nel set di formazione RDP per ordinare tutte le sequenze. Con una data OTU, una classificazione che ha la maggiore coerenza delle sequenze viene assegnata alle OTU.
Le OTA sono allineate al database Silva, sulla base di un campione di informazioni di gruppo. Eseguire la diversità alfa e l'analisi delle coordinate principali basata su UniFrac. Per prevedere la presentazione relativa delle caratteristiche dei batteri utilizzare BugBase.
Predire la composizione funzionale di un metagenoma a PICRUSt. Con l'utilizzo di dati di monitoraggio e un database contenente genomi di riferimento, analizza le diverse funzioni tra ciascun gruppo con l'aiuto del software STAMP. Utilizzare un software statistico per calcolare il risultato.
L'indicazione della significatività statistica deve essere impostata come p inferiore a 0,05. Calcola i fattori confondenti, che includono età e parità, dal t-test dello studente. Calcola lo stato della menopausa, la storia di ipertensione e diabete con il test Chi-quadrato.
Calcola il numero di taxa dei batteri ovaari con il test Mann-Whitney U. 16 pazienti sono stati arruolati in questo studio. BugBase è stato utilizzato per praticare l'analisi dei metagenomi previsti.
La potenziale patogenetica e immunoistochimica delle ovaie utilizzando anticorpi antibatterici LPS. Questa figura mostra la ricchezza batterica e la diversità nei gruppi di cancro e di controllo. Rivelato dal sequenziamento dell'rRNA 16S.
Le cifre sono osservate indice di specie. Indice Chao1, indice ACE, indice Shannon, indice Evenness, indice Simpson, rispettivamente. L'abbondanza relativa di phyla e delle 12 specie batteriche più abbondanti nei campioni ovarici è mostrata in questa figura.
Figura A, B, C e D.Indica l'abbondanza relativa del pannello nelle ovaie delle pazienti nel gruppo di controllo e nel gruppo di cancro ovarico. L'abbondanza relativa delle dodici specie di batteri più abbondanti nelle ovaie delle pazienti di controllo e del gruppo di cancro ovarico. Questo è più comune, raggruppato usando PCoA e l'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata.
La Figura A mostra i più comuni, che sono stati raggruppati utilizzando PCoA. PC1 e PC2 sono tracciati sull'asse x e sull'asse y. Il blocco rosso è uguale al campione nel gruppo del cancro ovarico.
Il cerchio blu è uguale a un campione nel gruppo di controllo. I campioni del gruppo di cancro ovarico possono essere separati da altri campioni nel gruppo di controllo. La figura B mostra i più comuni che sono stati raggruppati utilizzando PCoA.
PC1 e PC2 sono tracciati sugli assi x e y. Il blocco rosso è uguale a un campione nel gruppo del cancro ovarico. Il cerchio solido blu è uguale a un campione della paziente con mioma uterino.
E il cerchio cavo blu è uguale a un campione di una paziente con adenomiosi uterina. La figura C mostra l'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum. La figura D è Methanosarcina vacuolata.
Questa figura è l'analisi BugBase della metagenomica prevista. Il fenotipo potenzialmente patogenetico e ossidativo di tolleranza allo stress delle ovaie nel gruppo tumorale era più forte di quello del gruppo di controllo. Questa cifra è significativamente diversa dallo spazio del percorso KEGG tra il cancro e i gruppi di controllo mediante analisi PICRUSt.
Quando otteniamo i nostri campioni, è necessario un paio di nuove pinzette sterili. Prestare attenzione alla potenziale contaminazione dei campioni. Che i tessuti tumorali fuori sede dei batteri possono influenzare notevolmente la risoluzione.
È preferibile impostare il gruppo di controllo su ogni passaggio. Al fine di ridurre l'effetto della potenziale contaminazione.
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Panoramica
Questo protocollo è progettato per scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. L'immunoistochimica e il sequenziamento dell'rRNA 16S vengono utilizzati per prevedere le differenze compositive e funzionali dei batteri.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Microbiologia
- Oncologia
- Immunologia
Sfondo
- Comprendere la composizione batterica nei tessuti ovarici può fornire informazioni sulla biologia del cancro.
- L'immunoistochimica consente la visualizzazione dei batteri nei campioni di tessuto.
- Il sequenziamento dell'rRNA 16S è uno strumento potente per identificare le specie batteriche.
- Strumenti predittivi come BugBase e PICRUSt possono inferire le funzioni batteriche in base alle loro informazioni genetiche.
Obiettivo dello studio
- Esttrarre e identificare batteri dai tessuti ovarici.
- Confrontare le popolazioni batteriche nei tessuti cancerosi rispetto a quelli non cancerosi.
- Prevedere i ruoli funzionali dei batteri identificati.
Metodi utilizzati
- Immunoistochimica per la visualizzazione del tessuto.
- Sequenziamento del gene dell'rRNA 16S per l'identificazione batterica.
- BugBase per prevedere la composizione batterica.
- PICRUSt per prevedere le differenze funzionali tra i batteri.
Risultati principali
- Identificazione di popolazioni batteriche distinte nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi.
- Le previsioni funzionali indicano differenze nelle capacità metaboliche tra i due tipi di tessuto.
- Il protocollo è adattabile per l'uso con vari tipi di tumore.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un quadro per comprendere il ruolo dei batteri nel cancro ovarico.
- I metodi sono accessibili e possono essere implementati nella maggior parte dei laboratori.
- Ulteriori ricerche potrebbero esplorare le implicazioni di queste comunità batteriche nella progressione del cancro.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding microbial presence in ovarian tissues addresses a growing need to de-risk cancer target hypotheses by revealing microenvironmental factors that may influence tumor biology. This protocol enables biopharma R&D to assess bacterial contributions to oncogenic pathways, supporting mechanistic insight in early discovery. By providing a standardized method to detect and functionally predict tissue-associated microbes, it aids in prioritizing targets with stronger translational confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor microenvironment hypotheses by identifying bacteria differentially abundant in cancerous versus non-cancerous ovarian tissues.
- Operational Value: Uses immunohistochemistry and 16S rRNA sequencing to spatially resolve and quantify bacterial presence in situ.
- Predictive Value: Employs BugBase and PICRUSt to infer functional phenotypes, such as pathogenicity and oxidative stress tolerance, linked to cancer phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable 16S rRNA sequencing outputs suitable for comparative microbial profiling across sample groups.
- Reproducibility: Incorporates contamination controls and sterile tissue handling to ensure reliable detection of true tissue-associated signals.
- Scalability: Compatible with high-throughput sequencing and bioinformatics pipelines for broader application across tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Detects microbial signatures in human ovarian cancer tissues, supporting relevance to human pathophysiology.
- Translational Continuity: Enables longitudinal tracking of microbial shifts from normal to malignant states, informing biomarker discovery.
- Mechanistic De-risking: Predicts functional microbial contributions (e.g., metabolic pathways) that may modulate tumor progression or therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation to preclinical validation, particularly in immuno-oncology and microenvironment-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether specific bacteria are enriched in tumor tissues and associated with cancer phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative microbial profiling data that can be integrated with multi-omics datasets for target prioritization.
- Analytics: Provides functional predictions via BugBase and PICRUSt, enabling comparison of metabolic and phenotypic potentials between groups.
- Translational Research: Connects microbial detection to cancer biology through differential abundance and functional inference in patient-derived tissues.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other solid tumors, allowing cross-cancer microbiome studies using a standardized workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking microbial presence to functional phenotypes in cancer-relevant pathways.
- Operational Value: Employs accessible techniques (IHC, 16S sequencing, bioinformatics) feasible in most research laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying microbial confounders or modulators of tumor biology early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target selection by accounting for microenvironmental variables that may affect drug efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, molecular biology, and bioinformatics for sequencing and functional prediction.
- Necessitates sterile tissue handling, PCR equipment, sequencing platforms, and tools like QIIME, Trimmomatic, and STAMP.
- Demands standardized protocols across sites to minimize contamination and ensure comparability of microbial data.
- Must account for host tissue variability and low biomass challenges when applying to other organ systems.
- Limited by detection sensitivity in low-abundance communities and dependence on reference databases for functional inference.
