Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Questo protocollo consente l'isolamento e lo studio di adipociti vitali e di cellule SVF della frazione vascolare stromale dal grasso viscerale umano. La digestione enzimatica mediante collagenasi garantisce un'elevata resa di RNA totale da adipociti maturi, compresi i microRNA adatti all'analisi dell'espressione. Allo stesso tempo, il metodo è ottimizzato per identificare i macrofagi mediante citometria a flusso.

Questo protocollo fornisce linee guida fondamentali per la risoluzione dei problemi per isolare in modo semplice ed efficiente adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie VAT umane in un unico processo. Dopo la chiusura uterina e l'emostasi, identificare l'omento maggiore ed estenderlo su un impacco umido. Identifica una zona avascolare e usa le pinze Kelly per perforare il lato esterno del tessuto adiposo viscerale, o VAT.

Utilizzare la pinza di Ochsner per bloccare il lato prossimale e distale nella zona in cui è stata perforata la VAT e utilizzare le forbici Metzenbaum per tagliare il tessuto. Legare il grande omento con la seta nera numero uno, quindi rimuovere la pinza di Ochsner e valutare l'emostasi. Per eseguire la digestione enzimatica, tagliare quattro grammi di IVA e utilizzare le forbici per tritare il tessuto in piccoli pezzi in un vassoio di dissezione.

Trasferire i pezzi in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri e aggiungere 25 millilitri di soluzione digestiva. Incubare la provetta a 37 gradi Celsius per 60 minuti in un agitatore orbitale a 125 giri/min. Quindi filtrare il tessuto digerito attraverso tre strati di garza in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri.

Centrifugare la provetta a 200 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, dovrebbero essere visibili due fasi. La fase superiore corrisponde agli adipociti maturi mentre le cellule SVF rimangono nel pellet.

Trasferire gli adipociti maturi in una provetta. Lisi le cellule aggiungendo 1000 microlitri di reagente a base di acido-guanidinio-fenolo e mescolare accuratamente con una micropipetta P1000 per omogeneizzare. Incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente per aumentare la dissociazione dei complessi nucleo-proteine.

Centrifugare il lisato cellulare per cinque minuti a 12.000 G per ottenere tre fasi, una fase gialla superiore corrispondente ai lipidi degli adipociti, una fase rosa media corrispondente agli acidi nucleici e un pellet con detriti cellulari. Rimuovere con cautela lo strato lipidico con una micropipetta P200. Quindi trasferire la fase centrale in un nuovo tubo da due millilitri, facendo attenzione a non disturbare le altre fasi.

Dopo aver purificato l'RNA e misurato la concentrazione con uno spettrofotometro UV visibile, utilizzare un kit di integrità dell'RNA per determinare il numero di integrità dell'RNA. Quindi utilizzare il kit di piccoli RNA per determinare la concentrazione e la percentuale di microRNA. Inserire la clip in un bioanalizzatore.

Diluire 10 microlitri di sospensione cellulare SVF in 90 microlitri di soluzione di blu di tripano allo 0,4% e applicare 10 microlitri a un emocitometro standard. Contare attentamente le celle vitali, escluse le celle morte, in quattro quadrati all'angolo della camera di conteggio. Trasferire un totale di 1 milione di cellule SVF per millilitro in una provetta in polipropilene a fondo tondo da cinque millilitri per citometria a flusso e pellettare le cellule mediante centrifugazione a 800 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Agitare con cura per allentare il pellet e risospendere le celle in 100 microlitri di PBS. Aggiungere la concentrazione ottimale pretitolata di ciascun anticorpo monoclonale coniugato con fluorocromo specifico per un antigene di superficie cellulare e mescolare delicatamente, quindi incubare le cellule per 15 minuti al buio. Aggiungere un eccesso di PBS freddo.

E centrifugare l'SVF a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Decantare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in cinque millilitri di liquido di guaina.

Quindi filtrare le cellule attraverso tre strati di garza in una nuova provetta in polipropilene a fondo tondo da cinque millilitri. Agitare brevemente ogni tubo prima dell'analisi e contare un minimo di 10.000 eventi per l'analisi del flusso. Questo protocollo di estrazione dell'RNA è stato utilizzato per ottenere RNA e microRNA di purezza adeguata e alta integrità da adipociti maturi.

L'integrità dell'RNA è stata valutata da un analizzatore di controllo qualità dell'RNA. Circa 2,8 volte 10 delle sei cellule nucleate erano presenti per grammo di tessuto adiposo viscerale. Le cellule della frazione vascolare stromale sono state marcate con anticorpi primari coniugati con fluorofori per identificare e caratterizzare 18 macrofagi mediante analisi di smistamento cellulare attivata dalla fluorescenza.

Gli aggregati cellulari sono stati eliminati dall'analisi tracciando l'area di dispersione diretta rispetto all'altezza di dispersione diretta. Quindi i detriti cellulari sono stati esclusi mediante gating delle cellule, in base alle dimensioni e alla complessità corrette, utilizzando l'area di dispersione diretta e l'area di dispersione laterale. Per analizzare i macrofagi, i monociti e le cellule del lignaggio dei macrofagi sono stati selezionati utilizzando i marcatori CD45 e CD14.

Successivamente, le cellule CD45-CD14 doppie positive sono state separate in base all'espressione del marcatore macrofagico HLA-DR. Sono stati identificati due sottogruppi di macrofagi. Oltre a identificare nuovi fenotipi cellulari, questo protocollo consente di utilizzare popolazioni cellulari purificate per analisi future, come la metilazione del DNA, le modifiche post-traduzionali e le vie di segnalazione.