Name: Individuazione precoce di fioriture cianobatteriche e cianotossine associate utilizzando la strategia di rilevamento rapido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri una strategia rapida per l'individuazione precoce di fioriture cianobatteriche e cianotossine utilizzando telerilevamento, droni e analisi LCMS. Questo metodo integrato supporta il monitoraggio ambientale e la tutela della salute pubblica.

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La ricerca è stata finanziata dal "Centro di Riferimento Regionale per la Sicurezza Sanitaria del Pescato (CRiSSaP)" nell'ambito del progetto "Attività pilota di Monitoraggio di Cianobatteri nella fascia costiera della regione Campania", ed eseguita in collaborazione con l'Agenzia per la Protezione Ambientale della Regione Campania, Italia (ARPAC), "Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno/Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare" (IZSM/ORSA), Università degli Studi di Napoli "Federico II" - Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzione Animale, prof.

1. Rilevamento remoto e prossimale: acquisizione e analisi dei dati
NOTA: In questo caso, i dati di rilevamento remoto/prossimale vengono utilizzati per una prima indagine macro-area e per selezionare punti specifici delle zone costiere da campionare. Nello schema MuM3 framework17 il flusso logico si basa su un modello di monitoraggio gerarchico che include diversi livelli denominati livelli informativi. Le informazioni di ogni livello si basano sui dati acquisiti utilizzando uno o più sensori trasportati su piattaforme di bordo situate a diverse altitudini. Ogni livello definisce una scala spaziale a seconda dell'altitudine della misurazione19. C'è il potenziale per più sensori a ogni livello. Alcuni esempi sono: visibile vicino all'infrarosso (VNIR) e all'infrarosso termico (TIR) imaging20 su satelliti, aerei, elicotteri, UAV21 e in superficie; analisi fisiche, chimiche e biologiche, ecc.22 in superficie e in risposta rapida utilizzando il laboratorio mobile. I dati acquisiti da ciascun sensore vengono elaborati e combinati per calcolare indici multispettrali (ad esempio, indice di vegetazione di differenza normalizzato (NDVI), indice di differenza d'acqua normalizzato (NDWI), indice di clorofilla, ecc.), quindi i dati grezzi vengono convertiti in parametri e formati più utili (ad esempio, mappa tematica).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3.jpg"> Figura 2: Analisi del rilevamento remoto/prossimale per il campionamento (fasi 1-2). Approccio multi-livello e multisensore per il rilevamento della fioritura cianobatterica. L'acquisizione dei dati viene effettuata via satellite (A), aereo (B) e /o drone (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Recupero dei dati di rilevamento remoto e prossimale
	<ol>
<li>Recuperare i dati dai vari set di dati di telerilevamento pubblici e privati, prodotti in particolare per il recupero basato sui contenuti e la classificazione delle scene. Le fonti di set di dati tipiche utilizzate in questo passaggio includono: prodotti Landsat forniti da U.S. Geological Survey23,prodotti Sentinel-2,3 forniti da NASA24e Copernicus Open Access Hub25,MODIS-Aqua26.</li>
		<li>Identificare i prodotti disponibili per l'area specifica, l'intervallo di date e considerare il limite derivato dalla copertura cloud. Definire: A) la regione di interesse utilizzando l'interfaccia utente grafica e la selezione poligonale; B) l'intervallo di date e la copertura cloud utilizzando i campi filtro query di testo. NOTA: Anche se molti rapporti scientifici citano che un valore di copertura nuvolosa accettabile è del &lt;20%, in questo tipo di ricerca, è importante prestare attenzione alla copertura nuvolosa reale solo sulla superficie dell'acqua, quindi un valore di efficacia per questa regione è del &lt;5%.</li>
		<li>Scegli i prodotti derivati dalle piattaforme più adatte alle esigenze specifiche della missione. Da ogni combinazione di specifiche tecniche satellitari e payload, è possibile ottenere diverse collezioni di prodotti. Ad esempio, i prodotti dati NASA EOSDIS24 vengono elaborati a vari livelli che vanno dal livello 0 al livello 4: i prodotti di livello 0 sono dati grezzi a piena risoluzione dello strumento mentre a livelli più alti i dati vengono convertiti in parametri e formati più utili. Di solito, i livelli 0-1 sono disponibili, mentre i prodotti nei livelli 2-4 necessitano di elaborazione specifica relativa a specifici obiettivi di ricerca, quindi la loro disponibilità è limitata nel tempo e la regione coperta.</li>
		<li>Scarica il set di dati scelto per le osservazioni satellitari. In dettaglio, selezionando tra l'elenco dei risultati dell'azione precedente, scarica un prodotto set di dati completo (ad esempio, un gruppo di file geo-tiff, uno per ogni banda, più informazioni e altri metadati) o solo una singola banda specifica. NOTA: Per la descrizione specifica di ogni azione di base inclusa nella procedura della fase 1, sirimanda anche a Huan-Huan Chen et al.</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-elaborazione ed elaborazione dei dati per l'analisi e la trasformazione in parametri e formati più utili per consentire un primo screening della macro-area. NOTA: Le seguenti azioni (passaggio 1.2) sono dedicate all'elaborazione dei dati finalizzata per trasformare i dati grezzi provenienti da livelli inferiori in informazioni e quindi in informazioni utili (livelli più alti). Questo passaggio consiste nell'elaborazione dei dati grezzi da ciascun sensore (ad esempio, livelli di prodotto 0-1) e nella trasformazione in prodotti di livello superiore (ad esempio, livelli 2-4) e, successivamente, in livelli informativi per generare parametri e formati più utili (ad esempio, mappa tematica).<ol>
<li>Pre-elaborare i dati grezzi che comportano la calibrazione geometrica e radiometrica. Questa azione potrebbe essere eseguita utilizzando software specifico che, in modo automatico o semiautomatico (non supervisionato o supervisionato), fornisce una serie di strumenti connessi per l'elaborazione raster al fine di eseguire una facile classificazione rispettando un flusso di lavoro corretto. NOTA: In questa ricerca vengono utilizzati due strumenti open source gratuiti: Q-GIS 3.1428 combinato con Semi-Automatic Classification Plugin (SCP). Il pluginSCP 29 consente la classificazione semiautomatica delle immagini di telerilevamento, fornendo un set completo di strumenti per il download di immagini gratuite, la pre-elaborazione, la post-elaborazione e il calcolo raster.</li>
		<li>Elaborare dati calibrati calcolando indici multispettrali. In genere, questa azione viene eseguita utilizzando uno strumento di calcolatrice raster. Il calcolo di un indice multispettrale definisce una correlazione tra diverse bande/livelli che di conseguenza genera un nuovo livello che potrebbe essere gestito su una piattaforma GIS. Ad esempio, a partire dal sensore di immagine del suolo operativo Sentinel e Landsat (OLI), è possibile calcolare indici multispettrali come l'indice NDVI (Normalized Difference Vegetation Index). L'indice di vegetazione viene quindi utilizzato per stimare il contenuto diclorofilla 30,31.</li>
		<li>Analizzare i risultati ottenuti dalla stima dell'indice di contenuto di clorofilla rappresentato come in mappe tematiche a falsi colori e definire l'area critica ad alta concentrazione di clorofilla. In questo studio, la clorofilla-una mappa viene generata utilizzando il set di dati del sensore MODIS32, montato su piattaforme satellitari Terra e Aqua. I punti di campionamento sono localizzati dove vengono registrati valori anomali. NOTA: La bandiera di fioritura delle alghe (che definisce ogni punto specifico) viene sollevata nel dominio del telerilevamento quando la concentrazione di Chl-a supera i 20 mg/L33.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Campionamenti guidati
NOTA: La scelta dei punti di campionamento è guidata dall'analisi dello strato di rilevamento remoto/prossimale che consente di selezionare punti in grandi aree costiere. Tenendo conto del fatto che il campionamento potrebbe essere pericoloso per gli operatori a causa della tossicità dei microcistina, sono necessarie procedure di campionamento di sicurezza. In particolare, è necessario proteggere gli operatori dall'inalazione di aerosol e dal contatto con la pelle. Quindi, eseguire il campionamento seguendo la procedura dettagliata di seguito.
<ol><li>Indossare occhiali per la protezione degli occhi, maschera FFP2 per prevenire l'inalazione di aerosol e guanti di sicurezza per prevenire il contatto con la pelle.</li>
	<li>Raccogli 0,5 L di acqua in triplice copia in ogni sito.</li>
	<li>Misurare la salinità per ogni campione utilizzando un rifrattametro. Mettere una goccia del campione sul rifrattametro e leggere il valore di salinità in termini di parti per mille (ppt - -).</li>
	<li>Al termine del campionamento, lavarsi prima le mani; quindi rimuovere a loro volta guanti, maschere e occhiali facendo attenzione a non toccare la superficie esterna dell'attrezzatura di protezione personale.</li>
	<li>Portare il campione in laboratorio a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Identificazione delle specie di cianobatteri mediante osservazioni microscopiche e identificazione tassonomica
<ol><li>Centrifugare ogni campione (≈0,5 L) a 11.200 x g per 5 min.</li>
	<li>Estrarre i supernaganti come segue: versare 500 mL di butanolo in ogni campione e utilizzando un imbuto, trasferire la miscela da estrarre nell'imbuto separatore. Posizionare l'imbuto separatore in posizione verticale nel morsetto dell'anello per consentire a entrambi gli strati di separarsi. Lasciare che la fase acquosa si scarichi in un pallone Erlenmeyer. Ripetere questo passaggio tre volte. Quindi, concentrare le fasi organiche sotto vuoto e pesarle.</li>
	<li>Raccogli i pellet dal passo 3.1 e analizzali con ingrandimento 400x e 1.000x con un microscopio ottico dotato di una fotocamera digitale da 18 MP per microscopio. Cerca la presenza di cianobatteri sulla base delle loro caratteristiche morfologiche: il colore blu-verde, la forma cellulare e le dimensioni consentono di riconoscere i cianobatteri tra gli altri microrganismi.</li>
	<li>Identificare la specie attraverso l'analisi tassonomica mediante osservazione microscopica, secondo laprocedura descritta in Komarék et al. NOTA: L'analisi metagenomica complementare 16S può essere eseguita al fine di identificare i taxacianobatterici 3.</li>
	<li>Diluire un'aliquota dei pellet con 10 mL di acqua di mare/acqua dolce BG11 media, secondo la sua salinità, per la coltivazione.</li>
</ol>4. Identificazione delle cianotossine
<ol><li>Estrazione di campioni con solventi organici<ol>
<li>Mettere ogni campione di pellet in un pallone e sonicare per 5 minuti utilizzando un bagno di ghiaccio. Quindi, aggiungere 50 mL di MeOH fresco e agitare delicatamente. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro di carta e raccogliere il filtrato in un pallone inferiore rotondo. Ripetere questo passaggio due volte. Quindi, estrarre i pellet aggiungendo una miscela di 50 mL di MeOH/DCM due volte (1:1, 50 mL) e due volte utilizzando 100% DCM (x2, 50 mL)35. Etichettare ogni pallone inferiore rotondo rispettivamente, come "estratto meOH", "estratto meOH/DCM" e "estratto DCM", e concentrarsi sotto vuoto.</li>
		<li>Analizzare ogni estratto organico (MeOH, MeOH/DCM, DCM) di LC-HRMS/MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi LC-HRMS/MS<ol>
<li>Preparazione campioni LC-HRMS e LC-HRMS/MS: sciogliere ogni campione utilizzando MeOH ≥ 99,9% per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL.</li>
		<li>Analizzare ogni campione utilizzando uno spettrometro di massa ESI ad alta risoluzione accoppiato con un sistema HPLC (sistema LC-HRMS/MS). Lavorare sull'HPLC con una colonna C18 da 5 μm (100 x 2,10 mm), a temperatura ambiente. Utilizzare un'eluizione gradiente con H2O (integrato con 0,1% HCOOH) e MeOHat 200 μL min-1. Il programma di gradiente è: 10% MeOH per 3 min, dal 10% al 100% MeOH per 30 min, 100% MeOH per 7 min. Usa MeOH come controllo.</li>
		<li>Acquisizione dati. Raccogliere dati in modalità di acquisizione dipendente dai dati (DDA): i 10 ioni più intensivi di uno spettro di massa a scansione completa devono essere sottoposti ad analisi della spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione (HRMS/MS). Acquisire scansioni HRMS/MS per ioni selezionati con frammentazione CID, una larghezza di isolamento di 2.0, energia di collisione normalizzata di 35, Attivazione Q di 0,250 e un tempo di attivazione di 30 ms.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi bioinformatiche e networking molecolare<ol>
<li>Analizza i modelli di frammentazione per ogni ione intenso utilizzando software specifico per MS.</li>
		<li>Utilizzare MS-Cluster per raggruppare i dati (tolleranza di massa padre di 1,0 Da e tolleranza di ione frammento MS/MS di 0,5 Da). Gli spettri di consenso contenenti meno di 2 spettri vengono eliminati.</li>
		<li>Analizzare i dati MS/MS per GNPS (Global Natural Products Social36) per la rete molecolare.</li>
		<li>Pairwise confronta gli spettri di consenso e anche quelli riportati nelle biblioteche GNPS-Mass-Ive.</li>
		<li>Visualizzare la rete ottenuta37. NOTA: Per la rete molecolare si rimanda aSigrist et al.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3.jpg"> Figura 3: Passaggi in laboratorio di FDS (3-4). Rappresentazione visiva delle principali attività svolte in laboratorio dopo il campionamento (fasi 3 e 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Singh, R. K., Tiwari, S. P., Rai, A. K., Mohapatra, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacteria%3A+an+emerging+source+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery.</a> Journal of Antibiotics. 64 (6), 401-412 (2011).</li>
<li>Huisman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+blooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (8), 471-483 (2018).</li>
<li>Gupta, N., Pant, S. C., Vijayaraghavan, R., Rao, P. V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+evaluation+of+cyanobacterial+cyclic+peptide+toxin+microcystin+variants+%28LR%2C+RR%2C+YR%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity evaluation of cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin variants (LR, RR, YR) in mice.</a> Toxicology. 188 (2-3), 285-296 (2003).</li>
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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Negli ultimi anni, il nostro team ha testato e convalidato diversi approcci che hanno permesso di svelare la presenza di cianobatteri e cianotossine nei corpi idrici e nei bivalvi. La nuova strategia sviluppata rappresenta il risultato di questi studi. Le tecniche e le tecnologie ottimali che si adattano all'ambito del rilevamento rapido, sono raccolte sotto il cappello di una procedura unica che massimizza l'efficacia di ogni singolo passaggio. L'area target, l'estensione della fioritura e la fase di crescita sono la forza trainante nella scelta di metodi e tecnologie adatti da utilizzare.
Quando il rilevamento rapido di cianobatteri e cianotossine è la priorità, la strategia è semplificata riducendo il numero totale a quattro fasi principali: (1) Rilevamento remoto e prossimale e analisi dei dati per una prima indagine, localizzazione dei siti e definizione del modello di fioritura e dell'estensione; (2) Campionamento guidato; (3) Osservazione microscopica e analisi tassonomica; (4) Analisi chimica e messa in rete molecolare dei dati LC-MS per la dereplicazione dei campioni d'acqua e il rapido rilevamento delle cianotossine.
Per quanto riguarda il primo passo, anche se la disponibilità dei dati acquisiti da una catena completa di piattaforme che coprono tutti i livelli di approccio di monitoraggio gerarchico sarebbe la soluzione migliore per restituire una visione completa dello scenario analizzato, spesso un solo livello informativo può guidare l'azione di area survey e concentrarsi efficacemente sugli hot spot per eseguire azioni di campionamento in situ. Secondo le esperienze riportate in cui i dati sono stati acquisiti utilizzando satelliti, aerei, elicotteri, UAV, la soluzione che corrisponde totalmente alle esigenze richieste dalla strategia di rilevamento rapido è l'uso degli unici prodotti satellitari.
Inoltre, gli strati informativi che derivano da missioni eseguite da piattaforme che volano a quote inferiori rispetto ai satelliti (ad esempio, aerei, elicotteri, UAV) restituiranno informazioni con grande risoluzione ma queste sono molto costose e richiedono anche più tempo per completare il processo di acquisizione completo che include anche la definizione e l'approvazione del piano di volo.
Una volta selezionati i punti da campionare (fase 2), le analisi analitiche/bioinformatiche (rete molecolare dei dati LC-MS) sono lo strumento per la deeplicazione rapida dei campioni d'acqua e il rapido rilevamento delle cianotossine (fasi 3 e 4). L'analisi metagenomica 16S richiede almeno 2 settimane di lavoro. Inoltre, anche quando vengono identificate specie cianobatteriche genericamente tossiche, la loro produzione di tossine non è dimostrata. Per lo stesso motivo, l'osservazione microscopica non è di per sé sufficiente a rivelare la presenza di cianobatteri tossici. Naturalmente, l'analisi degli STATI membri e la rete molecolare hanno alcune limitazioni; sono abbastanza efficaci se i composti di interesse (ad esempio, le tossine) sono ben ionizzati nelle condizioni applicate, se sono in quantità sufficiente per essere rilevati. Ai fini del noto rilevamento e monitoraggio delle tossine cianobatteriche, la rete molecolare basata su SM rappresenta in realtà una delle tecnologie più robuste e affidabili.
Pertanto, questo approccio si rivela abbastanza utile quando è necessario un rapido rilevamento di cianobatteri e cianotossine correlate; inoltre, la quantificazione sia della fioritura cianobatterica che della tossina nello spazio e nel tempo è possibile anche con questa strategia per prevenire i problemi delle comunità sanitarie che potrebbero sorgere da grandi fioriture tossiche cianobatteriche.

Le fioriture cianobatteriche sono emerse come un problema ambientale in tutto il mondo negli ultimi 15anni 1,2. Le fioriture cianobatteriche sono dovute alla crescita troppo di microrganismi chiamati cianobatteri. Sono un gruppo cospicuo di microrganismi fotosintetici che si sono adattati a vivere in una vasta gamma di ambienti, tra cui aree tropicali e acque estremamente fredde. Sono noti per la produzione di grandi fiori che coprono le superfici dell'acqua, specialmente in risposta a un massiccio arricchimento dei nutrienti, il cosiddetto processo di eutrofizzazione3.
Pertanto, i cianobatteri sono eccellenti bioindicatori dell'inquinamento delleacque 4,5,6. Possono anche produrre una vasta gamma di composti naturali con interessanti proprietà farmacologiche7,8. Il problema ambientale legato ai cianobatteri sono le fioriture stesse. Le fioriture possono bloccare la luce solare sulle erbe sottomarine, consumare ossigeno nell'acqua che porta alle uccisioni dei pesci, produrre feccia e odori superficiali e interferire con l'alimentazione del filtro degliorganismi 9.
Inoltre, e ancora più seriamente, in una specifica combinazione di fattori come temperatura, nutrienti (fosforo e azoto), luce solare (per la fotosintesi) e pH dell'acqua, le fioriture cianobatteriche innescano la produzione di tossine; pertanto, diventano dannosi per l'uomo e gli animali. La classe più studiata di cianotossine è prodotta dai generi Microcystis. Questi sono peptidi ciclici noti con il nome generale di microcistina (MC): la microcistina-LR è la più studiata in quanto in grado di produrre grave epatossicità10. Gli animali e l'uomo possono essere esposti alle HC per ingestione di acqua potabile o cibo contaminati. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha suggerito un valore totale di microcistina-LR di 0,001 mg/L come lineaguida 11. Tuttavia, questo è correlato solo a una variante (cioè MC-LR) su più di 100 microcistina che sono stati isolati finora.
I metodi combinati precedentemente riportati, come il telerilevamento con l'analisi MALDI-TOF MS12,13,14,15, si sono concentrati sul rilevamento della concentrazione delle MC. I metodi più recenti utilizzano sensori a bassa risoluzione che sono efficaci nel rilevare solo ampie distese di fioritura; sono anche in grado di rivelare solo tossine per le quali sono disponibili standard. Inoltre, la maggior parte di queste procedure richiede molto tempo e il tempo è un fattore drammatico per la diagnosi precoce della fioritura per prevenire o ridurre al minimo i problemi di sicurezza. La strategia multidisciplinare qui proposta fornisce un rapido rilevamento della fioritura dei cianobatteri e delle cianotossine, dopo soli 24 h16.
Nell'ambito del programma denominato MuM3, "Monitoraggio multidisciplinare, multi-scala e multi-parametrico nello spazio fisico tridimensionale (3D) "17,18, una strategia di rilevamento rapido (FDS) combina i vantaggi di diverse tecniche: 1) telerilevamento per rilevare la fioritura; 2) osservazione microscopica per rilevare le specie di cianobatteri; e 3) analisi analitiche/bioinformatiche, vale a dire reti molecolari basate su LC-HRMS, per rilevare le cianotossine. I risultati sono ottenuti entro 24 ore.
Il nuovo approccio è utile per monitorare ampie aree costiere in breve tempo, evitando numerosi campionamenti e analisi e riducendo i tempi e i costi di individuazione. Questa strategia è il risultato dello studio e dell'applicazione di diversi approcci al monitoraggio dei cianobatteri e delle loro tossine e combina i vantaggi di ciascuno di essi. Nello specifico, l'analisi dei risultati, provenienti dall'utilizzo di diverse piattaforme (satellitari, aerei, droni) e sensori (MODIS, infrarossi termici) per l'analisi del telerilevamento, come di diversi approcci metodologici per l'identificazione di specie cianobatteriche (microscopio, spettroscopia UV-Vis, analisi 16S) e tossine (analisi LC-MS, networking molecolare), ha permesso la selezione del metodo più appropriato sia per scopi specifici che generali. La nuova metodologia è stata sperimentata e convalidata nelle successive campagne di monitoraggio sulle coste campane (Italia), nell'ambito del programma di monitoraggio dell'agenzia per la protezione ambientale della Campania.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3.jpg"> Figura 1: Strategia per gli FDS. Una panoramica della strategia di rilevamento rapido per cianobatteri e cianotossine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10X Miscela</td><td></td><td></td> vitaminica <td>Acido nicotinico 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; Biotina 1 mg/100 mL; Tiamina 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; Acido folico 1 mg/100 mL; i-inositolo 1 mg/100 mL; Ca-pantotenato 100 mg/100 mL</td></tr><tr><td>1-BuOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33065.2.5L-R</td><td></td></tr><tr><td>BG11 soluzione</td><td></td><td></td> madre <td>Na2EDTA 20 mg/L; Citrato ferrico di ammonio 120 mg/L; Acido citrico&middot; 1H2O 120 mg/L; CaCl2&middot; 2H2O 700 mg/L, MgSO4&middot; 7H2O 1,5 g/L, K2HPO4&middot; 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4&middot; 6H2O (0,1 mM) 5 mL; Na2SeO4 (0,1 mM stock) 2 mL, Soluzione Nitsch 20 mL</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Hermle</td><td>Z36HK</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Honeywell</td><td>32211.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kinetex C18 cloumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa ESI ad alta risoluzione LTQ Orbitrap XL accoppiato a un sistema HPLC U3000</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Honeywell</td><td>32213.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio dotato di una fotocamera CMOS OMAX da 18 MP.</td><td>Optech</td><td>Biostar B3</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera multibanda</td><td>Intergraph DMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitsch's Solution</td><td></td><td></td><td>H3BO3 0,5 g/L MnSO4&middot; H2O 2,28 g/L ZnSO4&middot; 7H2O 0,5 g/L CuSO4&middot; 5H2O 0,025 g/L COCl2&middot; 6H2O 0,135 g/L Na2MoO4&middot; 2H2O 0,025 g/L</td></tr><tr><td>Rifrattomero mr 100 ATC</td><td>AQL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWBG11 medium</td><td></td><td></td><td>BG11 soluzione madre 50 mL/L; Oceano istantaneo 33 g/L; Acqua 950 mL/L 10X; Miscela vitaminica 100 &micro; L/L</td></tr></tbody></table>

individuazione precoce di fioriture cianobatteriche e cianotossine associate utilizzando la strategia di rilevamento rapido

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Il rilevamento rapido di cianobatteri e cianotossine si ottiene utilizzando una strategia di rilevamento rapido (FDS). Sono necessarie solo 24 ore per dipanare la presenza di cianobatteri e cianotossine correlate nei campioni d'acqua e in una matrice organica, come gli estratti bivalvi. FDS combina tecniche di telerilevamento/prossimità con analisi analitiche/bioinformatiche. I punti di campionamento vengono scelti attraverso il monitoraggio multidisciplinare, multi-scala e multi-parametrico in uno spazio fisico tridimensionale, incluso il telerilevamento. L'osservazione microscopica e l'analisi tassonomica dei campioni vengono eseguite in laboratorio, il che consente l'identificazione delle specie cianobatteriche. I campioni vengono quindi estratti con solventi organici ed elaborati con LC-MS/MS. Queste reti vengono analizzate per rilevare e identificare le tossine, confrontando i dati degli spettri di frammentazione ottenuti dalla spettrometria di massa con la libreria GNPS. Ciò consente il rilevamento di tossine note e analoghi sconosciuti che appaiono correlati nella stessa rete molecolare.

In un primo studio3, quattro siti antropogenicamente influenzati lungo la costa campana in ITALIA SW sono stati osservati utilizzando il satellite Landsat 8 e aerei durante l'estate 2015. Il sensore di immagine terrestre operativo Landsat 8 (OLI) e la telecamera multispettrale dell'aeromobile hanno permesso di creare immagini Normalized Difference Water Index (NDWI) per le aree, quindi, per rivelare la presenza di comunità cianobatteriche. La composizione della comunità cianobatterica è stata determinata attraverso analisi spettrofotometriche per il rilevamento della ficocianina pigmentata cianobatterica (PC). Quindi, l'analisi metagenomica 16S complementare ha permesso di identificare i taxa cianobatterici. L'indicizzazione e la classificazione semplificata delle immagini multispettrali attraverso piattaforme satellitari/aeree in combinazione con analisi metagenomiche sono state efficaci nel rilevare la presenza di cianobatteri appartenenti a generi associati a forti condizioni eutrofiche (come Leptolyngbya sp., Pseudooscillatoria sp.), in una fase iniziale di fioritura.
In un secondo studio14, l'approccio FDS è stato testato durante la primavera / estate 2017. I dati satellitari sono stati utilizzati come unico livello di telerilevamento. Nel dettaglio, i dati acquisiti dal sensore MODIS (Image Spectroradiometer) MODerate, montati su piattaforme satellitari Terra e Aqua, hanno permesso la quantificazione della clorofilla-a (Chl-a) nei corpi idrici lungo le coste campane e hanno guidato la scelta di dieci punti di campionamento. I campioni sono stati elaborati in laboratorio mediante osservazione microscopica e identificazione tassonomica, quindi estratti con solventi organici. Gli estratti organici sono stati elaborati mediante analisi LC-MS-MS. I dati ottenuti da MS-MS sono stati analizzati utilizzando un approccio bioinformatico, utilizzando la piattaforma GNPS per creare una rete di molecole. La rete è stata analizzata per rilevare e identificare le tossine confrontando i dati degli spettri di frammentazione ottenuti dalla spettrometria di massa con la libreria GNPS. Ciò ha permesso di rilevare tossine note e analoghi sconosciuti che appariranno correlati nella stessa rete molecolare. In particolare, la lingbyatoxina A, una dermatotossine lipofila, è stata rilevata in tutti i campioni d'acqua e nei campioni di bivalvi; nell'ammasso molecolare Lyngbyatoxin A erano presenti anche nodi non correlati ad alcun composti noti della famiglia delle linfossine, suggerendo la presenza di analoghi sconosciuti della lididossina. Nei campioni non sono stati rilevati microcistin e altre tossine. Tutti i risultati sono stati ottenuti entro 24 ore-uomo.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3.jpg"> Figura 4: Risultati rappresentativi dell'FDS. Un esempio di applicazione della strategia FDS sulla costa campana (Italia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui viene descritta una strategia multidisciplinare rapida per la diagnosi precoce delle fioriture cianobatteriche e delle cianotossine associate. Consente il rilevamento di cianobatteri e cianotossine correlate in campioni d'acqua e in matrici organiche, come campioni bivalvi, in 24 ore.

Individuazione precoce di fioriture cianobatteriche e cianotossine associate utilizzando la strategia di rilevamento rapido

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

La strategia di rilevamento rapido consente la diagnosi precoce delle fioriture di cianobatteri e delle cianotossine correlate nei campioni d'acqua, sia in quella matrice organica, come i molluschi e altri prodotti ittici. Le fioriture di cianobatteri sono dovute alla crescita troppo dei cianobatteri, che possono vivere in qualsiasi tipo di ambiente. E sono emersi come un problema ambientale in tutto il mondo negli ultimi 15 anni.Poiché il numero di cianobatteri dannosi fiorisce è aumentato negli ultimi anni, la necessità di una diagnosi precoce, che è fondamentale per affrontare la fioritura e la diffusione tossica, è diventata più urgente. La nostra strategia di prima direzione combina la tecnologia tecnica di rilevamento remoto e prossimale con l'analisi chimica e bioinformatica di laboratorio in un unico flusso di lavoro integrato. L'intero processo è sicuro.Vengono adottate misure di sicurezza adeguate per prevenire l'inalazione di aerosol e il contatto con la pelle durante il campionamento e l'analisi di laboratorio. Per il recupero dei dati, individuare innanzitutto l'area di destinazione in una mappa del mondo globale e recuperare i dati da vari set di dati di telerilevamento pubblici e privati per la data di raccolta. Dopo il recupero, elaborare i dati non elaborati, calcolare gli indici multispettrali e classificare le informazioni risultanti.Quindi definire i siti di campionamento sulla mappa tematica generata. Per la raccolta dei campioni, trasportare l'attrezzatura nel sito di campionamento selezionato nel laboratorio mobile e pianificare il percorso di volo del drone per eseguire un sondaggio macro dell'area. Sul sito, utilizzare diversi droni dotati di diversi carichi utili per eseguire missioni di volo.E utilizzare il filmato acquisito dal drone per convalidare la presenza e l'estensione della fioritura e per identificare punti di campionamento precisi. Nel punto di campionamento identificato, indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati e raccogliere tre campioni di acqua da 500 millilitri da ciascun sito. Misurare diversi parametri ambientali come la temperatura dell'aria e dell'acqua e il pH e la salinità del sito.Quindi conservare i campioni raccolti nel laboratorio mobile per il trasporto al laboratorio universitario. Preparare diapositive e schermare i campioni con il microscopio da laboratorio mobile dotato di una fotocamera digitale per consentire l'analisi tassonomica microscopica e l'identificazione delle specie presenti all'interno dei campioni in base al colore blu-verde, alla forma cellulare e alle dimensioni dei pellet. Una volta identificate le specie di cianobatteri raccolti all'interno dei campioni, presso il laboratorio universitario, centrifugare i campioni e trasferire ogni supernatante in un nuovo contenitore senza disturbare il pellet del campione.Aggiungere 500 millilitri di butanolo a ciascun supernatante campione e trasferire ogni soluzione da estrarre in un imbuto separatore. Dopo aver scosso e posizionato gli imbuti in posizione verticale nei singoli morsetti ad anello, lasciare che le fasi acquose si scarichino nei singoli contenitori Erlenmeyer. Dopo aver ripetuto la separazione dello strato tre volte, concentrare le fasi organiche sotto vuoto e pesarle.Per l'estrazione del campione con solventi organici, aggiungere 50 millilitri di metanolo fresco a ciascun pellet di campione e sonicare i campioni in un bagno di ghiaccio. Dopo cinque minuti, aggiungere 50 millilitri di metanolo fresco a ciascun campione e agitare delicatamente il pallone prima di filtrare le soluzioni attraverso singoli pezzi di carta da filtro e raccogliere i filtrati in contenitori inferiori rotondi. Dopo aver filtrato ogni campione altre due volte, come appena dimostrato, analizzare gli estratti del campione mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione secondo protocolli standard.Quindi generare una rete molecolare utilizzando la piattaforma sociale globale del prodotto naturale e utilizzare gli strumenti appropriati per analizzare la rete risultante e i dati della spettrometria di massa tandem per identificare eventuali tossine determinate per essere presenti all'interno dei campioni raccolti. La strategia proposta è stata convalidata dai risultati ottenuti nel programma di monitoraggio costiero, attivo sulla regione Campania nel Sud Italia dal 2015 al 2021. È stato generato un flusso di lavoro visivo che collega le tecniche ai risultati prodotti.Durante le successive campagne di monitoraggio, ogni fase è stata ottimizzata con l'obiettivo di un rilevamento rapido. L'ottimizzazione del flusso di lavoro di telerilevamento ha permesso una riduzione del numero di piattaforme e missioni migliorando al contempo il livello di prodotto generato. Ad esempio, questa strategia di rilevamento rapido facilita la transizione dall'uso di diverse piattaforme aeree solo a piattaforme satellitari e drone.E dall'uso di diversi indici specializzati multispettrali alle più informative mappe tematiche dell'indice di vegetazione della clorofilla a e della differenza normalizzata. In parallelo, il flusso di lavoro è stato ridotto dalla richiesta di un'analisi metogenomica 16 S all'uso dell'osservazione microscopica solo per determinare la comunità cianobatterica. E il nuovo flusso di lavoro chimico utilizza reti molecolari basate su LCMS per un rilevamento rapido e accurato delle cianotossine.Questa strategia consente lo studio dei cianobatteri come bioindicatore dell'inquinamento, in particolare all'interno di aree in cui la presenza della fioritura è correlata a processi di eutrofizzazione e utilizzata dalla pressione antropogenica. Questa strategia multidisciplinare richiede l'integrazione combinata di diverse tecniche, tecnologie e competenze in un flusso di lavoro unico per la sua implementazione di successo. La strategia di rilevamento rapido è utile per prevenire i problemi della comunità sanitaria dovuti alle fioriture nocive dei cianobatteri e per monitorare ampie aree in breve tempo.

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