Name: Misurazione del potenziale dazione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri la misurazione del potenziale d'azione ottico in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo semplificato offre alta produttività per studi elettrofisiologici e screening di tossicità.

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Gli autori desiderano ringraziare Cairn Research Ltd. per il loro gentile contributo finanziario che ha coperto i costi di produzione di questa pubblicazione. Inoltre, ringraziamo la signora Ines Mueller e la signora Stefanie Kestel per il loro eccellente supporto tecnico.
La ricerca degli autori è sostenuta dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania - EXC 2067/1- 390729940) e dalla Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

1. Preparati cellulari
NOTA: Le iPSC umane utilizzate in questo protocollo sono state derivate da donatori sani e differenziate in monostrati utilizzando la modulazione di piccole molecole completamente definita delle tecniche di segnalazione WNT e di purificazione del lattato come precedentemente descritto12,13,14. I CM iPSC sono stati mantenuti ogni 2-3 giorni con un terreno di coltura descritto di seguito.
<ol><li>Preparare un terreno di coltura di mezzo basale (RPMI 1640) e un supplemento al 2% (B27). Conservare a 4 °C. Utilizzare a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparare un mezzo di placcatura di mezzo basale (RPMI 1640), supplemento al 2% (B27) e inibitore ROCK 1:2000. Conservare a 4 °C. Utilizzare in RT.</li>
	<li>Coperchi in vetro rotondo #0 da 10 mm sterilizzati con 150 μL di matrice di membrana basale libera da 1:60 fattori e incubare a 4 °C per 4 ore. NOTA: l'ottimizzazione del volume del coverslip è necessaria per garantire che l'intero vetro sia coperto mantenendo un'adeguata tensione superficiale per evitare fuoriuscite. 150 μL è consigliato per coperture rotonde da 10 mm. Le dimensioni del lotto, il tipo di coverslip, il volume del coverslip e il tipo di piastra di coltura possono essere adatti alle esigenze degli sperimentatori.</li>
	<li>Iniziare la dissociazione iPSC-CM con un reagente di dissociazione cellulare basato su EDTA. Assicurarsi che il monostrato sia completamente staccato lavando delicatamente con una pipetta da 1.000 μL.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere un mezzo di placcatura a doppio volume. Centrifuga per 10 min a 100 x g.</li>
	<li>Risuspenare il pellet con un volume desiderato (volume di risuspensione) del mezzo di placcatura. Contare le celle manualmente o elettronicamente.</li>
	<li>Selezionare la densità ottimale per coverslip (15.000) che consentirà l'analisi cellulare isolata in un secondo momento.</li>
	<li>Calcola il volume di sospensione cellulare "attiva" (A) necessaria per placcare tutti i coverslip a questa densità desiderata. Applicare la seguente formula e prelevare in un tubo separato: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ01v2.jpg">
</li>
	<li>Calcolare il volume di mezzo di placcatura supplementare (B) necessario per accogliere ogni coverslip al volume desiderato. Applicare la seguente formula e aggiungere il volume risultante al tubo di sospensione attiva: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ02v2.jpg">
</li>
	<li>Rimuovere la matrice dai coverslip e applicare il "volume coverslip" della sospensione cellulare (A + B) su ciascun coverslip. Riaspensare regolarmente nel tubo per garantire una distribuzione cellulare uniforme.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 1 ora. Riempire delicatamente il pozzo con il mezzo di placcatura.</li>
	<li>Dopo 24 ore, scambiare i supporti con il normale terreno di coltura e mantenere ogni 2-3 giorni.</li>
</ol>2. Configurazione sperimentale
<ol><li>Equipaggiare un microscopio a epifluorescenza invertita con un ingrandimento 40x, una lente ad alta apertura numerica (N.A: &gt; 0,75) per condurre esperimenti.</li>
	<li>Accoppiare un LED bianco caldo a commutazione rapida alla porta di illuminazione trasmessa del microscopio. Inserire un semplice filtro rosso a 660 nm nel percorso della luce trasmessa. NOTA: Questa luce può essere attivata durante gli esperimenti di fotometria per osservare il campione senza contaminare il segnale fluorescente verde.</li>
	<li>Montare una testina LED a commutazione rapida da 470 nm per la registrazione fotometrica. Inserire un filtro di eccitazione 470/40 sulla porta epifluorescente del microscopio per ripulire la luce generata dal LED. NOTA: per una quantificazione ottimale del segnale si consiglia un sistema di illuminazione con controllo del feedback ad alta velocità dell'uscita ottica.</li>
	<li>Inserire un cubo di microscopio contenente uno splitter a fascio passante lungo 495 nm nel carosello dell'unità a specchio all'interno del microscopio.</li>
	<li>Montare un braccio di rilevamento contenente un diaframma a campo regolabile sulla porta C-mount del microscopio per consentire la selezione della regione di interesse.</li>
	<li>Accoppiare separatamente un rilevatore di fotomoltiplicatori (PMT) e una fotocamera USB al microscopio. Questo sarà la base del sistema di rilevamento delle emissioni.</li>
	<li>Inserire un cubo filtrante contenente uno splitter a fascio passante lungo 565 nm e un filtro di emissione 535/50 nella porta PMT. Questo divide la luce di emissione tra i due rivelatori. NOTA: una telecamera collegata alla porta trasmessa del sistema di rilevamento delle emissioni è in grado di rilevare la luce trasmessa sotto il campo luminoso durante tutti gli esperimenti.</li>
	<li>Accoppiare il PMT a un alimentatore e a un amplificatore PMT. Collegare l'uscita dell'amplificatore PMT a un pin di ingresso analogico di un sistema di acquisizione dati.</li>
	<li>Filtrare i dati analogici dal PMT a 1 kHz o superiore.</li>
	<li>Digitalizzare i dati a una frequenza almeno doppia rispetto alla frequenza più alta presente nel segnale analogico (2 kHz o superiore) per soddisfare i criteri di Nyquist e prevenire l'aliasing.</li>
</ol>3. Caricamento cellulare con VF2.1Cl
NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono questo colorante devono essere eseguite in condizioni di scarsa illuminazione.
<ol><li>Preparare una soluzione da bagno di Tyrode di (in mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glucosio, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 e caldo a 37 °C.</li>
	<li>Preparare un'aliquota della soluzione di carico in un tubo di microcentrifuga mescolando 5 μL di 1.000x VF2.1Cl e 50 μL di soluzione di poloxamer solubilizzante al 20%.</li>
	<li>Applicare 5 μL della soluzione di carico a 5 mL di soluzione di Tyrode riscaldata (concentrazione totale di colorante 0,1x) in una capsula di Petri da 20 mm. NOTA: la concentrazione finale del colorante è 0,1x. Questo è 1/10di quello suggerito dal produttore. Ciò preserva le risorse, garantisce una citotossicità trascurabile e, soprattutto, conserva ancora chiari segnali ottici da cellule caricate con elevati rapporti segnale/rumore.</li>
	<li>Aggiungere un singolo coperchio iPSC-CM al piatto e incubare a 37 °C per 20 minuti.</li>
	<li>Assemblare una camera di imaging a cellule vive riscaldata. Montare sullo stadio del microscopio e riempire con 500 μL di soluzione di Tyrode fresca.</li>
	<li>Lavare il coperchio con la soluzione fresca di Tyrode a 37 °C.</li>
	<li>Applicare con attenzione il coverslip iPSC-CM sulla camera da bagno preriscaldata utilizzando una pinna a punto fine. NOTA: Assicurarsi che la camera e il suo contenuto siano sempre riscaldati a temperature fisiologiche. Se lo si desidera, iniziare con una perfusione continua della soluzione di Tyrode riscaldata.</li>
</ol>4. Stimolazione elettrica del campo
NOTA: L'attivazione esterna di iPSC-CM è facoltativa ma utile per la standardizzazione della dinamica cellulare e dei parametri sperimentali. Aumenta la facilità di analisi e consente l'indagine degli effetti dipendenti dalla frequenza.
<ol><li>Collegare un inserto di stimolazione con due elettrodi di platino distanziati di 5 mm nella camera di registrazione.</li>
	<li>Collegare uno stimolatore esterno all'inserto di stimolazione. Impostare su impulsi di campo bipolare da 5 ms a 0,5 Hz.</li>
	<li>Determinare la tensione di stimolazione ottimale aumentando lo stimolo da 1 V in su. Lo stimolo di soglia è definito come la tensione più bassa alla quale le cellule iniziano a contrarsi. Applicare tensioni di circa il 25% al di sopra di questa soglia. L'intervallo normale è compreso tra 1 V e 30 V.</li>
	<li>Fissa la frequenza di stimolazione con lo stimolatore esterno o attivala con un software di acquisizione.</li>
</ol>5. Acquisizione del potenziale d'azione ottico
NOTA: questo protocollo utilizza un software commerciale per l'acquisizione e l'analisi.
<ol><li>Visualizza i miociti in vista a campo luminoso utilizzando il percorso della luce trasmessa e la telecamera USB.</li>
	<li>Selezionare una cella isolata e ritagliare strettamente il suo percorso ottico con il diaframma di campo assicurando che venga monitorata solo la luce proveniente dalla cella di interesse.</li>
	<li>Attivare l'amplificatore PMT e impostare l'alimentazione PMT su 750 V.</li>
	<li>Eseguire il protocollo di stimolazione (vedere il passaggio 4) insieme al software di acquisizione e contemporaneamente attivare la luce di eccitazione a 470 nm. Quest'ultimo può essere fatto tramite un pannello remoto o automatizzato ad un'intensità fissa (segnale TTL).</li>
	<li>Regolare il guadagno e l'offset dell'amplificatore PMT per assicurarsi che il segnale non si saturi e sia ottimizzato per il raggio di rilevamento del sistema di registrazione.</li>
	<li>Registra 10 sweep assicurando che vengano rilevati potenziali d'azione stabili.</li>
	<li>Continuare a registrare e spostare immediatamente lo stadio del microscopio per acquisire brevemente il segnale di fondo da una regione priva di cellule. Spegnere la spia di eccitazione. NOTA: questo valore di sfondo(offset F) verrà utilizzato per tenere conto di qualsiasi fluorescenza di fondo.</li>
	<li>Se lo si desidera, perfondere localmente farmaci di riferimento come la nifedipina da 1 μM per identificare le risposte cellulari alla manipolazione farmacologica.</li>
	<li>In modo sequenziale, ripetere i passaggi da 5.2 a 5.7, ogni volta selezionando una nuova cella. Sostituire le coverslip se lo si desidera per garantire un elevato turnover sperimentale in una singola seduta. NOTA: i protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini sono descritti nella Figura 2.</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Apri una registrazione salvata con il software di analisi e in media 10 sweep contenenti potenziali d'azione stimolati da una singola cella.</li>
	<li>Prendi una media del segnale di base che rappresental'offset F e sottrai questo dalla traccia mediata.</li>
	<li>Calcola ∆F/F0 con la seguente formula (dove F è misurata la fluorescenza e F0 è la fluorescenza diastolica): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61890/61890equ03v2.jpg">
</li>
	<li>Identificare la traccia basale (diastolica) e l'area di interesse (AP) e misurare i parametri del potenziale d'azione cardiaco desiderati. Ciò include, ma non è limitato al tempo di decadimento per la ripolarizzazione del 50% (APD50)e del 90% (APD90).</li>
	<li>Esporta i dati da questa singola cella a un software per fogli di calcolo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.1 – 6.5 per tutte le registrazioni. Valutare i risultati con appropriati test non accoppiati o analisi della varianza.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2.jpg"> Figura 2: Protocolli di caricamento e acquisizione delle immagini. (A) Diagramma di flusso del protocollo di carico VF2.1Cl completo per iPSC-CM e cardiomiociti nativi. (B) Schema semplificato di beam splitter (BS) e configurazioni di filtri utilizzati in questo protocollo per l'eccitazione e il rilevamento dell'emissione di VF2.1Cl in risposta alle variazioni della tensione transmembrana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig2v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514(2008).</li>
<li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution%2C+contraction%2C+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).</li>
<li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2%2C3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li>
<li>Képiró, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
</ol>

Cairn Research Ltd ha supportato questa pubblicazione coprendo i costi di produzione del file video.

Qui descriviamo un protocollo di base per acquisire facilmente profili AP dettagliati da iPSC-CM isolati adatti per la modellazione elettrofisiologica e lo screening di farmaci cardiaci. Rileviamo AP regolari e robusti dai nostri iPSC-CM scarsamente seminati, il che suggerisce sia la funzionalità dell'indicatore che la fedeltà metodologica.
A causa dell'ampio spettro di metodologie commerciali per la riprogrammazione iPSC e della mancanza di standardizzazione per i protocolli di differenziazio...

La modellazione elettrofisiologica dei cardiomiociti e la costruzione di piattaforme efficienti per lo screening dei farmaci cardiaci è essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per una varietà di disturbi aritmici. La rapida espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha prodotto promettenti incursioni nella modellizzazione delle malattie umane e nell'indagine farmacologica utilizzando cardiomiociti derivati da pazienti isolati (iPSC-CM). Le tecniche "Gold standard" per la caratterizzazione elettrofisiologica di queste cellule attraverso patch-clamp (current-clamp) possono quantificare la morfologia e la durata del potenziale d'azione (AP), tuttavia, questo metodo è incredibilmente complesso e lento e non adatto per l'acquisizione di dati ad alto rendimento1. IPSC-CM sono regolarmente segnalati per avere un aumento del potenziale di membrana diastolica e una maggiore corrente di dispersione rispetto ai cardiomiociti nativi adulti2. Si suggerisce che le dimensioni più piccole delle cellule e la ridotta capacità della membrana osservata nelle iPSC-CM possano produrre qualche errore sistematico quando si utilizza la tecnica del morsetto di corrente, forse spiegando queste deviazioni3. Al fine di massimizzare l'utilità di una piattaforma iPSC-CM, un metodo aggiuntivo è prezioso per aumentare la produttività e garantire l'accuratezza dei dati quando si caratterizzano le variazioni di tensione transmembrana a livello di singola cella in iPSC-CM.
I coloranti sensibili alla tensione (VSD) sono stati a lungo un metodo proposto per fornire un'analisi più rapida, non invasiva ed equivalente della cinetica AP cardiaca rispetto a quelle delle tecniche tradizionali4. Un recente studio ha dimostrato l'idoneità della fotometria della sonda sensibile alla tensione di tensione per quantificare con precisione l'AP5 cardiaco. Inoltre, la capacità di scalare prontamente gli approcci di fotometria ottica conferisce questa tecnica a schermi cardiotossicità su larga scala critici nello sviluppo di farmaci terapeutici (ad esempio, CiPA). Lo sviluppo di protocolli di cardiotossicità standardizzati in uno studio multi-sito in cieco utilizzando array di microelettrodi e tecniche ottiche di rilevamento della tensione ha dimostrato il valore chiave di questo approccio6.
Molti coloranti potenziometrici sono disponibili in commercio e lo sviluppo sintetico in corso di nuove sonde mostra un potenziale entusiasmante per semplificare la loro efficacia in una varietà di costrutti cardiaci e neurali. Il VSD ideale avrà una cinetica e una sensibilità aumentate, mentre mostra una diminuzione del carico capacitivo, del fotoscissicità e della citotossicità. Il VF2.1Cl (FluoVolt) recentemente sintetizzato esprime molte di queste proprietà benefiche in gran parte grazie alla sua nuova struttura molecolare a filo, condivisa da altri membri della nuova famiglia VoltageFluor (VF)7. In contrasto con i comuni VSD elettrocromici in cui semplici sonde si coniugano molecolarmente ed elettricamente alla membrana plasmatica, questo colorante è costituito da un filo sintetico inserito passivamente, che abbraccia la membrana che accoppia un donatore ricco di elettroni con un fluoroforo di fluoresceina modificato (FITC). I dettagli meccanicistici sono forniti nella Figura 1. Questo colorante dimostra un'eccellente sensibilità alle fluttuazioni di tensione della membrana, mostrando una variazione del 27% dell'intensità di emissione per 100 mV rispetto a ~ 10% osservata in altre sonde comuni a velocità comparabili7. Inoltre, i sistemi PeT a filo non interagiscono direttamente con il campo elettrico cellulare che produce interferenze elettriche minime e cambiamenti trascurabili nel carico capacitivo cellulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> Figura 1: Parametri chimici, spettrali e meccanicistici del colorante VF2.1Cl. (A) Struttura chimica di VF2.1Cl. Le caratteristiche molecolari da notare includono più gruppi alchilici all'interno del filo molecolare fenilene vinilene che facilitano l'inserimento nella membrana plasmatica. Un gruppo di acido solfonico caricato negativamente coniugato alla sonda FITC assicura la stabilizzazione del fluoroforo sulla superficie extracellulare e aiuta vicino all'inserzione perpendicolare rispetto al campo elettrico del doppio strato lipidico. (B) Schema semplificato dell'incorporazione perpendicolare di VF2.1Cl nella membrana plasmatica di una cellula bersaglio. (C) Spettri di assorbimento ed emissione del colorante VF2.1Cl. Gli spettri sono identici a quello delle sonde FITC e GFP standard. (D) Rappresentazione del meccanismo d'azione di VF2.1Cl. In condizioni di riposo (iperpolarizzato), tensioni intracellulari negative guidano gli elettroni liberi verso il fluoroforo rostrale. L'abbondanza di elettroni assicura che il trasferimento di elettroni fotoindotto (PeT) sia favorito come via d'uscita dallo stato eccitato dopo l'eccitazione ottica, spegnendo efficacemente la fluorescenza. Al contrario, un potenziale di membrana depolarizzato influenza il movimento verso il basso degli elettroni favorendo la fluorescenza all'eccitazione ottica. La risposta fluorescente risultante è linearmente correlata alla tensione di membrana e può essere utilizzata con precisione per raccogliere informazioni temporali dettagliate sulla cinetica elettrofisiologica cellulare. (E) Immagini rappresentative a campo luminoso (superiore) e fluorescenza a 470 nm (inferiore) di cardiomiociti leporina caricati con pila VF2.1Cl. (F) Z di un singolo cardiomiocita caricato. Le frecce indicano aree di chiara localizzazione di VF2.1Cl alla membrana cellulare. Le immagini sono state acquisite con un sistema confocale a disco rotante costituito da una testa confocale a disco rotante X-lightv3 con un modello stenopeico da 50 μm; Illuminatore LDI-7; Fotocamera Prime95B e obiettivo PlanApo Lambda 100x. Barra della scala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La sonda FITC coniugata a VF2.1Cl assicura che possa essere utilizzata efficacemente nelle configurazioni standard e dei filtri GFP e richiede solo un sistema di acquisizione a canale singolo, entrambe caratteristiche comuni delle piattaforme di imaging fluorescenti. Analisi di monostrati iPSC-CM umani densi con questo colorante è stata recentemente riportata8,9,10,11. Il nostro protocollo differisce da questi studi a causa della nostra indagine su singoli iPSC-CM isolati, imperturbabili dalle influenze elettriche e paracrine di densi monostrati sinciziali e dal nostro uso di un sistema di fotometria economico e personalizzabile rispetto a complesse disposizioni di imaging confocale o ad ampio campo.
Qui, descriviamo il nostro protocollo per l'acquisizione rapida e l'analisi di robusti AP ottici da cardiomiociti umani isolati derivati da iPSC e cardiomiociti nativi (vedi File supplementare). Utilizziamo VF2.1Cl abbinato a una piattaforma all'avanguardia personalizzabile per misure fotometriche a cella singola. Questi protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico del Centro medico universitario di Gottinga (n. 10/9/15).

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth</td><td>HN04.2</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio anidro&nbsp; BioChemica</td><td>ITW Reagenti</td><td>A1422</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kit potenziale a membrana FluoVolt</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>F10488</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN77.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Lamanin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114956-81-9</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21829-25-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK Y27632</td><td>Stemolecola</td><td>04-0012-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>61870010</tr><tr><td>Versene EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15040033</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>495LP Dicroic Beamsplitter&nbsp;</td><td>Amplificatore Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti Circle, Spessore 0</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1550B</td><td>Molecular Devices Alimentatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual OptoLED&nbsp;</td><td>Ricerca su Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione ET470/40x&nbsp;</td><td>Tecnologia</td><td></td><td></td>Chroma</tr><tr><td>ET535/50M</td><td>Tecnologia Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro Neubauer inciso</td><td>Hausser Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubi filtranti&nbsp;</td><td>Ricerca su Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX73 Microscopio invertito&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MonoLED Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatori multiporta&nbsp;</td><td>Ricerca su Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore cellulare Myopacer&nbsp;</td><td>Otturatore IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optomask&nbsp;</td><td>Ricerca su Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controller di sistema Optoscan</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma a temperatura controllata PH-1 &nbsp;</td><td>Strumenti Warner&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rivelatore fotomoltiplicatore&nbsp;</td><td>Ricerca su Cairn&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto amplificatore PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto di alimentazione PMT</td><td>Cairn Research&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera da bagno aperta RC-26G&nbsp;</td><td>Strumenti Warner&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatore da palco SA-OLY/2AL&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T565LPXR Beamsplitter dicroico</td><td>Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T660LPXR Beamsplitter dicroico</td> Regolatore di temperatura a doppio <td>canale Chroma Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-20</td><td>npi Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLFLN 40X Obiettivo</td><td>Olimpo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telecamera USB 3.0 a colori&nbsp;</td>Fonte <td></td><td></td><td>di imaging</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex 11.1</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampfit 11.1</td><td>Dispositivi molecolari&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cattura IC 2.4&nbsp;</td><td>Fonte di imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma 8</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Le tecniche convenzionali di microelettrodi intracellulari per quantificare l'elettrofisiologia dei cardiomiociti sono estremamente complesse, ad alta intensità di lavoro e tipicamente eseguite a bassa produttività. La rapida e continua espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) presenta un nuovo standard nella ricerca cardiovascolare e sono ora necessari metodi alternativi per aumentare la produttività dei dati elettrofisiologici a livello di singola cellula. VF2.1Cl è un colorante sensibile alla tensione di recente derivazione che fornisce una rapida risposta a canale singolo e di alta grandezza alle fluttuazioni del potenziale di membrana. Possiede una cinetica superiore a quella di altri indicatori di tensione esistenti e rende disponibili dati funzionali equivalenti a quelli delle tecniche tradizionali di microelettrodo. Qui, dimostriamo la caratterizzazione semplificata e non invasiva del potenziale d'azione nei cardiomiociti umani derivati da iPSC a ritmo esterno utilizzando un sistema di fotometria modulare e altamente conveniente.

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> Figura 3: Profili del potenziale d'azione ottico (AP) di cardiomiociti nativi isolati e cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CM). (A) AP ottico rappresentativo di un singolo cardiomiocita murino (al centro) con SEM ± media di APD50 e APD90 (n = 7, destra). (B) AP ottico rappresentativo di u...

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Questo protocollo è in grado di fornire misurazioni ad alto rendimento dell'elettrofisiologia cellulare in un modo che si addice alla tecnologia in rapido sviluppo dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è meno complessa e meno laboriosa rispetto alla tradizionale tecnica di patch clamp, ma è in grado di produrre risultati equivalenti. Quindi questo protocollo può essere ampliato per programmi di screening della tossicità su larga scala utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.Ad esempio, il test completo di proaritmia in vitro. Per preparare colture di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per l'esperimento, rivestire prima i singoli vetrini di vetro rotondo numero zero da 10 millimetri con 150 microlitri di matrice di membrana basale 1:60 all'interno di ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e incubare i vetrini di copertura a quattro gradi Celsius per quattro ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere la matrice in eccesso dai vetrini coprioggetti e applicare il volume appropriato di cellule su ciascun vetrino coprioggetti.Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, riempire accuratamente ogni pozzetto con il mezzo di placcatura e rimettere la piastra nell'incubatore. Per prepararsi all'imaging a colorante sensibile alla tensione, equipaggiare un microscopio a epifluorescenza invertito con una lente ad alta apertura numerica con ingrandimento 40x e accoppiare un LED bianco caldo a commutazione rapida alla porta di illuminazione trasmessa. Inserire un semplice filtro rosso da 660 nanometri nel percorso della luce trasmessa e montare una testa LED a commutazione rapida da 470 nanometri per la registrazione fotometrica.Inserire un filtro di eccitazione 470/40 sulla porta di epifluorescenza per ripulire la luce generata dal LED e inserire un cubo da microscopio contenente un divisore di fascio a passaggio lungo da 495 nanometri nel carosello dell'unità specchio all'interno del microscopio. Montare un braccio di rilevamento contenente un diaframma di campo regolabile sulla porta dell'innesto C per consentire la selezione della regione di interesse e accoppiare un rivelatore PMT e una fotocamera USB al microscopio. Inserire un cubo filtrante contenente un divisore di fascio passante lungo 565 nanometri e un filtro di emissione 535/50 nella porta PMT per dividere la luce di emissione tra i due rivelatori.Accoppiare il PMT a un alimentatore e a un amplificatore PMT e collegare l'uscita dell'amplificatore PMT a un pin di ingresso analogico di un sistema di acquisizione dati. Per soddisfare i criteri di Nyquist e prevenire l'aliasing, filtrare i dati analogici dal PMT a un kilohertz o superiore e digitalizzare i dati a una frequenza che sia almeno il doppio di quella della frequenza più alta presente nel segnale analogico. Per caricare le celle con colorante sensibile alla tensione, mescolare cinque microlitri di FluoVolt 1000x e 50 microlitri di soluzione di carico di potenza e aggiungere tre microlitri della soluzione di carico risultante a tre millilitri di soluzione di Tyrode riscaldata in una capsula di Petri.Aggiungere un singolo vetrino coprioggetto rivestito di cellule staminali pluripotenti indotte derivate da cardiomiociti al piatto e posizionare il piatto a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Montate una camera di imaging di cellule vive riscaldata sul tavolino del microscopio e riempite la camera con 500 microlitri di soluzione fresca di Tyrode. Quindi lavare il vetrino coprioggetti con una soluzione fresca di Tyrode a 37 gradi Celsius e utilizzare una pinza a punta fine per trasferire con cura il vetrino coprioggetti nella camera del bagno preriscaldata.Per standardizzare la dinamica cellulare e i parametri sperimentali, inserire due elettrodi di platino nella camera, distanziati di cinque millimetri l'uno dall'altro, e collegare gli elettrodi a uno stimolatore esterno. Impostare lo stimolatore su impulsi di campo bipolare di cinque millisecondi a 0,5 hertz e aumentare lo stimolo da un volt fino a quando le cellule iniziano a contrarsi. Quindi impostare la tensione a circa il 25% al di sopra di questa soglia.Per l'acquisizione del potenziale d'azione ottico, utilizzare il percorso della luce trasmessa e la fotocamera USB per visualizzare i miociti in condizioni di campo chiaro. Selezionare una cella isolata e utilizzare il diaframma di campo per ritagliare strettamente il suo percorso ottico, assicurandosi che venga monitorata solo la luce proveniente dalla cella di interesse. Attivare l'amplificatore PMT e impostare l'alimentazione PMT a 750 volt.Esegui il protocollo di stimolazione insieme al software di acquisizione attivando contemporaneamente la luce di eccitazione a 470 nanometri. Registra 10 scansioni, assicurandoti che vengano rilevati potenziali d'azione stabili. Dopo l'ultima scansione, spostare immediatamente il tavolino del microscopio mentre si sta ancora registrando per acquisire brevemente il segnale di fondo da una regione priva di cellule e spegnere la luce di eccitazione.Per analizzare i dati sul potenziale d'azione, aprire una registrazione salvata nel software di analisi appropriato e calcolare la media di 10 sweep contenenti potenziali d'azione stimolati da una singola cella. Sottrarre la media del segnale di base che rappresenta l'offset di fluorescenza dalla traccia media, quindi utilizzare la formula per calcolare la variazione della fluorescenza utilizzando la fluorescenza diastolica come F0. Identificare le aree diastoliche e del potenziale d'azione di interesse e misurare i parametri del potenziale d'azione cardiaco desiderati, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la durata al 50% e al 90% di ripolarizzazione. Quindi esporta i dati da questa singola cella in un programma per fogli di calcolo.Questo metodo consente una quantificazione rapida e precisa della meccanica di ripolarizzazione, che può fornire preziose informazioni sulle anomalie ioniche cellulari. Caratteristiche pronunciate della fase uno possono essere osservate nei segnali ottici dei cardiomiociti murini, che sono morfologicamente distinti da quelli dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Inoltre, i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane rispondono alla manipolazione farmacologica con nifedipina, un noto antagonista dei canali del calcio di tipo L.Durante l'applicazione continua del farmaco, è stata osservata una diminuzione del 41,5% della durata del potenziale d'azione al 90% di ripolarizzazione, suggerendo la funzionalità dell'imaging basato su indicatori di tensione fluorescente come piattaforma per studi prospettici di screening cardiaco di farmaci ad alto rendimento. È importante tenere presente che, sebbene il colorante sensibile alla tensione utilizzato in questo studio sia meno citotossico di altri, la luce di eccitazione dovrebbe comunque essere usata con parsimonia per conservare la vitalità cellulare. L'apparecchiatura di fotometria modulatoria utilizzata in questo protocollo è incredibilmente versatile.Ad esempio, può essere utilizzato per misurazioni simultanee di altri parametri elettrofisiologici, come il calcio intracellulare.

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La caratterizzazione elettrofisiologica dei cardiomiociti derivata da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CM) è fondamentale per la modellizzazione delle malattie cardiache e per la determinazione delle risposte di farmaco. Questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per dissociare e piastrare hPSC-CM su matrici multi-elettrodi, misurare il loro potenziale di campo e un metodo per analizzare gli intervalli QT e RR.

Analisi elettrofisiologica dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs) Utilizzando matrici multi-elettrodo (MEAs)

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Questo articolo contiene una serie di protocolli per lo sviluppo di reti di cardiomiociti derivate da cellule staminali derivate da cellule staminali derivate dall'uomo (hiPSC-CM) coltivate su piastre MEA multiwell per elettropolarmente la membrana cellulare per misurazioni potenziali di azione. Le registrazioni ad alta velocità vengono ottenute ripetutamente dagli stessi siti cellulari nel corso di giorni.

Reti di cardiomiociti derivati da umani da iPSC su array di microelettrodi multiwell per registrazioni di potenziali azioni ricorrenti

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM.

Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

La combinazione di porzioni laser e array di microelettrodi (MEA) consente registrazioni simili a potenziali d'azione di cardiomiociti primari e derivati da cellule staminali coltivati. La forma d'onda fornisce una visione superiore della modalità d'azione dei composti di prova rispetto alle registrazioni standard. Collega patch-clamp e lettura MEA per ottimizzare ulteriormente la ricerca sulla sicurezza cardio in futuro.

Misurazioni simili al potenziale d'azione indotte dal laser di cardiomiociti su array di microelettrodi per una maggiore predittività della farmacologia di sicurezza

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CM) offrono un'alternativa all'uso di animali per lo screening preclinico della cardiotossicità. Una limitazione all'adozione diffusa di hiPSC-CMs nello screening preclinico della tossicità è il fenotipo immaturo e fetale delle cellule. Qui sono presentati protocolli per la maturazione robusta e rapida delle hiPSC-CM.

Screening della cardiotossicità ad alto rendimento utilizzando monostrati di cardiomiociti pluripotenti indotti da cellule staminali umane mature

Qui, dimostriamo un metodo di valutazione della contrattilità dei dispositivi medici cardiaci non invasivi utilizzando monostrati 2D di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM), placcati su un substrato flessibile, accoppiati con microscopia basata su video. Questo strumento sarà utile per la valutazione in vitro delle proprietà contrattili dei dispositivi di elettrofisiologia cardiaca.

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Qui, viene descritto un metodo consolidato per eseguire misurazioni della contrattilità e del calcio in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando una piattaforma basata sull'ottica. Questa piattaforma consente ai ricercatori di studiare l'effetto delle mutazioni e la risposta a vari stimoli in modo rapido e riproducibile.

Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

L'uso della luce per controllare le cellule e i tessuti cardiaci consente la stimolazione senza contatto, preservando così lo stato naturale e la funzione delle cellule, rendendolo un approccio prezioso sia per la ricerca di base che per le applicazioni terapeutiche.

Un sistema microfisiologico cardiaco per lo studio della propagazione del Ca2+ tramite stimolazione ottica non genetica

Microscopia ottica con risoluzione fotoacustico (OR-PAM) è una tecnologia emergente in grado di assorbimento di imaging ottico...

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Scopri la misurazione del potenziale d'azione ottico in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo semplificato offre alta produttività per studi elettrofisiologici e screening di tossicità.

Misurazione del potenziale dazione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (Video) | JoVE Journal

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

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