Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo protocollo è in grado di fornire misurazioni ad alto rendimento dell'elettrofisiologia cellulare in un modo che si addice alla tecnologia in rapido sviluppo dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è meno complessa e meno laboriosa rispetto alla tradizionale tecnica di patch clamp, ma è in grado di produrre risultati equivalenti. Quindi questo protocollo può essere ampliato per programmi di screening della tossicità su larga scala utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Ad esempio, il test completo di proaritmia in vitro. Per preparare colture di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte per l'esperimento, rivestire prima i singoli vetrini di vetro rotondo numero zero da 10 millimetri con 150 microlitri di matrice di membrana basale 1:60 all'interno di ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e incubare i vetrini di copertura a quattro gradi Celsius per quattro ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere la matrice in eccesso dai vetrini coprioggetti e applicare il volume appropriato di cellule su ciascun vetrino coprioggetti.

Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, riempire accuratamente ogni pozzetto con il mezzo di placcatura e rimettere la piastra nell'incubatore. Per prepararsi all'imaging a colorante sensibile alla tensione, equipaggiare un microscopio a epifluorescenza invertito con una lente ad alta apertura numerica con ingrandimento 40x e accoppiare un LED bianco caldo a commutazione rapida alla porta di illuminazione trasmessa. Inserire un semplice filtro rosso da 660 nanometri nel percorso della luce trasmessa e montare una testa LED a commutazione rapida da 470 nanometri per la registrazione fotometrica.

Inserire un filtro di eccitazione 470/40 sulla porta di epifluorescenza per ripulire la luce generata dal LED e inserire un cubo da microscopio contenente un divisore di fascio a passaggio lungo da 495 nanometri nel carosello dell'unità specchio all'interno del microscopio. Montare un braccio di rilevamento contenente un diaframma di campo regolabile sulla porta dell'innesto C per consentire la selezione della regione di interesse e accoppiare un rivelatore PMT e una fotocamera USB al microscopio. Inserire un cubo filtrante contenente un divisore di fascio passante lungo 565 nanometri e un filtro di emissione 535/50 nella porta PMT per dividere la luce di emissione tra i due rivelatori.

Accoppiare il PMT a un alimentatore e a un amplificatore PMT e collegare l'uscita dell'amplificatore PMT a un pin di ingresso analogico di un sistema di acquisizione dati. Per soddisfare i criteri di Nyquist e prevenire l'aliasing, filtrare i dati analogici dal PMT a un kilohertz o superiore e digitalizzare i dati a una frequenza che sia almeno il doppio di quella della frequenza più alta presente nel segnale analogico. Per caricare le celle con colorante sensibile alla tensione, mescolare cinque microlitri di FluoVolt 1000x e 50 microlitri di soluzione di carico di potenza e aggiungere tre microlitri della soluzione di carico risultante a tre millilitri di soluzione di Tyrode riscaldata in una capsula di Petri.

Aggiungere un singolo vetrino coprioggetto rivestito di cellule staminali pluripotenti indotte derivate da cardiomiociti al piatto e posizionare il piatto a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Montate una camera di imaging di cellule vive riscaldata sul tavolino del microscopio e riempite la camera con 500 microlitri di soluzione fresca di Tyrode. Quindi lavare il vetrino coprioggetti con una soluzione fresca di Tyrode a 37 gradi Celsius e utilizzare una pinza a punta fine per trasferire con cura il vetrino coprioggetti nella camera del bagno preriscaldata.

Per standardizzare la dinamica cellulare e i parametri sperimentali, inserire due elettrodi di platino nella camera, distanziati di cinque millimetri l'uno dall'altro, e collegare gli elettrodi a uno stimolatore esterno. Impostare lo stimolatore su impulsi di campo bipolare di cinque millisecondi a 0,5 hertz e aumentare lo stimolo da un volt fino a quando le cellule iniziano a contrarsi. Quindi impostare la tensione a circa il 25% al di sopra di questa soglia.

Per l'acquisizione del potenziale d'azione ottico, utilizzare il percorso della luce trasmessa e la fotocamera USB per visualizzare i miociti in condizioni di campo chiaro. Selezionare una cella isolata e utilizzare il diaframma di campo per ritagliare strettamente il suo percorso ottico, assicurandosi che venga monitorata solo la luce proveniente dalla cella di interesse. Attivare l'amplificatore PMT e impostare l'alimentazione PMT a 750 volt.

Esegui il protocollo di stimolazione insieme al software di acquisizione attivando contemporaneamente la luce di eccitazione a 470 nanometri. Registra 10 scansioni, assicurandoti che vengano rilevati potenziali d'azione stabili. Dopo l'ultima scansione, spostare immediatamente il tavolino del microscopio mentre si sta ancora registrando per acquisire brevemente il segnale di fondo da una regione priva di cellule e spegnere la luce di eccitazione.

Per analizzare i dati sul potenziale d'azione, aprire una registrazione salvata nel software di analisi appropriato e calcolare la media di 10 sweep contenenti potenziali d'azione stimolati da una singola cella. Sottrarre la media del segnale di base che rappresenta l'offset di fluorescenza dalla traccia media, quindi utilizzare la formula per calcolare la variazione della fluorescenza utilizzando la fluorescenza diastolica come F0. Identificare le aree diastoliche e del potenziale d'azione di interesse e misurare i parametri del potenziale d'azione cardiaco desiderati, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la durata al 50% e al 90% di ripolarizzazione. Quindi esporta i dati da questa singola cella in un programma per fogli di calcolo.

Questo metodo consente una quantificazione rapida e precisa della meccanica di ripolarizzazione, che può fornire preziose informazioni sulle anomalie ioniche cellulari. Caratteristiche pronunciate della fase uno possono essere osservate nei segnali ottici dei cardiomiociti murini, che sono morfologicamente distinti da quelli dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Inoltre, i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane rispondono alla manipolazione farmacologica con nifedipina, un noto antagonista dei canali del calcio di tipo L.

Durante l'applicazione continua del farmaco, è stata osservata una diminuzione del 41,5% della durata del potenziale d'azione al 90% di ripolarizzazione, suggerendo la funzionalità dell'imaging basato su indicatori di tensione fluorescente come piattaforma per studi prospettici di screening cardiaco di farmaci ad alto rendimento. È importante tenere presente che, sebbene il colorante sensibile alla tensione utilizzato in questo studio sia meno citotossico di altri, la luce di eccitazione dovrebbe comunque essere usata con parsimonia per conservare la vitalità cellulare. L'apparecchiatura di fotometria modulatoria utilizzata in questo protocollo è incredibilmente versatile.

Ad esempio, può essere utilizzato per misurazioni simultanee di altri parametri elettrofisiologici, come il calcio intracellulare.