Name: Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri i protocolli di co-coltura microfluidica 2D e 3D per studiare le interazioni tumore-sistema immunitario e valutare trattamenti anti-cancerogeni in tempo reale.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare. AS è sostenuto dalla Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) e dal Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS e FM sono sostenuti dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) n. 21366 a G.S.).

I metodi descritti cercano di progettare un approccio generale per ricapitolare, con grado modulabile di complessità, due aspetti significativi nel campo dell'onco-immunologia, che possono beneficiare dell'adozione di modelli in vitro più rilevanti. Il primo riguarda il lato della popolazione di cellule tumorali, dove affrontare le caratteristiche delle singole cellule può portare a una migliore descrizione dell'eterogeneità e del significato biologico e clinico correlato tra cui resistenza alla terapia, propensione alle...

L'evoluzione di diverse branche della medicina come discipline sperimentali è dipesa dalla capacità di manipolare la popolazione cellulare e le funzioni degli organi in condizioni controllate1. Tale capacità ha le sue radici nella disponibilità di modelli misurabili in grado di ricapitolare i processi che avvengono nel nostro corpo.
Nell'era dell'immunoterapia e del profilo genomico unicellulare 2, la biologia del cancro deve trarre vantaggio dai modelli emergenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato 2,3.
Il microambiente tumorale4 (TME) è un tessuto complesso in cui le cellule tumorali interagiscono continuamente e co-evolvono dinamicamente con le altre componenti cellulari (cellule immunitarie, stromali ed endoteliali) e non cellulari (matrice extracellulare, ECM). La natura dinamica di questo complesso paesaggio determina se le cellule immunitarie giocano come amiche o nemiche delle cellule maligne, influenzando così fortemente sia la progressione della malattia che la risposta alla terapia. Al giorno d'oggi, grandi sforzi da parte di onco-immunologi, bioinformatici ed esperti di biologia dei sistemi stanno convergendo per affrontare il significato clinico dell'eterogeneità del cancro 5,6, sia nello spazio (cioè in regioni tumorali distinte) che nel tempo (cioè in fasi distinte di progressione tumorale)5,6, e per caratterizzare il cancro e il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie a livello di singola cellula. Come esempio di questa sinergia, tecniche avanzate di visione artificiale sono ora utilizzate di routine per la mappatura spaziale degli infiltrati immunitari nei campioni istologici 7,8.
Sul fronte dei modelli sperimentali, collegando gli studi sugli animali e i metodi tradizionali in vitro, i progressi nella microfluidica e nelle tecniche di co-coltura danno accesso a diverse classi di modelli cellulari microingegnerizzati come organoidi, sistemi microfisiologici 9,10,11 (MPS) e organi-on-chip12,13,14 (OOC). Condividono il tratto comune di ingrandire la visione "d'insieme" degli ecosistemi cellulari e di espandere il potenziale in vitro per controllare i fattori microambientali sfruttando al contempo la microscopia ad alto contenuto15 e gli approcci di elaborazione delle immagini.
Al giorno d'oggi, i sistemi MPS e OOC all'avanguardia hanno iniziato a includere aspetti immunologici , incorporando diversi sottotipi di cellule immunitarie in tessuti e co-colture esistenti, in modo da esplorare e misurare una varietà di processi come malattie infiammatorie, guarigione delle ferite, immunità mucosale e risposta alle tossine o prodotti alimentari quotidiani16. I modelli TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, anch'essi integrati con microvasi perfusibili 18,19,20,21, sono stati sviluppati per studiare le interazioni dipendenti dal tipo di cellula, le perturbazioni fisiche e chimiche e l'attività citotossica di linfociti infiltranti22, nonché agenti immunomodulatori clinicamente rilevanti23.
Qui, forniamo protocolli versatili, che vanno dal caricamento delle cellule nei chip agli strumenti di elaborazione delle immagini, per sfruttare co-colture microfluidiche avanzate tumore-immune in impostazioni 2D (sezione 1) e 3D (sezione 2)16, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico24 e la visualizzazione delle funzioni cellulari. Ciò si ottiene mantenendo la facilità d'uso e la flessibilità sia nella gestione dei campioni che nell'analisi dei dati, sfruttando il software freeware delle Fiji e le sue cassette degli attrezzi25,26.
Il dispositivo microfluidico, descritto nella sezione 1, è progettato per eseguire co-colture 2D di cancro aderente e cellule immunitarie galleggianti. Questa piattaforma è stata validata per la misurazione in vitro del comportamento delle cellule immunitarie in presenza di mutazioni genetiche27 e/o immunodeficienze28. Qui, illustriamo i passaggi per tracciare le cellule immunitarie nelle immagini time-lapse in campo chiaro, sfruttando un metodo semi-automatico basato su Trackmate (un plugin implementato nel software Fiji). Questa procedura consente l'estrazione di descrittori cinematici della migrazione immunitaria 29 e della risposta (cioè dei tempi di interazione) alle cellule tumorali bersaglio, trattate o meno con induttori di morte cellulare immunogenica27.
È importante sottolineare che questi parametri, estratti da immagini di serie temporali, possono essere elaborati con macchinari matematici avanzati. Come esempio della potenzialità di questo approccio, i nostri gruppi hanno recentemente pubblicato un'analisi basata su metodi matematici dai processi stocastici e dalla meccanica statistica per modellare le proprietà della rete cellulare e fornire una descrizione parametrizzata del comportamento delle cellule immunitarie (cioè, camminata casuale distorta o non correlata, movimento altamente o non coordinato30,31).
L'impostazione 3D, fornita nella seconda sezione, si basa su un protocollo di co-coltura per ricreare TME immunocompetenti più complesse incorporate in due regioni di gel con diverse combinazioni di tipi cellulari e farmaci in modo competitivo. Qui, vengono descritte le fasi di elaborazione delle immagini per misurare, in diversi punti temporali, l'infiltrazione di cellule immunitarie colorate in cellule di melanoma umano A375M coltivate all'interno di Matrigel, per valutare le combinazioni di agenti antitumorali32. A375M, una linea cellulare derivata da A375P caratterizzata da un fenotipo altamente metastatico, è stata scelta per valutare la loro capacità metastatica in presenza di cellule immunitarie32.
I modelli descritti possono essere pienamente compatibili con diverse fonti cellulari (linee cellulari murine e umane immortalizzate o primarie, organoidi, xenotrapianti, tra gli altri). In recenti studi del nostro laboratorio, combinando la microscopia video ad alto contenuto con l'analisi delle immagini, il layout 3D competitivo è stato applicato per indagare: i) una risposta immunitaria antitumorale (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC) e sezionare il ruolo dei fibroblasti nella resistenza alla terapia con trastuzumab in modelli on-chip di carcinoma mammario HER2+ 33; ii) l'azione delle cellule mieloidi (cioè dei macrofagi associati al cancro) nei meccanismi di evasione tumorale e di reclutamento delle cellule T34; iii) l'efficacia di regimi immunoterapeutici, specificamente basati su cellule dendritiche (IFN-DC) condizionate da interferone α, coltivate con cellule tumorali del colon trattate con farmaci in matrici di collagene, e la valutazione del movimento efficiente e dei successivi eventi di fagocitosi35; iv) la migrazione chemiotattica di eosinofili derivati dal midollo osseo verso cellule di melanoma trattate o non trattate con IL-3336.
Questi modelli avanzati potrebbero servire come finestre di osservazione per comprendere il ruolo del contesto immunitario nelle metastasi del cancro e nei meccanismi di resistenza, ma sono necessari sforzi per tradurre i risultati nelle cliniche, colmando il divario con la ricerca di base37.
Come scenario emergente, sfruttare la potenza della microscopia automatizzata ad alto contenuto accoppiata all'uso di microsistemi più fisiologicamente rilevanti sta aprendo nuove potenziali sfide per la gestione, l'elaborazione e l'interpretazione di centinaia, e persino migliaia, di gigabyte di dati multiparametrici, che possono essere generati da una singola campagna sperimentale. Ciò implica un collegamento diretto degli esperimenti OOC con algoritmi basati sull'intelligenza artificiale 38,39,40,41,42 (AI) sia per l'analisi automatizzata avanzata, sia per la generazione di funzionalità che possono alimentare a loro volta modelli in silico di interazione cancro-immunità 43, con nuove entusiasmanti applicazioni all'orizzonte, come lo sviluppo di saggi predittivi di screening farmacologico 44.
Un flusso di sforzi in continua espansione è focalizzato sulla progettazione di modelli di malattia congiuntamente all'ottimizzazione delle strategie per implementare gli schermi di perturbazione su larga scala con letture multi-omiche a cella singola. Ciò aiuterà senza dubbio lo sviluppo e, si spera, l'implementazione clinica, accompagnata da un adeguato grado di standardizzazione del metodo, di un approccio sistematico onco-immunology-on-a-chip per ottenere nuove informazioni sui disturbi immunitari e sui meccanismi di diffusione del cancro.

<table><tbody><tr><td>Materiali per colture cellulari&nbsp; Provette da </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>CLS430828</td><td>provette da centrifuga</td></tr><tr><td>5-aza-2'-deossicitidina DAC</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>A3656</td><td>Agente ipometilante del DNA</td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>Piastre per</td><td>coltura</td>CLS3506</tr><tr><td>Pallone</td> <td>trattato per colture cellulari da 75 cm2Corning, New York, NY</td><td>430641U</td><td>fiasche di coltura</td></tr><tr><td>A365M</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA<</td><td>br/> CVCL_B222</td><td>linea cellulare di melanoma umano</td></tr><tr><td>Doxorubicina cloridrato</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>D1515</td><td>antibiotico antraciclina&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECM0728L</td><td>Terreno di coltura per cellule SK-MEL-28&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco senza calcio senza magnesio</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>Soluzione</td><td>tampone salina</td>ECB4004L</tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECS0180L</td><td>ausiliario per colture cellulari</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE-Heathcare</td><td>17-1440-02</td><td>separazione di cellule mononucleate dal sangue umano.</td></tr><tr><td>emocitometro</td><td>Neubauer</td><td></td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>Fiale eparinizzate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>Fiale per la raccolta di sangue venoso</td></tr><tr><td>interferone alfa-2b</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>SRP4595</td><td>citochina umana ricombinante</td></tr><tr><td>L-Glutammina 100X</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECB3000D</td><td>ausiliario per colture cellulari</td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Mezzi di separazione delle cellule dei linfoliti</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td><td></td><td>Separazione dei linfociti mediante centrifugazione a gradiente di densità</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norvegia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, New York, NY</td><td>354230</td><td>fattore di crescita ridotto matrice della membrana basale</td></tr><tr><td>MDA-MB-231&nbsp;</td><td>Collezione di cultura di tipo americano (ATCC), Manassas, VA</td><td>&nbsp; HTB-26</td><td>linea cellulare di carcinoma mammario umano</td></tr><tr><td>Penicillina/ Streptomicina 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECB3001D</td><td>ausiliario per colture cellulari</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>4-000-201</td><td>Liquid handling</td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent cell linker</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>PKH26GL</td><td>colorante cellulare fluorescente rosso</td></tr><tr><td>PKH67 Linker cellulare fluorescente verde</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>PKH67GL</td><td>colorante cellulare fluorescente verde</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECM2001L</td> Terreno di coltura per pipette sierologiche <td>per cellule MDA-MB-231</td></tr><tr><td>(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td><td>Puntali sterili per la manipolazione di liquidi</td></tr><tr><td>(1-10 &mu; L, 10-20 &mu; L, 20-200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td><td>punte per micropipette</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>colorazione cellulare per valutare la vitalità cellulare</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECM0920D</td><td>reagente di dissociazione per cellule</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> aderenti<tr><td>Apparecchiature per colture cellulari</ Microscopio</td> a fluorescenza strong><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS-FL</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>Microscopio a fluorescenza per cellule viventi</td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari umificate&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td>311 Forma Coicubatore a calore diretto; TC 230</td><td>Incubazione di colture cellulari a 37 gradi C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Juli Microscopio</td><td>Nanoentek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero da laboratorio (4 gradi; C)</td>Armadio di sicurezza da laboratorio <td>FDM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Classe II)</td><td>Steril VBH 72 MP</td><td></td><td>Cappa a flusso laminare</td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Centrifuga refrigerabile Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> termostatico<tr><td><forte>Materiali di microfabbricazione&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyl)trietossisilano (Aptes)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td>agente silanizzante per l'incollaggio di PDMS a vetrino coprioggetto in plastica</td></tr><tr><td>Maschere al quarzo di cromo / 4 "x4", HRC / No AZ&nbsp;</td><td>MB W& A,&nbsp; Maschere</td> ottiche Germania <td></td><td>per fotolitografia</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti, D 263 M Schott vetro,&nbsp; (170 &plusmn; 5 &micro; m)</td><td>Ibidi, Germania</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno 30%</td> <td>Carlo Erba Reagenti</td><td>412081</td><td>reagenti per soluzione piranha</td></tr><tr><td>Metil isobutililchetone</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>461945</td><td>PMMA e-beam resist</td></tr><tr><td>developer Vetrini per microscopio (confezione da 50 vetrini) 76,2 mm x 25,4 mm&nbsp;</td><td>Substrati Sail Brand</td><td>7101</td><td>per l'incollaggio di chip</td></tr><tr><td>Miltex Biopsy Punch con stantuffo, ID 1.0mm</td><td>Punzoni per biopsia dermica</td><td>Tedpella</td><td></td> per serbatoi di chip</tr><tr><td>PMMA&nbsp; 950 kDa</td><td>Allresist, Germania</td><td>AR-P. 679.04</td><td>Resistenze elettroniche positive per la modellazione di maschere ottiche</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti polimerici non trattati</td><td>Ibidi, Germania</td><td>10813</td><td>substrati per l'incollaggio di chip</td></tr><tr><td>Prime CZ-Si Wafer,&nbsp; 4", (100), Boro drogato</td><td>Gambetti Xenologia Srl, Italia</td><td>30255</td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-olo</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>415238</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di etere monometilico di glicole propilenico (PGMEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484431-4L</td><td>SU-8 resiste allo sviluppatore</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>Micro resist technology,Germania</td><td>C1.02.003-0001</td><td>Negativo Fotoresist</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Tecnologia micro resist, Germania</td><td>C1.02.003-0005</td><td>Fotoresist negativi</td></tr><tr><td>Suite di Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mm</td><td>Tedpella</td><td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td><td>punzoni per biopsia dermica per serbatoi di chip</td></tr><tr><td>Acido solforico 96%</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>410381</td><td>reagenti per soluzione piranha</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>11-3184-01</td><td>Elastomero siliconico (PDMS)</td></tr><tr><td>Trimetilclorosilano (TMCS)</td>Agente silanizzante <td>Sigma Aldrich</td><td>92360-100ML</td><td>per SU-8 masters</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiature di microfabbricazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 kV litografia a fascio elettronico</td> Piastra riscaldante <td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di litografia ottica</td><td>EV-420 allineatore</td><td></td><td></td>a maschera a contatto double-face</tr><tr><td>Sistema di mordenzatura ionica reattiva</td> Sistema <td>Oxford plasmalab 80 plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore sottovuoto</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

I modelli di malattia complessi richiedono strumenti all'avanguardia in grado di fornire informazioni fisiologicamente e patologicamente rilevanti e fruibili e di svelare processi altrimenti invisibili. Saggi cellulari avanzati che imitano da vicino lo scenario in vivo si stanno affermando come nuovi modi per visualizzare e misurare l'interazione bidirezionale tumore-ospite che influenza la progressione del cancro. Qui descriviamo due protocolli versatili per ricreare co-colture 2D e 3D altamente controllabili in microdispositivi, imitando la complessità del microambiente tumorale (TME), sotto sorveglianza immunologica naturale e indotta dalla terapia. Nella sezione 1, viene fornito un setting sperimentale per monitorare la diafonia tra cellule tumorali aderenti e popolazioni immunitarie fluttuanti, mediante microscopia time-lapse a campo chiaro. Come scenario applicativo, analizziamo gli effetti dei trattamenti antitumorali, come i cosiddetti induttori immunogenici della morte delle cellule tumorali sul reclutamento e l'attivazione delle cellule immunitarie. Nella sezione 2, i microambienti 3D tumorali-immunitari sono assemblati in un layout competitivo. L'infiltrazione immunitaria differenziale viene monitorata mediante istantanee di fluorescenza fino a 72 ore, per valutare strategie terapeutiche combinate. In entrambi i contesti, le fasi di elaborazione delle immagini sono illustrate per estrarre una pletora di parametri delle cellule immunitarie (ad esempio, migrazione e interazione delle cellule immunitarie, risposta agli agenti terapeutici). Questi metodi semplici e potenti possono essere ulteriormente adattati per simulare la complessità della TME che comprende l'eterogeneità e la plasticità dei sottotipi di cancro, cellule stromali e immunitarie, nonché le loro reciproche interazioni come motori dell'evoluzione del cancro. La conformità di queste tecnologie in rapida evoluzione con l'imaging ad alto contenuto di cellule vive può portare alla generazione di grandi set di dati informativi, portando nuove sfide. In effetti, il triangolo "co-colture/microscopia/analisi avanzata dei dati" stabilisce il percorso verso una precisa parametrizzazione del problema che può aiutare protocolli terapeutici su misura. Prevediamo che la futura integrazione dell'on-a-chip immune al cancro con l'intelligenza artificiale per l'elaborazione ad alto rendimento rappresenterà un grande passo avanti nello sfruttare le capacità come strumenti predittivi e preclinici per l'oncologia di precisione e personalizzata.

L'infiltrazione immunitaria tumorale è un parametro della risposta antitumorale dell'ospite. I tumori sono eterogenei nella composizione, densità, posizione e stato funzionale dei leucociti infiltranti le cui interazioni con le cellule tumorali possono essere alla base di informazioni clinicamente rilevanti per prevedere il decorso della malattia e la risposta alla terapia. In questo senso, le tecnologie microfluidiche potrebbero essere utilizzate come strumenti complementari e privilegiati in vitro per esplorare il cont...

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

Questo protocollo fornisce impostazioni sperimentali per eseguire co-colture 2D e 3D controllabili in micro-dispositivi per visualizzare e monitorare le diafonie tumore-cellule immunitarie e analizzare gli effetti dei trattamenti anti-cancro. Questa tecnologia fornisce una visualizzazione semplice e in tempo reale del reclutamento e delle interazioni delle cellule immunitarie e può essere impiegata per campioni umani e derivati dal paziente. È compatibile con la maggior parte delle microscopie all'avanguardia.A dimostrare la procedura saranno Francesco Noto, dottorando presso il Dipartimento di Oncologia e Medicina Molecolare dell'Istituto Superiore di Sanita, e Nicoleta Manduca ed Esther Maccafeo, dottorande dell'Università Cattolica del Sacro Cuore, Dipartimento di Medicina e Chirurgia Traslazionale. I trucioli sono precedentemente attivati al plasma in un pulitore al plasma o in una macchina reattiva per l'incisione del ferro in camera bianca. Le cellule della milza murina-milza e una linea cellulare tumorale sono utilizzate qui per imitare i protocolli descritti nel testo.Prima di caricare le sospensioni delle celle, prelevare il fluido da tutti e sei i serbatoi. Quindi caricare lentamente 1 x 10 alle cellule tumorali 5th risospese in 10-50 microlitri di terreno di crescita nel serbatoio superiore sinistro e nel pozzo inferiore. Sul lato destro, pipettare delicatamente 1 x 10 alle 6 cellule immunitarie galleggianti risospese in 50 microlitri di terreno di crescita in due pozzetti.Quando tutte le cellule sono state aggiunte, riempire tutti e sei i serbatoi di ciascun chip con un massimo di 100-150 microlitri di terreno di coltura e controllare che le cellule siano state distribuite correttamente all'interno di ciascun compartimento di coltura. Incubare il chip per un'ora per consentire al sistema di stabilizzarsi prima della registrazione time-lapse. Per l'imaging delle cellule vive, montare il tumore immune sulla piastra del chip sullo stadio del microscopio.Personalizzare l'impostazione del flusso di lavoro di acquisizione nell'interfaccia del software del microscopio come il software di analisi delle cellule vive Incucyte. Selezionare le finestre di osservazione, il frame rate ottimale e la durata temporale, a seconda dei parametri appropriati per l'esperimento e dei tipi di cellule in studio. Immagine delle celle per il periodo di tempo sperimentale appropriato.Preparare due aliquote di matrigel diluite con terreno contenente un farmaco o una combinazione di farmaci per le due condizioni sperimentali utilizzando punte fredde. Pipettare delicatamente cellule tumorali colorate con coloranti fluorescenti compatibili con vivo sospese in soluzione di matrice su ghiaccio per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule. Con la piastra del chip su un blocco di raffreddamento o su un cestello con ghiaccio, iniettare lentamente la soluzione di matrice di cellule tumorali trattata con farmaco nelle porte del gel sinistro e destro utilizzando punte di micropipette fredde da 10 microlitri.Applicare una leggera pressione per spingere la soluzione della matrice da un lato all'altro del canale. Quando tutte le cellule tumorali sono state caricate, posizionare il dispositivo nell'incubatore in posizione verticale per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, una volta completata la gelificazione della matrice, riempire i canali medi di tutti e sei i serbatoi con 50 microlitri di terreno di coltura.Controllare l'integrità del gel polimerizzato e la distribuzione delle cellule tumorali al microscopio. Quindi posizionare i chip in un'incubatrice fino al completamento della preparazione delle cellule immunitarie. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo da ciascun pozzetto.Posizionare la punta vicino all'ingresso del canale medio e utilizzare una pressione moderata per iniettare delicatamente 10 microlitri di 10 alle 6 cellule immunitarie etichettate con un colorante fluorescente a contrasto. Iniettare da 50 a 100 microlitri del mezzo in ciascuno dei quattro pozzetti dei canali laterali, da 40 a 90 microlitri del mezzo nel pozzo centrale superiore e da 50 a 100 microlitri del mezzo nel pozzo centrale inferiore. Quando tutti i pozzetti sono stati caricati, utilizzare un microscopio per confermare che la distribuzione delle cellule immunitarie è rimasta confinata alla camera centrale.Quindi posizionare con attenzione il dispositivo su una superficie piana nell'incubatore di coltura cellulare fino all'imaging. Per calcolare l'estensione delle cellule immunitarie vive colorate con fluorescenza che si infiltrano nei compartimenti tumorali, visualizzare il dispositivo in specifici punti di interesse temporale mediante microscopia a fluorescenza e impostare i parametri appropriati della fotocamera nel software di imaging del microscopio, come Nikon NIS-Elements. Imposta anche i parametri per le cellule immunitarie marcate.Il movimento dei leucociti attraverso ponti a microcanali opportunamente costruiti nella piattaforma microfluidica verso le loro cellule bersaglio può essere monitorato mediante microscopia video. In questa analisi di monitoraggio, le singole PBMC sono state sfidate con cellule tumorali morenti trattate con doxorubicina o trattate con PBS vive. I valori rilevanti della chemiotassi e i grafici di migrazione sono stati generati automaticamente e un diverso profilo migratorio per le cellule immunitarie è stato osservato quando co-caricato con cellule di cancro al seno esposte a doxorubicina o PBS.Quando le PBMC si sono confrontate con cellule tumorali apoptotiche, hanno attraversato i microcanali verso le cellule morenti e morte, ma non hanno attraversato le cellule vive e non trattate. Una frazione di leucociti con densità crescente nell'arco di 24-48 ore ha mostrato contatti a lungo termine con cellule tumorali trattate con doxo. In questa analisi, è stato utilizzato un nuovo modello tumorale immunocompetente 3D per quantificare il reclutamento di cellule immunitarie in risposta a combinazioni anti-cancro di farmaci epigenetici.Le PBMC marcate con colorante rosso sono state quindi distribuite in modo omogeneo nella camera fluidica centrale. La capacità delle due masse tumorali di attrarre le PBMC è stata quindi confrontata, con le PBMC reclutate in modo robusto in questo esperimento nel microcanale destro. Per il modello 3D, mescolare la soluzione con idrogel e cellule su ghiaccio, evitando bolle e pre-polimerizzazione.Iniettarlo lentamente senza eccessiva pressione. Regolare le fasi di polimerizzazione in base alla matrice utilizzata. Possono essere implementati saggi di cellule vive/morte e profili di secrezione di citochine da surnatanti .L'immunofluorescenza per l'imaging confocale può essere eseguita per classificare i sottotipi immunitari e per i marcatori di espressione di attivazione e maturazione dell'esaurimento.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti...

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.

Arricchimento e caratterizzazione dei tumore immuni e Non immuni microambienti in tumori murini sottocutanei stabiliti

Vi presentiamo un modello microfluidico cancro su chip, la tecnologia "Evolution Accelerator", che fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine in tempo reale della dinamica del cancro all'interno di condizioni ambientali ben definite a singola cellula livello. Si prevede che questa tecnologia funzionerà come modello in vitro per la ricerca fondamentale o lo sviluppo di farmaci preclinici.

Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo semplice, veloce e affidabile di citometria a flusso multiparametrica e tumor-on-a-chip per monitorare e caratterizzare le fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. In effetti, una comprensione approfondita delle interazioni tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica.

Sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità

Qui, presentiamo protocolli che descrivono in dettaglio le istruzioni per l'implementazione di colture cellulari 3D utilizzando matrici di collagene e collagene-agarosio in un sistema microfisiologico. Questi protocolli supportano la co-coltura del tubulo prossimale renale e degli sferoidi del carcinoma a cellule renali, simulando condizioni in vivo e consentendo un'indagine avanzata sulle interazioni tra le cellule tumorali del rene.

Co-coltura microfluidica dell'epitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene

Il presente protocollo descrive un flusso di lavoro sperimentale che consente l'analisi ex vivo della stimolazione di cellule T umane in un sistema di co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate.

Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Scopri i protocolli di co-coltura microfluidica 2D e 3D per studiare le interazioni tumore-sistema immunitario e valutare trattamenti anti-cancerogeni in tempo reale.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

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