Name: Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri come determinare i requisiti di impollinazione nelle prugne giapponesi combinando impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione PCR. Questo metodo integrato aiuta a identificare impollinatori efficaci per cultivar auto-incompatibili.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata finanziata dall'Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón —Fondo sociale europeo, Unione europea (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura —Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plan Regional de Investigación (IB16181), Grupo de Investigación (AGA001, GR18196). B.I. Guerrero è stato sostenuto da una borsa di studio del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología del Messico (CONACYT, 471839).

1. Impollinazione manuale sul campo
<ol><li>
Estrazione del polline
	<ol>
<li>Per ottenere il polline, raccogliere i boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26. NOTA: Sono necessari più boccioli di fiori nella prugna giapponese che in altre specie di Prunus perché le loro antere producono meno polline.</li>
		<li>Rimuovere le antere utilizzando una rete di plastica (dimensioni dei pori 2 mm x 2 mm) e posizionarle su carta a temperatura ambiente per 24 ore fino alla deiscenza dell'anther.</li>
		<li>Setacciare i grani di polline attraverso una rete sottile (0,26 mm x 0,26 mm di dimensione dei pori) e conservarli in un tubo di vetro da 10 ml con un tappo a 4 °C fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impollinazione di fiori evirati
	<ol>
<li>Quando tra il 10% e il 20% dei fiori sono aperti, selezionare ed etichettare diversi rami. Rimuovere i fiori aperti e i giovani boccioli, lasciando solo boccioli di fiori allo stadio D24, secondo lo stadio 57 sulla scala BBCH25,26.</li>
		<li>Rimuovere i petali, i sepali e gli stami tra 800 e 1.000 boccioli di fiori per trattamento con unghie o pinzette.</li>
		<li>Impollinare a mano i pistilli con l'aiuto di un pennello fine 24 ore dopo l'evirazione. Alcuni rami contengono metà dei pistilli con polline della stessa cultivar e l'altra metà con polline compatibile di altre cultivar come controllo. Fare attenzione a non contaminare la punta delle dita o il pennello con grani di polline di altre cultivar.</li>
		<li>Registra i conteggi settimanali di fiori e frutti in via di sviluppo per caratterizzare il modello di goccia di frutta e quantificare l'allegagione finale in ogni trattamento di impollinazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Impollinazione supplementare sul campo
	<ol>
<li>Pochi giorni prima dell'apertura dei primi fiori, racchiudere alberi selezionati in una gabbia a rete da 0,8 mm per evitare l'arrivo di insetti impollinatori.</li>
		<li>Quando il 10%-20% dei fiori è aperto, selezionare ed etichettare diversi rami per trattamento di impollinazione, lasciando 1.000-1.500 fiori per trattamento.</li>
		<li>Il giorno successivo, quando i fiori sono aperti, impollinare ogni fiore con l'aiuto di un pennello con il polline corrispondente (polline della stessa cultivar per l'autoimpollinazione e di altre cultivar compatibili come controllo dell'impollinazione incrociata).</li>
		<li>Impollinare a giorni alterni fino a quando tutti i fiori si aprono.</li>
		<li>Registra i conteggi settimanali dei fiori e dei frutti in via di sviluppo dall'antesi al raccolto per caratterizzare il modello di goccia di frutta e quantificare l'allegagione finale in ogni trattamento di impollinazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Impollinazioni manuali in laboratorio
<ol><li>Raccogli 50-100 fiori nella fase D24, secondo la fase 57 sulla scala BBCH25,26.</li>
	<li>In laboratorio, evirare 30 fiori per trattamento (auto-impollinazione e cross-impollinazione). NOTA: L'evirazione deve essere effettuata con attenzione per evitare danni ai pistilli.</li>
	<li>Fai un taglio fresco sulla base di ogni pedicello di fiori sott'acqua prima di metterlo su un pezzo di schiuma da fiorista bagnata (un pezzo di schiuma per ogni trattamento di impollinazione).</li>
	<li>Impollinare manualmente ogni pistillo 24 ore dopo utilizzando un pennello fine con polline raccolto in precedenza (vedere paragrafo 1.1). Impollinare un set di pistilli con polline della stessa cultivar e l'altro set con polline di una cultivar compatibile come controllo.</li>
	<li>Lasciare i pistilli impollinati 72 ore dopo l'impollinazione a temperatura ambiente. La schiuma floreale deve essere continuamente bagnata con acqua.</li>
	<li>Fissare i pistilli in una soluzione fissativa di etanolo/acido acetico (3:1) per almeno 24 ore a 4 °C. Sostituire il fissativo con etanolo al 75%. I campioni possono essere conservati in questa soluzione a 4 °C fino all'uso27. NOTA: assicurarsi che i campioni siano completamente immersi nella soluzione.</li>
</ol>3. Osservazioni microscopiche
<ol><li>
Valutazione della germinazione in vitro del polline
	<ol>
<li>Per elaborare il terreno di germinazione del polline, sciogliere 25 g di saccarosio su 250 ml di acqua distillata, quindi aggiungere 0,075 g di nitrato di calcio [Ca(NO3)2] e 0,075 g di acido borico (H3BO3).</li>
		<li>Aggiungere 2 g di agar alla soluzione e mescolare fino a completa dissoluzione28.</li>
		<li>Per sterilizzare il mezzo, autoclavelo a 120 °C per 20 min. Raffreddare il mezzo e, prima che si solidifichi, distribuire 3 ml per capsula di Petri sterile (55 mm x 12 mm) in una cappa a flusso laminare sterile. Dopo la media solidificazione, conservare le piastre di Petri avvolte in un foglio di alluminio a 4 °C fino all'uso.</li>
		<li>Spargere il polline di ogni cultivar precedentemente utilizzata come donatore di polline nelle impollinazioni controllate in due piastre di Petri e incubarle a 25 °C per 24 ore. NOTA: Il mezzo di coltura inoculato può essere osservato al microscopio immediatamente dopo o conservato a -20 °C fino all'uso. A tale scopo, le piastre di Petri devono essere cambiate dal congelatore al frigorifero 24 ore prima delle osservazioni al microscopio.</li>
		<li>Per osservare i grani di polline, preparare una soluzione blu anilina all'1% (v /v) che macchia callosio. In primo luogo, preparare una soluzione tribasica di fosfato di potassio 0,1 N (K3PO4) sciogliendo 7,97 g di K3PO4 in 1.000 ml di acqua distillata. Per elaborare la soluzione blu di anilina all'1% (v/v), sciogliere 1 mL di blu anilina in 100 mL di 0,1 N K3PO4.</li>
		<li>Aggiungere 2-3 gocce di soluzione blu di anilina a ciascuna piastra di Petri e osservare dopo 5 minuti al microscopio a epifluorescenza UV utilizzando il filtro eccitere BP340-390 e il filtro barriera LP425. Contare i grani di polline vitali e non vitali in tre campi per piatto, ogni campo contenente 100-200 grani di polline, in due piastre di Petri per ogni cultivar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crescita del tubo di polline
	<ol>
<li>Risciacquare i pistilli fissi con acqua distillata tre volte (1 h ciascuno, 3 h in totale) e trasferire al 5% (p/v) di solfito di sodio (Na2SO3)a 4 °C per 24 h. Per preparare questa soluzione, sciogliere 5 g di solfito di sodio in 100 ml di acqua distillata.</li>
		<li>Autoclave i pistilli a 120 °C per 8 min in solfito di sodio al 5% (p/v) per ammorbidire i tessuti.</li>
		<li>Schiacciare i pistilli ammorbiditi in una goccia di soluzione blu anilina all'1% (v / v) sotto un vetro di copertura su un vetrino per macchiare callosio.</li>
		<li>Osserva la crescita del tubo di polline lungo lo stile al microscopio con epifluorescenza UV usando il filtro eccitere BP340-390 e il filtro barriera LP425.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Determinazione delle relazioni di incompatibilità
<ol><li>Estrazione del DNA dalle foglie<ol>
<li>Per estrarre il DNA, raccogliere 3-4 foglie giovani di ogni cultivar nel campo, preferibilmente in primavera. NOTA: il DNA può anche essere estratto da foglie mature, ma il DNA da foglie giovani ha meno composti fenolici.</li>
		<li>Isolare il DNA utilizzando un kit commerciale e seguire il kit di protocollo fornito (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Quantificare la concentrazione di DNA e valutare la qualità del DNA di ciascun campione a 260 nm in uno spettrofotometro a microvolume UV-Vis. Regolare la concentrazione di DNA a 10 ng/μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condizioni PCR per l'amplificazione dei frammenti<ol>
<li>Etichetta 0,2 mL di tubi e tappi PCR.</li>
		<li>Preparare i reagenti PCR secondo la Tabella 1 e lasciarli scongelare sul ghiaccio.</li>
		<li>Impostare un volume di master mix di ogni coppia di primer in un microtubo da 1,5 mL in base al numero di reazioni più il 10% di eccesso, considerando un volume di 16 μL per reazione. Aggiungere i reagenti seguendo l'ordine nella Tabella 1 e mescolare accuratamente.</li>
		<li>Aliquota 16 μL della miscela master in ogni tubo PCR da 0,2 mL contenente 4 μL di modello di DNA o 4 μL di acqua distillata sterilizzata come controllo negativo (C-). Utilizzare il DNA di cultivar con genotipo noto come controlli positivi. Mescolare delicatamente, chiudere i tubi di reazione con i tappi e centrifugare a 2.000 x g per 30 s per raccogliere l'intero volume nella parte inferiore del tubo di reazione.</li>
		<li>Posizionare i tubi di reazione nel termociclatore e impostare il programma PCR utilizzando il seguente profilo di temperatura: una fase iniziale di 3 min a 94 °C, 35 cicli di 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 3 min a 72 °C e una fase finale di 7 min a 72 °C20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elettroforesi e stima della dimensione del frammento<ol>
<li>Per preparare un mini gel di acarosio all'1,7% (p/v), sciogliere 0,68 g di acarosio e 40 ml di tampone TBE 1x in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml. Sciogliere la soluzione riscaldando in un forno a microonde a 600 W a intervalli di 30 s per evitare l'ebollizione.</li>
		<li>Lasciare che la soluzione rimanga sul banco per raffreddarsi, quindi aggiungere 3,5 μL di soluzione colorante di acido nucleico.</li>
		<li>Posizionare il vassoio di gel nel supporto di fusione e mettere il pettine selezionato nello stampo in gel. Assicurati di avere abbastanza pozzi per ogni prodotto PCR e scala del DNA.</li>
		<li>Versare la soluzione di agarose nello stampo gel e lasciarlo raffreddare fino alla polimerizzazione. Rimuovere il pettine del gel polimerizzato. Posizionare il gel nel sistema di elettroforesi orizzontale contenente abbastanza 1x tampone TBE per coprire la superficie del gel.</li>
		<li>Caricare il primo e l'ultimo pozzo con 2 μL della scala di peso molecolare del DNA (scala del DNA da 1 kb). Caricare 3 μL di ciascun prodotto della PCR negli altri pozzi. Chiudere la camera, accendere l'alimentazione e far funzionare il gel a 100 V per 30 minuti.</li>
		<li>Osservare il gel sotto la luce UV utilizzando un sistema di documentazione del gel. Utilizzare la scala del peso molecolare del DNA per determinare la dimensione del frammento amplificato e confrontarlo con i controlli positivi al fine di identificare gli alleli corrispondenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Monitoraggio delle date dei fiori
<ol><li>Monitorare la fenologia di diversi alberi di ogni cultivar alla fioritura in anni diversi. Stabilire la durata del periodo di fioritura dal primo (circa il 5%) agli ultimi fiori aperti (circa il 95%). La piena fioritura è considerata quando almeno il 50% dei fiori si trova allo stadio F24, secondo lo stadio 65 sulla scala BBCH25,26.</li>
	<li>Per confrontare le date di fioritura delle cultivar intercompatibili e determinare quelle che coincidono al momento della fioritura ogni anno, elaborare un calendario dei tempi di fioritura con i dati di diversi anni.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La metodologia qui descritta per i requisiti di impollinazione delle cultivar di prugne giapponesi richiede la determinazione dell'auto-(in)compatibilità di ciascuna cultivar mediante impollinazioni controllate sul campo o in laboratorio e la successiva osservazione della crescita del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza. Le relazioni di incompatibilità sono stabilite dalla caratterizzazione degli alleli Smediante genotipizzazione molecolare. Infine, la selezione degli impollinatori viene eseguita dalla...

La prugna giapponese (Prunus salicina Lindl.) è originaria della Cina1. Nel 19 ° secolo, questacoltura è stata introdotta dal Giappone negli Stati Uniti, dove è stata incrociata con altre prugne diploidi nordamericane2. Nel 20° secolo, alcuni di questi ibridi sono stati diffusi nelle regioni temperate di tutto il mondo. Al giorno d'oggi, il termine "prugna giapponese" si riferisce a una vasta gamma di ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale P. salicina con fino a 15 altri diploidi Prunus spp.3,4,5.
La prugna giapponese, come altre specie della famiglia delle Rosacee, presenta l'auto-incompatibilità gametofita (GSI), che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locuscontenente più alleli6. Il -locus Scontiene due geni che codificano per una ribonucleasi (S-RNasi) espressa nel pistillo, e una proteina F-box (SFB) espressa nel granello di polline7. Nella reazione di auto-incompatibilità, quando l'allele Sespresso nel granello di polline (aploide) è lo stesso di uno dei due espressi nel pistillo (diploide), la crescita del tubo pollinico attraverso lo stile viene arrestata a causa della degradazione dell'RNA del tubo pollinico da parte dell'azione della S-RNasi8. Poiché questo processo impedisce la fecondazione del gametofito femminile nell'ovulo, GSI promuove l'outcrossing tra cultivar.
Sebbene alcune cultivar di prugne giapponesi siano autocompatibili, la maggior parte delle cultivar attualmente coltivate sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da donatori intercompatibili per fertilizzare i loro fiori3. Nelle specie di drupacee del genere Prunus come la mandorla9,l'albicocca10,11, 12 e la ciliegiadolce 13,i requisiti di impollinazione delle cultivar possono essere stabiliti da diversi approcci. L'auto-(in)compatibilità può essere determinata dall'autoimpollinazione dei fiori in campo e dal successivo monitoraggio dell'allegagione, o dalle autoimpollinazioni semi-in vivo in condizioni controllate in laboratorio e dall'osservazione di tubi di polline al microscopio14,15,16,17,18 . Le relazioni di incompatibilità tra cultivar possono essere determinate da impollinazioni incrociate in campo o in laboratorio utilizzando polline della cultivar potenziale impollinatrice e dall'identificazione diS-alleli di ciascuna cultivar mediante analisi PCR14,15,16,19,20,21,22 . In specie come la ciliegia dolce o la mandorla, l'auto(in)compatibilità può essere valutata anche mediante l'identificazione di particolari alleli S associati all'autocompatibilità, come S4' nella ciliegia dolce13 o Sf nella mandorla23.
Diversi programmi di allevamento di prugne dei principali paesi produttori stanno rilasciando una serie di nuove cultivar2,14,molte delle quali con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto-(in)compatibilità è determinata da autoimpollinazioni sia sul campo che in laboratorio, seguite da osservazioni di tubi di polline sotto la microscopia a fluorescenza. La selezione delle cultivar impollinatori combina l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico Panreac glaciale</td><td></td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>Blu anilina</td><td>Difco</td><td>8504-88</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico (H3BO4)</td><td>Panreac</td><td>131015.1210</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di calcio 4-idrato (Ca(NO3)2 &punto medio; 4H2O)</td><td>Panreac</td><td>131231.1211</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Imaging Developmet Systems</td><td>UI-1490SE</td><td></td></tr><tr>Digital<td>Camera</td><td>Software Suite Imaging Developmet Systems</td><td>4.93.0.</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix, 10 mM ciascuno</td><td>ThermoSischer Scientific</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Verde DNA polimerasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96&deg;</td><td>VWR-Chemicals</td><td>83804.360</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA da 1Kb (brevetto USA n. 4.403.036) (500pb-12Kb)</td><td>Invitrogen</td><td>15615-016</td><td>Dimensioni: 250&micro; g; Conc: 1.0 &micro; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Sistema di documentazione su gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>Contamani</td><td>Tamaco</td><td>TM-4</td><td></td></tr><tr><td>Software da laboratorio per immagini</td> Sistema di analisi delle immagini <td>Bio-Rad</td><td></td><td>per sistema di documentazione su gel</td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose</td><td>Lonza</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5415 R</td><td>Microscopio</td><td>Z605212</td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>con UV epifluescenza</td><td>Leica</td><td>DM2500</td><td>Filtro eccitatore BP340-390, Filtro barriera LP425</td></tr><tr><td>Microvetrini</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Mini sistema di elettroforesi</td><td>Fisherbrand</td><td>14955170</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15334204</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Deltalab</td><td>200201</td><td>55 mm x 14 mm</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio tribasico (K3PO4&middot; 1.5H2O)</td><td>Panreac</td><td>141513</td><td></td></tr><tr><td>Primer forward 'Pru C2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer forward Pru T2'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer reverse 'PCER'ThermoFisher</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RedSafe Soluzione colorante per acidi nucleici</td><td>iNtRON Biotechnology</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Panreac</td><td>131621.1211</td><td></td></tr><tr><td>Solfito di sodio anidro (Na2SO3)</td><td>Panreac</td><td>131717.1211</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del DNA per piante Speedtools</td><td>Biotools</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer (10X)</td><td>Panreac</td><td>A0972,5000PE</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1861096</tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>T1317</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave verticale Presoclave II</td><td>JP Selecta</td><td>4001725</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisherbrand</td><td>11746744</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare

Establishing Pollination Requirements in Japanese Plum by Phenological Monitoring, Hand Pollinations, Fluorescence Microscopy and Molecular Genotyping

Le cultivar di prugne giapponesi comunemente coltivate sono ibridi interspecifici derivati da incroci tra l'originale Prunus salicina con altre specie di Prunus. La maggior parte degli ibridi presenta un'auto-incompatibilità gametofita, che è controllata da un singolo e altamente polimorfo S-locus che contiene più alleli. La maggior parte degli ibridi coltivati sono auto-incompatibili e hanno bisogno di polline da un donatore compatibile per fertilizzare i loro fiori. Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese sta diventando sempre più importante a causa dell'elevato numero di nuove cultivar con requisiti di impollinazione sconosciuti. In questo lavoro, viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna. L'auto(in)compatibilità è determinata dall'impollinazione manuale sia sul campo che in laboratorio, seguita dal monitoraggio dell'allungamento del tubo pollinico con microscopia a fluorescenza e anche dal monitoraggio della maturazione dei frutti sul campo. La selezione delle cultivar impollinatori viene valutata combinando l'identificazione dei genotipi Smediante analisi PCR con il monitoraggio del tempo di fioritura in campo. Conoscere le esigenze di impollinazione delle cultivar facilita la selezione delle cultivar per la progettazione di nuovi frutteti e consente la diagnosi precoce dei problemi di produttività legati alla carenza di impollinazione nei frutteti consolidati.

Ogni bocciolo di fiore di prugna giapponese contiene un'infiorescenza con 1-3 fiori. Come in altre specie di drupacee, ogni fiore è composto da quattro spirali: carpello, stami, petali e sepali, che si fondono formando una coppa alla base del fiore. Le strutture floreali sono più piccole di altri frutti a nocciolo, con un pistillo corto e fragile circondato dagli stami che contengono una piccola quantità di grani di polline. A piena fioritura, i fiori di ogni infiorescenza appaiono separati su brevi gambi, mostrando i pe...

Viene descritta una metodologia per la determinazione dei requisiti di impollinazione negli ibridi giapponesi di tipo prugna, che combina le impollinazioni sul campo e in laboratorio e le osservazioni dei tubi pollinici sotto la microscopia a fluorescenza con l'identificazione dei genotipi Smediante PCR e il monitoraggio della fioritura per la selezione degli impollinatori.

Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare

The Japanese plum cultivars commonly grown are interspecific hybrids derived from crosses between the original Prunus salicina with other Prunus species. ...

Questo protocollo sta diventando sempre più importante a causa dell'elevato numero di nuove cultivar di prugne giapponesi auto-incompatibili con requisiti di impollinazione sconosciuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di determinare le esigenze di impollinazione delle cultivar combinando due approcci complementari in condizioni di campo e di laboratorio. Questo approccio può essere applicato anche per determinare i requisiti di impollinazione e altre specie di alberi da frutto autoincompatibili come l'albicocca o il ciliegio dolce.Per l'estrazione del polline, raccogliere i boccioli dei fiori allo stadio di palloncino secondo la fase 57 della scala BBCH. Togliete le antere con una rete di plastica e mettetele su carta a temperatura ambiente per 24 ore fino alla deiscenza dell'antera. Setacciare i granuli di polline a maglie fini e conservarli in un tubo di vetro da 10 millimetri con tappo a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Quando il 10-20% dei fiori è aperto, selezionare ed etichettare diversi rami, lasciando da 1.000 a 1.500 fiori per trattamento di impollinazione. Il giorno successivo, quando ci sono più fiori aperti, impollinare ogni fiore usando un pennello con polline della stessa cultivar per l'autoimpollinazione e polline di altre cultivar come controllo dell'impollinazione incrociata. Impollinare ogni giorno fino a quando tutti i fiori sono aperti.Registra i conteggi settimanali dei fiori e dei frutti in via di sviluppo dall'antesi al raccolto per caratterizzare il modello di caduta dei frutti e quantificare l'allegagione finale in ogni trattamento di impollinazione. Raccogli da 50 a 100 fiori allo stadio del palloncino secondo lo stadio 57 della scala BBCH. Evirare 30 fiori per trattamento in laboratorio per l'autoimpollinazione e l'impollinazione incrociata.Fai un taglio fresco sulla base di ogni peduncolo del fiore sott'acqua e posizionalo su un pezzo di schiuma da fiorista bagnata. Utilizzare un pezzo di schiuma per ogni trattamento di impollinazione. Trascorse le 24 ore, impollinare a mano ogni pistillo con il polline raccolto in precedenza utilizzando un pennello fine.Impollinare una serie di pistilli con il polline della stessa cultivar e l'altra serie con il polline di un'altra cultivar compatibile come controllo. Fissare questi pistilli impollinati in una soluzione fissativa di etanolo e acido acetico per almeno 24 ore a quattro gradi Celsius. Spargere il polline di ogni cultivar precedentemente utilizzata come donatore di polline nelle impollinazioni in due piastre di Petri e incubarle a 25 gradi Celsius per 24 ore.Per osservare i granuli di polline, aggiungere due o tre gocce di soluzione di blu di anilina a ciascuna piastra di Petri e osservarli al microscopio a epifluorescenza UV dopo cinque minuti. Contare i granuli di polline vitali e non vitali nei tre campi per capsula di Petri, con ogni campo contenente circa 100-200 granuli di polline in due piastre di Petri per ogni cultivar. Per osservare i tubi pollinici, schiacciare i pistilli ammorbiditi in una goccia di soluzione di blu di anilina all'1% sotto un vetro di copertura su un vetrino.Osservare la crescita del tubo pollinico lungo lo stilo al microscopio con epifluorescenza UV utilizzando il filtro eccitatore BP340-390 e il filtro barriera LP425. Raccogli tre o quattro foglie giovani da ogni cultivar nel campo ed estrai il DNA dalle foglie. Impostare una miscela master per ogni coppia di primer in microprovette da 1,5 millilitri.Aggiungere tutti i reagenti e mescolare accuratamente. Aliquotare 16 microlitri di questa miscela master in ciascuna provetta PCR da 200 microlitri contenente quattro microlitri di DNA modello o di controllo. Mescolateli delicatamente, chiudete i tappi e centrifugate a 2.000 volte G per 30 secondi.Posizionare la provetta nel termociclatore ed eseguire il programma PCR come indicato nel manoscritto del testo. Per stimare la dimensione del frammento mediante elettroforesi su gel, caricare il primo e l'ultimo pozzetto con due microlitri della scala del DNA e tre microlitri del prodotto della PCR negli altri pozzetti. Chiudere la camera e far funzionare il gel a 100 volt per 30 minuti.Osservare il gel sotto la luce UV utilizzando un sistema di imaging su gel. Usa la scala del DNA per stimare la dimensione dei frammenti amplificati e confrontarla con i controlli positivi e negativi. Monitora la fenologia dei diversi alberi di ciascuna cultivar nei diversi anni di fioritura.Stabilisci la durata del periodo di fioritura dal primo all'ultimo fiore aperto. La piena fioritura è considerata quando almeno il 50% dei fiori si trova allo stadio F secondo lo stadio 65 del BBCH. Il modello della caduta dei frutti dei fiori impollinati a mano dopo l'evirazione o l'impollinazione supplementare ha mostrato che la maggior parte dei fiori è diminuita due o tre settimane dopo l'impollinazione, ma il 4% dei fiori autoimpollinati è rimasto nell'albero, indicando che questa cultivar è autocompatibile.I granuli di polline vitali hanno mostrato un tubo pollinico più lungo della sua lunghezza dopo 24 ore nel terreno di coltura e i granuli di polline non vitali non sono germogliati. Durante l'impollinazione, i granuli di polline sono stati trasferiti allo stigma. Ogni granello di polline in germinazione produceva un tubo pollinico, che cresceva attraverso le strutture dei pistilli.Nelle cultivar autoincompatibili, il tubo pollinico ha smesso di crescere nel terzo superiore dello stilo. Tuttavia, nelle cultivar autocompatibili, il tubo pollinico potrebbe crescere attraverso lo stilo, raggiungere l'ovaio e fecondare un ovulo. L'analisi PCR è stata effettuata utilizzando primer provenienti dalle regioni conservate di sRNA di ciliegio dolce e prugna giapponese, consentendo di determinare la dimensione degli alleli S in ciascuna cultivar.È stata calcolata la durata del periodo di fioritura per un totale di quattro anni. La fioritura in condizioni di frutteto ha permesso di determinare quali cultivar coincidono ogni anno al momento della fioritura. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi di utilizzare un numero maggiore di fiori di prugna giapponese per l'impollinazione manuale poiché la percentuale di allegagione è molto bassa rispetto ad altre specie di Prunus.Non è possibile determinare l'autoincompatibilità con approcci molecolari. È necessario un ulteriore lavoro di sequenziamento dell'allele S per valutare se alcuni alleli S sono associati all'autocompatibilità. La combinazione di approcci sul campo e di laboratorio ha portato a informazioni preziose per la progettazione di nuovi frutteti commerciali e può essere utilizzata in altre specie di alberi da frutto.

establishing-pollination-requirements-japanese-plum-phenological

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo sviluppato una metodologia per l'esecuzione di croci in viridis Setaria viridis (S.). Il metodo prevede la potatura pannocchia prima di un trattamento con acqua calda per uccidere polline vitale. Croci sono eseguite seguendo un regime di crescita ben controllata e in genere portato al recupero di 1-7 impollinazione incrociata seme / s per pannocchia.

Metodi per l&#39;esecuzione di Croci nel<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Un nuovo sistema Modello per le Erbe

Per rivelare l'efficacia impollinatore di una data specie di piante, sono stati sviluppati diversi metodi di esperimenti sul campo. Questo studio dimostra i metodi di base di esperimenti sul campo per l'ecologia l'impollinazione utilizzando il caso di studio di Lycoris sanguinea var. Sanguinea e il meccanismo di impollinazione romanzo, rompendo con auricolari impollinazione.

Gli esperimenti sul campo di Ecologia: il caso di<em&gt; Sanguinea Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Qui, presentiamo un protocollo per forzare fioritura di alberi di mandarino in condizioni phytotron. L'acqua lo stress, elevato illuminamento e un fotoperiodo di primavera simulato ammessi fiori vitali ottenute in un breve periodo di tempo. Questa metodologia permette ai ricercatori di avere diversi periodi di fioritura in 1 anno.

Fioritura forzata in alberi di mandarino in condizioni di Phytotron

Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell'Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione

Presentiamo una metodologia per stabilire i requisiti di impollinazione dell'albicocca(Prunus armeniaca L.) che combinano la determinazione dell'auto-in) della microscopia a fluorescenza con l'identificazione del genotipo S mediante l'analisi PCR.

Determinazione delle relazioni di auto-compatibilità in Apricot Combinando l'impollinazione manuale, la microscopia e le analisi genetiche

Questo protocollo fornisce un metodo rapido per determinare la compatibilità e l'incompatibilità del polline nelle cultivar di agrumi.

Determinazione delle relazioni di auto-(in)compatibilità e inter-(in)compatibilità negli agrumi mediante impollinazione manuale, microscopia e analisi del genotipo S

Qui, descriviamo un miglioramento del metodo semi-in vitro (SIV) per osservare la guida e la ricezione del tubo pollinico in Arabidopsis thaliana, che aumenta la ricettività degli ovuli. Il metodo SIV cum septum ad alta produttività può essere accoppiato con linee marcatrici di gametofiti e biosensori geneticamente codificati per monitorare il processo dinamico di fecondazione.

Imaging dal vivo della ricezione del tubo di polline di Arabidopsis e doppia fecondazione utilizzando il metodo semi-in vitro del setto di cum

Un metodo migliorato per misurare i profili di idratazione del polline in Arabidopsis thaliana è descritto qui. Il nuovo metodo offre una risoluzione più elevata, non è invasivo ed è altamente riproducibile. Il protocollo rappresenta un nuovo strumento per una più fine dissezione dei processi che regolano le prime fasi dell'impollinazione.

Un saggio biologico di idratazione del polline in vivo ad alta risoluzione, a granulo, singolo grano per Arabidopsis thaliana

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Per studiare il meccanismo di utilizzo dei lipidi nelle membrane del sacco vitellino durante le ultime fasi dello sviluppo embrionale aviario, abbiamo creato un sistema primario di coltura di cellule epiteliali endodermiche embrionali di quaglia giapponese.

Primaria endodermico cellule epiteliali Cultura dal tuorlo Sac membrana di giapponesi Quail embrioni

Scopri come determinare i requisiti di impollinazione nelle prugne giapponesi combinando impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione PCR. Questo metodo integrato aiuta a identificare impollinatori efficaci per cultivar auto-incompatibili.

Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare (Video) | JoVE Journal

Stabilire i requisiti di impollinazione nella prugna giapponese mediante monitoraggio fenologico, impollinazione manuale, microscopia a fluorescenza e genotipizzazione molecolare

Esplora altri video