Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i meccanismi che regolano l'invasione delle cellule tumorali nella matrice extracellulare in tempo reale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza un semplice dispositivo di imaging sferoide, che rende il test di invasione dello sferoide più facile da configurare e migliora la sua efficienza e costo. Mentre dimostriamo usando il saggio di invasione sferoide per modellare il carcinoma mammario, questo saggio è un modello eccellente per l'invasione di qualsiasi tumore solido nel tessuto sano circostante.

Dopo la stampa 3D del distanziale, pesare un rapporto 10:1 tra polimero di base e cross-linker in una tazza di plastica e utilizzare una pipetta monouso per mescolare accuratamente la soluzione PDMS risultante nella tazza. Posizionare la tazza in una camera a vuoto e rilasciare rapidamente la pressione del vuoto per rimuovere l'aria intrappolata sulla superficie della miscela e dissipare le bolle d'aria rimanenti. Incubare il distanziale stampato in 3D a 100 gradi Celsius per cinque minuti per aumentarne la flessibilità e pulire due lastre di vetro con isopropanolo al 100%.

Posizionare il distanziale in modo che sia a filo tra le due piastre pulite e posizionare due grandi clip del legante sul bordo inferiore e una sull'angolo superiore per sigillare lo stampo sui bordi esterni delle piastre. Ispezionare la parte superiore dello stampo per assicurarsi che il distanziale sia a filo con le piastre di vetro e utilizzare una pipetta monouso con circa due centimetri tagliati dalla punta per aggiungere lentamente ma continuamente la miscela PDMS all'angolo in alto a sinistra dello stampo. Una volta riempito l'intero stampo, posizionare lo stampo nella camera a vuoto per rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate, prima di polimerizzarlo per un'ora a 100 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, posizionare lo stampo a temperatura ambiente. Quando è fresco al tatto, rimuovere le clip del legante e le lastre di vetro dal distanziale contenente il PDMS polimerizzato e utilizzare una lama di rasoio per tagliare la guarnizione che è stata creata su tutti e quattro i lati dello stampo tra il distanziale e la piastra di vetro. Smontare lo stampo per rivelare il foglio PDMS nel distanziale e utilizzare le pinzette per rimuovere con cura il foglio PDMS dal distanziale.

Posizionare il foglio su un tappetino da taglio e utilizzare un punzone di biopsia per perforare un disco PDMS di 17,5 millimetri di diametro, quindi perforare tre fori di 5,5 millimetri distribuiti uniformemente nel disco. Utilizzare il nastro adesivo per rimuovere eventuali particelle di polvere da ogni inserto e attaccare gli inserti puliti su un pezzo di nastro a doppia parte. Avvolgere il nastro intorno al coperchio di una piastra di Petri di 10 centimetri e posizionare il coperchio in una macchina al plasma insieme a piatti di fondo in vetro aperti da 35 millimetri.

Attivare gli inserti e il vetro con un minuto di trattamento al plasma a 300 millitorrs e utilizzare una pinzetta per attaccare rapidamente il lato trattato di ogni inserto alla parte in vetro di un piatto inferiore in vetro trattato per inserto. Una volta applicati tutti gli inserti, utilizzare il dito e il pollice del puntatore per applicare una pressione uniforme su ogni inserto ruotando il piatto per fissare saldamente gli inserti alle stoviglie. Una volta fissati tutti gli inserti, incubare i dispositivi di imaging sferoide risultanti per 20 minuti a 60 gradi Celsius, prima di eseguire un secondo ciclo di trattamento al plasma come dimostrato.

Dopo il secondo trattamento, aggiungere 35 microlitri di soluzione di rivestimento appena preparata ad ogni foro di inserto. Dopo un'ora a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di rivestimento e risciacquare il dispositivo tre volte con acqua distillata. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 35 microlitri di soluzione di cross-linking ad ogni foro per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, sciacquare il dispositivo tre volte con acqua distillata come dimostrato, prima di riempire ogni dispositivo con 70%etanolo per un'incubazione di 30 minuti sotto la luce UV. Al termine della sterilizzazione, sciacquare i dispositivi tre volte con acqua distillata e aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di stoccaggio a ciascun dispositivo. Per incorporare gli sferoidi nel collagene, lavare i dispositivi tre volte con tre millilitri di PBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare asciugare completamente i dispositivi, prima di aggiungere uno sferoide in 30 microlitri di college appena preparato una soluzione in un unico foro dell'inserto e avviare un timer. Dopo aver confermato la presenza dello sferoide nel foro, aggiungere sferoidi agli altri due fori come dimostrato. Utilizzare una punta di pipetta da 10 microliter per recentizzare tutti gli sferoidi che si trovano vicino al bordo pdms o per separare gli sferoidi se vengono dispensati più sferoidi e arrestare il timer.

Per centrare verticalmente lo sferoide nello strato di collagene, dopo la semina, capovolgere il dispositivo e incubare il dispositivo a 37 gradi fino a quando il collagene non si polimerizza, invertendo l'orientamento del dispositivo ogni due minuti per un totale di 30 minuti, quindi aggiungere 2,5 millilitri di mezzo per dispositivo e acquisire un'immagine degli sferoidi nel momento dell'ora zero. L'uso di un dispositivo di immagine sferoide facilita l'efficiente incorporamento e la registrazione time-lapse dell'invasione delle cellule tumorali all'interno del collagene o tramite l'imaging longitudinale. Mentre questo sferoide è stato immaginato longitudinalmente nel corso di sei giorni richiedendo l'espressione stabile di proteine fluorescenti citoplasmatiche e / o nucleari, un imaging longitudinale simile può essere eseguito in un periodo di tempo più breve utilizzando l'etichettatura della tintura.

Gli sferoidi possono anche essere fissati e immunoetichettati. Ad esempio, questi sferoidi sono stati immunoetichettati per epiteliale-cadherina, cortattatina e F-actina. In queste immagini, è possibile osservare un'illustrazione passo-passo della procedura di elaborazione delle immagini utilizzando la macro Fiji per misurare l'area dello sferoide nel tempo.

Assicurarsi di erogare un singolo sferoide in ogni foro del dispositivo di imaging sferoide e di posizionare lo sferoide al centro del foro sia in direzione XY che Z. Il design del dispositivo può essere facilmente modificato modificando le dimensioni e la disposizione dei fori, degli inserti e delle stoviglie inferiori in vetro per adattarsi a una maggiore produttività dello sferoide.