Name: Profilazione metabolica ad alto rendimento per perfezionamenti del modello di microalghe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Scopri la profilazione metabolica ad alto rendimento utilizzando la tecnologia phenotype microarray su Chlamydomonas reinhardtii. Questo metodo computazionale consente di caratterizzare le attività metaboliche cellulari e perfezionare i modelli di rete metabolica nelle microalghe.

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Un importante supporto per questo lavoro è stato fornito dal NYUAD Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), finanziato da Tamkeen nell'ambito della sovvenzione del New York University Abu Dhabi Research Institute (73 71210 CGSB9) e nyu Abu Dhabi Faculty Research Funds (AD060). W.F. è stato inoltre supportato dal Hundred Talents Program della Zhejiang University. Ringraziamo Ashish Jaiswal per l'aiuto nella registrazione del video. Ringraziamo Hong Cai per aver generato i dati del fenotipo metabolico.

1. Esperimenti di microarray fenotipo
<ol><li>Ottenere il ceppo CC-503 di C. reinhardtii dal Chlamydomonas Resource Center dell'Università del Minnesota, USA (https://www.chlamycollection.org).</li>
	<li>Far crescere le cellule in mezzi freschi di Tris-Acetato-Fosfato (TAP)19 con concentrazioni finali di 400 μg/mL di timentin, 50 μg/mL di ampicillina e 100 μg/mL di kanamicina (per inibire la crescita batterica) sotto i 400 micromol fotoni/m2s, a 25 °C, per due giorni fino alla fase intermedia.</li>
	<li>Girare la coltura a 2.000 x g per 10 minuti a 22 °C ed eliminare il surnatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Preparare un mezzo TAP fresco contenente lo 0,1% di colorante viola tetrazolico "D". NOTA: Modificare i supporti TAP in questo passaggio per escludere alcuni nutrienti a seconda della categoria di metaboliti testati in ciascuna piastra (ad esempio, escludere il cloruro di ammonio per le piastre di origine azotata).</li>
	<li>Ripresa del pellet in un mezzo TAP fresco preparato (dal punto 1.2) ad una concentrazione finale di 1 x 106 celle/ml.</li>
	<li>Utilizzare piastre di analisi di array di composti chimici (fonti di carbonio, fonti di azoto, piastre di fonti di fosforo e zolfo e fonti di azoto peptidico).</li>
	<li>Inoculare un'aliquota di 100 μL di mezzi contenenti cellule in ciascun pozzetti delle piastre di dosaggio. NOTA: Assicurarsi di duplicare i test.</li>
	<li>Strisciare le cellule su piastre di estratto di lievito / peptone ed eseguire la colorazione del grammo, come in Smith et al. 20 prima e dopo il test per monitorare la contaminazione batterica.</li>
	<li>Inserire le piastre di analisi dell'array di composti chimici nel sistema di lettura delle micropiasche.</li>
	<li>Incubare tutte le piastre a 30 °C per un massimo di 7 giorni e programmare il sistema di lettura delle micropiasche per leggere il cambio di colore del colorante ogni 15 minuti. NOTA: poiché la maggior parte dei lettori di micropiasche non fornisce una fonte di luce continua durante l'incubazione, le alghe dovrebbero essere in grado di effettuare la respirazione eterotrofica.</li>
</ol>2. Analisi dei dati
<ol><li>Esportare i dati cinetici grezzi dal lettore di micropiasche come file CSV, che verranno successivamente utilizzati come input per il pacchetto Omnilog Phenotype Microarray (OPM) in R. Aggiungere le informazioni biologiche come metadati (ad esempio, designazione del ceppo, mezzi di crescita, temperatura, ecc.).<ol>
<li>Utilizzo del software di conversione dati PM Kinetic; caricare i file di dati D5E e convertirli in file OKA utilizzando le seguenti righe di comando nel software di analisi cinetica PM: Carica | Importa (individuare la cartella dei file OKA) | Popolare i filtri | Importa | Aggiungi tutte le piastre | Chiudere. Esporta | scegliere i dati di lettura (Kinetic), scegliere il formato (CSV) (Tabulate Header)e scegliere le lastre (ogni piastra (singoli file)) | Esportare i dati | Salvare.
</li>
		<li>Per eseguire l'analisi dei dati Phenotype Microarray (PM), utilizzare il pacchetto software OPM21,22 che viene eseguito all'interno dell'ambiente software R. Il pacchetto, l'esercitazione e la documentazione di riferimento sono disponibili all'indirizzo: http://www.goeker.org/opm/. In RStudio, un'interfaccia utente grafica per R, installare il pacchetto opm e le relative dipendenze utilizzando i seguenti comandi: fonte (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) biblioteca (opm)
</li>
		<li>Passare alla directory che contiene i file CSV dei dati cinetici e importare i dati utilizzando la funzioneopm read_: x <- read_opm(".", convert="grp", include=list ("csv:"))
</li>
		<li>Aggregare e discretizzare i dati cinetici utilizzando la stima curva-parametro. Per (i in 1 :length(x)) { x[[i]] <Do _aggre(x[[i]], boot = 0 L, core = 1 L, metodo ="spline", opzioni = set_spline_options("smooth.spline")) x[[i]] <- do_disc(x[[i]], cutoff = FALSO) } #Collection dei metadati metadata <- collect_template(".") metadata$Strain <- c("BLANK","CC- 503") for (I in 1 :length(x)) {x[[i]] <- include_metadata(x[[i]], md = metadata, replace = TRUE)}
</li>
		<li>Utilizzare la funzione xy_plot per mappare le misurazioni della respirazione (o della crescita) (asse y) in funzione del tempo (asse x) per le piastre a 96 pozzetti analizzate. print (xy_plot(x[[ 1]], include ="Strain", theor.max = FALSE))
</li>
		<li>Visualizza i dati come una mappa di calore utilizzando la funzione level_plot per consentire una rapida panoramica comparativa dei dati cinetici. level_plot(x, main = list(), colors = opm_opt("color.borders"), panel.headers = metadata$Strain, cex = NULL, strip.fmt = list(), striptext.fmt = list(), legend.sep =" ", space ="Lab", bias = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>Estrarre importanti informazioni biologiche, i parametri della curva, dalle curve cinetiche grezze e includere la fase di ritardo (λ), il tasso di crescita (μ), la respirazione cellulare massima (A) e l'area sotto la curva (AUC)21. Per identificare i metaboliti positivi, utilizzare i valori A del controllo negativo, che rappresenta la reattività abiotica del colorante con il mezzo, oltre al bianco di ciascuna piastra microwell come valori di sottrazione di fondo. La funzione extract viene utilizzata per ottenere il parametro A. opm_opt("curve.param") param <- estratto (x, as.labels = list("Ceppo")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identificazione di reazioni e geni associati a nuovi metaboliti
<ol><li>Cerca KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (http://www.genome.jp/kegg/) e MetaCyc (http://metacyc.org/) per identificare i numeri della Commissione Enzimatica (ECs) per le reazioni che utilizzano metaboliti trovati da array di composti chimici23,2423,24.</li>
	<li>Utilizzare i numeri EC identificati come base di ricerca in più risorse di annotazione algale disponibili come Joint Genome Institute (JGI), Phytozome (http://www.phytozome.net) e pubblicazioni peer-reviewed23,25,26,27.</li>
	<li>Se una query non restituisce alcuna evidenza genetica per un dato numero CE, identificare le proteine associate rilevanti in altri organismi, a partire dalle specie più vicine al C. reinhardtii, quindi effettuare una ricerca basata sul profilo utilizzando il server NCBI PSI-BLAST con impostazioni predefinite e utilizzare proteine non ridondanti (nr) in C. reinhardtii (taxid:3055) per identificare i geni candidati associati allareazione 12.</li>
	<li>Cura manualmente gli hit PSI-BLAST con valori E di < 0,05 per la pertinenza al numero EC cercato interrogando tali hit BLAST tramite i server di previsione del dominio proteico EMBL-EBI Pfam (http://pfam.xfam.org/search) o InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Si noti che le ultime due scansioni sono passaggi critici per garantire l'identificazione della corretta attività enzimatica per la proteina.</li>
</ol>4. Perfezionamento e valutazione del modello
<ol><li>Utilizzare l'ultima versione di COBRA Toolbox v.3.028in MATLAB29,30piattaforma per eseguire i seguenti passaggi per il perfezionamento del modello. COBRA Toolbox può essere installato seguendo i passaggi in: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html . In alternativa, si noti che COBRA Toolbox è implementato anche in altri linguaggi di programmazione open source, come Python (COBRApy31) ed è disponibile all'indirizzo: https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>Dopo aver installato COBRA Toolbox v.3.0, apri MATLAB ed esegui il seguente comando per inizializzare la casella degli strumenti: initCobraToolbox;</li>
		<li>Aggiungere le reazioni identificate con i loro geni associati al modello metabolico, come iRC1080, utilizzando le funzioni COBRA Toolbox addReaction e changeGeneAssociation. Passare alla directory che contiene il modello iRC1080, scaricato da http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 ed eseguire i seguenti comandi per caricare il modello, rinominarlo e aggiungere una nuova reazione e il gene associato. Load('iRC 1080 .mat') modelNew = iRC 1080; modelNew = addReaction(modelNew, 'D-ALA 2' , ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-aladata[c]' , 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ],false); modelNEW = changeGeneAssociation(modelNew, ... «D-ALA 2», «au.g 14655 _t 1»);</li>
		<li>In alcuni casi, quando il metabolita non viene prodotto intracellulare ma viene prelevato dal mezzo, aggiungere al modello le reazioni di trasporto per i nuovi metaboliti. Queste reazioni di trasporto rappresentano la diffusione passiva di un metabolita dal mezzo extracellulare al citosol. Inoltre, aggiungere una corrispondente reazione di scambio artificiale utilizzando la funzione addExchangeRxn per immettere o emettere il metabolita nel mezzo extracellulare. modelNew = addReaction(modelNew, 'CYCPt' , ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1 1 ],true)' modelNew = addExchangeRxn(modelNew, 'cycp[e]' ,- 1000 ,1000 );</li>
		<li>Testare il comportamento del nuovo modello risultante, ad esempio iBD1106, eseguendo l'analisi del bilancio di flusso (FBA) utilizzando la funzione optimizeCbModel in condizioni di luce e buio per la massimizzazione della biomassa come funzione obiettivo. Per la crescita della luce, impostare i limiti inferiore e superiore delle reazioni luminose della lito' solare PRISM a 646,07 (velocità massima). Per una crescita oscura, impostare i limiti di tutte le reazioni luminose PRISM a zero. Utilizzare la funzione Biomassa definita in precedenza10 per la crescita in condizioni di buio e luce. La soluzione FBA produrrà due vettori corrispondenti ai flussi di reazione (solution.v) e al costo ridotto (solution.w), nonché un vettore corrispondente ai prezzi ombra dei metaboliti (solution.y). %Simula la crescita in condizioni di luce: modelNew = changeRxnBounds(modelNew,{ ... % «PRISM_solar_litho» , ... 'PRISM_solar_exo' , ... 'PRISM_incandescent_ 60 W' , ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W' , ... 'PRISM_metal_halide' , ... 'PRISM_high_pressure_sodium' , ... 'PRISM_growth_room' , ... 'PRISM_white_LED' , ... «PRISM_red_LED_array_ 653 nm» , ... «PRISM_red_LED_ 674 nm» , ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W' , ... 'PRISM_design_growth' , ... }, 0, 'b' ); modelNew = changeObjective(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = optimizeCbModel(modelNew, 'max');</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.1.4 per iRC1080 per confrontare le soluzioni FBA ottenute per iBD1106 con quelle ottenute per iRC1080.</li>
		<li>È disponibile una gamma di metodi COBRA che possono essere utilizzati per confrontare i modelli (ad esempio, analisi della variabilità del flusso, studi di delezione genica, analisi di robustezza, previsioni di divisione del flusso, FBA, campionamento, ecc.). Tutorial dettagliati sono disponibili su https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html. Qui, viene fornito un esempio in cui il modello iRC1080 viene confrontato con la sua versione raffinata, iBD1106, ottenendo i prezzi ombra (sensibilità della funzione obiettivo della biomassa ai cambiamenti nella variabile di sistema) dei metaboliti contabilizzato in ciascun modello. Ottenere i prezzi ombra per i metaboliti: shadowPrices = table(modelNew.mets, ... modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fenotipizzazione metabolica della microalga verde, C. reinhardtii,è stata descritta qui utilizzando piastre di analisi PM ad alta produttività e un PMI non modificato. I saggi sono stati utilizzati per un totale di 190 fonti di carbonio (PM01 e PM02), 95 fonti di azoto (PM03), 59 fonti di fosforo e 35 fonti di zolfo (PM04), insieme a fonti di azoto peptidico (PM06-08). La respirazione positiva è stata osservata per 148 nutrienti (un test positivo per l'utilizzo della fonte C, quattro saggi positivi per ciascun utilizzo della sorgente S e della sorgente P e 139 saggi positivi per l'utilizzo della sorgente N). I substrati o i nutrienti (carbonio, azoto, fosforo o zolfo) componenti del fluido non devono essere aggiunti al mezzo definito quando applicati alle micropiasche PM pertinenti che testano ciascuna di tali fonti.
Il metodo qui mostrato è efficace per caratterizzare i fenotipi delle microalghe metaboliche che possono essere utilizzati per estendere i modelli di rete metabolica esistenti o dirigere la ricostruzione di nuovi modelli. Inoltre, poiché i requisiti nutrizionali della maggior parte delle microalghe non sono noti, questa piattaforma può essere utilizzata per definirli rapidamente. Nelson et al. 43 avevano applicato con successo questi metodi per identificare nuovi composti che supportano la crescita delle microalghe Chloroidium sp. UTEX 3007 e hanno utilizzato le informazioni ottenute per definire i metaboliti di ingresso delle specie, che, a differenza di Chlamydomonas, includono 40 diverse fonti di carbonio.
Uno dei principali limiti del PM per la profilazione delle microalghe è che il PMI non ha illuminazione nella camera di incubazione e le microalghe devono essere in grado di svolgere il metabolismo eterotrofico. L'assenza di luce potrebbe influenzare l'interpretazione dei modelli che incorporano la luce per calcolare i flussi metabolici. Le coppie di geni con funzioni di coordinamento si sono co-evolute per costituire hub di rete metabolica e la distinzione tra hub di rete fotosintetici e non fotosintetici può essere fatta44. In generale, gli hub di rete fotosintetici (cioè i nodi altamente connessi nel modello) sarebbero lasciati fuori dai modelli eterotrofici. Per scopi pratici, la modellazione dell'eterotrofismo nelle specie mixotrofiche dovrebbe omettere le reazioni note per essere guidate dalla luce e tenere conto delle differenze di bilancio energetico tra le condizioni. Pertanto, la modellazione del metabolismo dipendente dalla luce e indipendente dalla luce è una pratica standard nella modellazione metabolica di Chlamydomonas6,45.
Alcune microalghe verdi, come Le Trebouxiofite, sono note per assimilare una varietà di molecole di carbonio per la crescita, e si pensa che questo sia sorto dalla loro lunga storia evolutiva come membri dei licheni46. Mentre le clorofite come Chlamydomonas possono utilizzare l'acetato per la crescita, la microalga marina marrone Tisochrysis lutea, nota per il suo potenziale di produrre commercialmente acidi grassi polinsaturi a catena molto lunga (VLC-PUFA), non può usare acetato ma può usare il glicerolo per lacrescita 47. Concentrazione di biomassa superiore a 100 g l−1 peso della cella secca è stata raggiunta con clorella con aggiunta ottimizzata di fonti di carbonio organico in modalità batch alimentata48. Inoltre, l'aggiunta di zucchero alla clorellavulgaris può elevare il suo sequestro di CO2, fornendo così un beneficio additivo durante la crescita fotosintetica49. La maggior parte delle microalghe eterotrofiche può anche crescere mixotroficamente, ma la Chlorophyte Chromochloris zofingiensis ha dimostrato di interrompere la fotosintesi con l'aggiunta di zucchero50.
Le diatomee, appartenenti alla divisione Bacillariophyta, sono un gruppo importante di fitoplancton. Sebbene la maggior parte delle diatomee possa crescere solo fotoautotroficamente, alcune di esse possono essere coltivate mixotroficamente o eterotroficamente51. Ad esempio, il glicerolo è stato trovato per sostenere la crescita alla luce in assenza di CO2 in alcune diatomee, tra cui la specie modello Phaeodactylum tricornutum52. Inoltre, alcune diatomee bentoniche come Nitzschia linearis possono crescere sui carboidrati al buio53. È probabile che estenda i saggi di PM alle diatomee e ad altri gruppi algali integrando adeguate fonti di carbonio organico per consentire alle cellule di crescere eterotroficamente, e una strategia di mixotrofia può anche essere potenzialmente utilizzata per le microalghe autotrofiche obbligate che forniscono un apporto di luce minimamente richiesto.
Per valutare la riproducibilità dei dati, si consiglia vivamente di eseguire test duplicati per tutte le piastre. Un saggio può essere considerato positivo solo se, dopo sottrazione dal controllo negativo e dai rispettivi pozzi vuoti, l'assorbanza (valore PMI) è positiva. Questa descrizione, in presenza del composto testato, è un riflesso della reazione abiotica del colorante con il mezzo.

L'ottimizzazione del metabolismo algale per una produzione migliorata e stabile di metaboliti mirati richiede lo sviluppo di complesse strategie di ingegneria metabolica attraverso analisi a livello di sistema delle reti metaboliche. I modelli di rete metabolica possono guidare i progetti razionali per il rapido sviluppo di strategie di ottimizzazione1,2,3,4. Sebbene siano state sequenziate circa 160 specie microalgali5, ci sono, a nostra conoscenza, solo 44 modelli metabolici algali disponibili4,6,7. A causa della difficoltà di ottenere dati fenotipici metabolici ad alto rendimento per la convalida sperimentale delle informazioni genomiche, la ricostruzione di modelli di rete di alta qualità è in ritardo rispetto al rapido sviluppo del sequenziamento del genoma algale.
C. reinhardtii è un interessante sistema modello per studi basati su algali. Questa specie può crescere fotoautotroficamente o eterotroficamente ed è stata ampiamente utilizzata come organismo modello nella ricerca di base e applicata. La sua sequenza genomica è stata pubblicata nel 20078,con modelli metabolici su scala genomica successivamente ricostruiti per le specie9,10,11. Il modello in scala genomica per C. reinhardtii (iRC1080) è stato ricostruito da Chang et al. 10 basato su prove genomiche e di letteratura (che comportano ~ 250 fonti). Ha 1.706 metaboliti con 2.190reazioni 10; tuttavia, la completezza del modello non ha potuto essere verificata al di là delle prove sperimentali pubblicate disponibili all'epoca.
La tecnologia dei microarray fenotipi (PM) è una piattaforma ad alto rendimento in grado di fornire informazioni di profilazione metabolica per microrganismi eterotrofi e cellule di coltura tissutale. In particolare, può essere utilizzato per affrontare il divario di conoscenza fenotipo-genotipo nelle microalghe, come riportato per la prima volta per Chlamydomonas reinhardtii12 e successivamente per una specie di Chloroidium13 e Chlorella14. Studiando le risposte cellulari a migliaia di metaboliti, molecole di segnalazione, osmoliti e molecole emozionali, i saggi PM possono fornire un profilo metabolico funzionale e offrire approfondimenti sulla funzione, il metabolismo e la sensibilità ambientale15,16,17. In particolare, i saggi PM rilevano l'utilizzo dei metaboliti delle cellule in micropiasche a 96 pozzette con diversi nutrienti, metaboliti o osmoliti contenuti in ciascun pozzetta. Inoltre, è anche possibile saggiare molecole bioattive, come antibiotici e ormoni. Come determinato dall'intensità della produzione di colore mediante la riduzione del NADH di un colorante redox a base di tetrazolio, l'utilizzo metabolico dei substrati viene valutato in termini di respirazione cellulare15,16,17. Gli esperimenti in micropiasche a 96 pozzette possono essere monitorati e determinati automaticamente nel tempo con la piattaforma PHENOTYPE Microarray Instrument (PMI). Venti micropiastre a 96 pozzetto sono progettate per rappresentare i metaboliti comuni per studiare i fenotipi cellulari per utilizzare fonti di carbonio, azoto, zolfo e fosforo, insieme a diversi effetti osmotici / ionici e pH. La tecnologia PM è stata utilizzata con successo per l'aggiornamento e l'aggiornamento di una serie di modelli metabolici su scala genomica esistenti per microrganismi15,16,17,18.
Il protocollo e i dati mostrati qui si basano su lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12 Il lavoro presentato descrive in dettaglio l'uso del metodo di analisi del PM per caratterizzare i fenotipi metabolici delle microalghe e per espandere un modello metabolico algale esistente di C. reinhardtii, nonché per guidare la ricostruzione di nuovi modelli metabolici.

<table><tbody><tr><td>Ampicillina</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per saggi Biolog [ PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii ceppo CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center presso l'Università del Minnesota, USA.</td><td></td><td>Reggenti dell'Università del Minnesota</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazolio Viola Colorante " D"</td><td>Biolog, Hayward, CA, Stati Uniti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

profilazione metabolica ad alto rendimento per perfezionamenti del modello di microalghe

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

I modelli metabolici sono ricostruiti sulla base dell'annotazione del genoma disponibile di un organismo e forniscono strumenti predittivi per studiare i processi metabolici a livello di sistema. I modelli metabolici su scala genomica possono includere lacune e reazioni che non sono verificate sperimentalmente. I modelli ricostruiti di specie microalgali recentemente isolate comporteranno debolezze a causa di queste lacune, poiché di solito ci sono scarse prove biochimiche disponibili per il metabolismo di tali isolati. La tecnologia del fenotipo microarray (PM) è un metodo efficace e ad alto rendimento che determina funzionalmente le attività metaboliche cellulari in risposta a una vasta gamma di metaboliti in entrata. La combinazione dei saggi fenotipici ad alto rendimento con la modellazione metabolica può consentire di ricostruire o ottimizzare rapidamente i modelli di rete metabolica esistenti fornendo prove biochimiche per supportare ed espandere le prove genomiche. Questo lavoro mostrerà l'uso di saggi PM per lo studio delle microalghe utilizzando come esempio la specie modello di microalgale verde Chlamydomonas reinhardtii. L'evidenza sperimentale per oltre 254 reazioni ottenute da PM è stata utilizzata in questo studio per espandere e perfezionare un modello di rete metabolica di C. reinhardtii su scala genomica, iRC1080, di circa il 25%. Il protocollo creato qui può essere utilizzato come base per profilare funzionalmente il metabolismo di altre microalghe, compresi i mutanti noti delle microalghe e nuovi isolati.

Questo protocollo dimostra l'uso di una piattaforma tecnologica di microarray fenotipo (PM) per definire i requisiti metabolici di Chlamydomonas reinhardtii, una microalga verde, e perfezionare un modello di rete metabolica esistente.

Profilazione metabolica ad alto rendimento per perfezionamenti del modello di microalghe

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

La tecnologia phenotype micro-array è un metodo efficace ad alto rendimento che determina funzionalmente le attività metaboliche cellulari in risposta a una vasta gamma di metaboliti di ingresso. L'utilizzo in questa tecnologia è misurato sotto forma di respirazione cellulare determinata dalla quantità di sviluppo del colore prodotta dalla riduzione del NADH di un colorante redox a base di tetrazolio. In questo lavoro, introdurremo l'uso di saggi di micro array fenotipici nel contesto di microalghe utilizzando specie modello Chlamydomonas reinhardtii.L'obiettivo di questo studio è quello di stabilire un metodo affidabile per caratterizzare la fenotipizzazione metabolica delle microalghe che può essere utilizzato per espandere i modelli di rete metabolica algale esistenti o guidare la ricostruzione di nuovi modelli. Chlamydomonas reinhardtii ceppo CC-503 può essere ottenuto dal centro risorse Chlamydomonas presso l'Università del Minnesota USA. Far crescere le cellule in mezzi grassi freschi di Tris-acetato fosfato fino alla fase intermedia.Controllare le cellule al microscopio per assicurarsi che siano in buone condizioni e senza alcuna contaminazione. Ruotare la cultura a 2000 G-force per 10 minuti. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet.Preparare un mezzo di rubinetto fresco contenente lo 0,1% di colorante viola tetrazolio D"Aggiungi diversi antibiotici tra cui Timentin, Ampicillina e Kanamicina ai mezzi per inibire la crescita batterica. I mezzi grassi e questo passaggio dovrebbero essere omessi dai nutrienti, a seconda di ciascun tipo di piastra. Sospendere nuovamente il pellet e il mezzo di rubinetto fresco a una concentrazione finale di 1 milione di celle per millilitro.Utilizzare piastre di analisi di array di composti chimici, come fonti di carbonio, fonti di azoto, piastre di fosforo e zolfo e fonti di azoto peptidico. Inoculare 100 microlitri adeguati di supporti autocontenenti in ciascun pozzo delle tavole del saggio. Assicurati di duplicare i test.Va notato che in questa fase, le cellule dovrebbero essere testate con colorazione gram-negativa prima e dopo il test per monitorare la contaminazione batterica. Inserire le piastre di analisi dell'area del composto chimico nel sistema di lettura delle micropiasche. Incubare tutte le piastre a 30 gradi per un massimo di sette giorni e programmare il sistema di lettura delle micropiasche per leggere il cambio di colore del colorante ogni 15 minuti.Poiché la maggior parte dei lettori di micropiasche non fornisce una fonte di luce continua durante l'incubazione, le alghe dovrebbero essere in grado di effettuare la respirazione eterotrofica. Esporta i dati cinetici grezzi dal lettore di micropiasche come file CSV, che verranno successivamente utilizzati come input per il pacchetto software phenotype microarray e il nostro software. Per eseguire l'analisi dei dati del fenotipo microarray, utilizzare il pacchetto software OmniLog phenotype micro Erik OPM che viene eseguito all'interno dell'ambiente software R.In R studio, l'interfaccia utente grafica per R, installare il pacchetto OPM e le sue dipendenze utilizzando i comandi dettagliati nel manoscritto. Passare alla directory che contiene i file CSV dei dati cinetici e importare i dati utilizzando la funzione OPM di lettura. I dati cinetici possono essere aggregati e discretizzati utilizzando la stima dei parametri pref.L'utilizzo della funzione XY plot consente di mappare le misurazioni della respirazione o della crescita in funzione del tempo per le piastre a 96 pozzetti di saggio. I dati possono essere visualizzati come una mappa di calore utilizzando il grafico del livello di funzione per consentire una rapida panoramica comparativa dei dati cinetici. Il passo successivo è identificare le reazioni e i geni associati ai nuovi metaboliti.In caso di presenza di un modello esistente per le alghe, l'analisi dei dati dal sistema di microarray fenotipo può essere utilizzata per perfezionare questo modello. Qui presentiamo la pipeline che abbiamo utilizzato per il perfezionamento della rete metabolica su scala genomica per il modello Chlamydomonas utilizzando i dati del microarray fenotipo. Quando un nuovo composto risulta positivo per l'utilizzo, i profili di reazione rilevanti del composto vengono definiti utilizzando la base di conoscenza metabolica, fornendo i numeri di commissione enzimatica associati.Il primo passo è quello di cercare Kegg e MetaCyc per identificare i numeri di commissione enzimatica, ECs, per le reazioni utilizzando metabolizzato trovato dagli array di composti chimici. Successivamente, utilizziamo i numeri EC identificati come base di ricerca in più risorse di annotazione algale disponibili, come Joint Genome Institute, JGI, Phytozome e pubblicazioni peer reviewed. Le reazioni e i metaboliti vengono aggiunti al modello di rete metabolica Chlamydomonas reinhardtii basato su COBRA, iRC1080, per espandere e perfezionare il modello.Se non si trovano prove genetiche a sostegno del numero CE, è possibile eseguire una ricerca basata sul profilo come NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, per identificare i geni candidati associati alla reazione. I risultati vengono quindi valutati manualmente. Coloro che superano questo passaggio QC con valori E inferiori a 0,05 per la pertinenza ai numeri EC di ricerca, vengono quindi aggiunti al modello metrico.L'ultimo passo di questo protocollo è perfezionare il modello, valutare e confrontare i modelli. Utilizza l'ultima toolbox COBRA versione 3.0 e la piattaforma MATLAB per eseguire i passaggi per il perfezionamento del modello. Dopo aver installato la casella degli strumenti Cobra, è possibile scaricare il modello iRC1080.Quindi, in MATLAB, la prima cosa da fare è passare alla cartella contenente il modello di riferimento, iRC1080. Aggiungere le reazioni identificate con i loro geni associati al modello metabolico, come iRC1080, utilizzando le funzioni della cassetta degli attrezzi Cobra. Aggiungi reazione e modifica l'associazione genica.Passare alla directory che contiene il modello iRC1080 ed eseguire i comandi per caricare il modello. Rinominarlo e aggiungere una nuova reazione e il gene associato. In alcuni casi, quando il metabolita non viene prodotto per via intracellulare, ma viene prelevato dal mezzo, le reazioni di trasporto per i nuovi metaboliti devono essere aggiunte al modello utilizzando la funzione di reazione di aggiunta/scambio per immettere o emettere il metabolita nel mezzo extracellulare.Testare il comportamento del nuovo risultato e modello, ad esempio iBD1106, eseguendo l'analisi del bilancio del flusso, FBA, utilizzando la funzione ottimizza il modello CB in condizioni di luce e buio per la massimizzazione della biomassa come funzione dell'oggetto. Tra gli altri, la soluzione FBA produce tre vettori: i flussi di reazione, i prezzi ombra del metabolita e i costi ridotti della reazione. Qui, viene fornito un esempio in cui il modello iRC1080 viene confrontato con la sua versione raffinata, iBD1106, ottenendo i prezzi ombra che rappresentano la sensibilità della funzione oggettiva della biomassa ai cambiamenti e ai metaboliti contabilizzato in ciascun modello.Qui mostriamo i grafici XY di respirazione e i grafici di livello delle fonti di carbonio e le piastre di analisi delle fonti di azoto per il bianco e CC-503 rispettivamente in colore verde acqua e viola. All'interno di ciascun pozzo, le curve di respirazione rappresentano la conversione del colorante per riduzione in funzione del tempo. Il picco evidenziato nel pannello A rappresenta il rilevamento dell'acetato come unica fonte di carbonio da questa piastra, che è coerente con la letteratura Chlamydomonas.Il confronto del numero di metaboliti identificati utilizzando tre diversi metodi, iRC1080, che è il modello metabolico ben curato di Chlamydomonas, il tempo di gascromatografia del volo GC-TOF e il saggio di microarray fenotipo mostra che solo sei metaboliti si sovrappongono tra i tre set, mentre 149 erano comuni tra iRC1080 e il set di analisi del fenotipo microarray. Ciò dimostra che mentre ogni tecnologia ha un punto di forza verso la ricerca sul profilo metabolico, il set di test del fenotipo microarray può essere una fonte significativa di nuove informazioni metaboliche. Le informazioni ottenute sono state utilizzate per espandere e perfezionare il modello di rete metabolica iRC1080.Qui, confrontiamo il contenuto del modello iRC1080 e il modello espanso iBD1106, incluso il numero di reazioni, il numero di metaboliti e il numero di geni. Mostriamo che il nostro perfezionamento del modello ha aggiunto oltre 254 reazioni alla nuova rete risultante. Queste reazioni sono classificate in amminoacidi, dipeptidi, tripeptidi e reazioni di trasporto.I metaboliti appena identificati sono stati utilizzati per l'espansione della rete metabolica e il perfezionamento del modello metabolico esistente di Chlamydomonas reinhardtii. I saggi di microarray fenotipo possono essere utilizzati per caratterizzare fenotipi metabolici di ceppi esistenti e di nuova isolati. Inoltre, il protocollo che abbiamo utilizzato nel contesto delle microalghe può guidare l'affinamento di modelli metabolici di altre specie.

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