Costruire un sistema di illuminazione semplice e versatile per esperimenti optogenetici
12 gennaio 2021
Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti optogenetici per controllare l'espressione genica con luce rossa e rossa lontana utilizzando PhyB e PIF3. Sono incluse istruzioni dettagliate per la costruzione di un sistema di illuminazione semplice e flessibile, che consente il controllo dell'espressione genica o di altre optogenetiche con un computer.
Il sistema consente ai ricercatori di costruire facilmente un sistema di illuminazione economico e versatile per esperimenti optogenetici. I vantaggi di questa tecnica includono la possibilità di programmare la temporizzazione dell'illuminazione dei LED con lunghezze d'onda disponibili che coprono lo spettro IR vicino visibile e che i LED possono essere utilizzati in una varietà di contesti. Per costruire un circuito elettrico, agganciare il circuito stampato alle mani di aiuto e inserire i fili del ponticello, collegandoli per formare i fori A1 e A3 a terra, il cavo del ponticello D2 nel foro stenopeico D6 e l'alimentatore più i fili del ponticello numero sette nel foro stenopeico A7. Piegare i terminali di 45 gradi e aggiungere flusso.
Dopo la saldatura, tagliare il dorso dei fili. Inserire un'estremità del connettore femmina saldato da filo a filo nel foro A5. Quindi collegare un'estremità del resistore al foro A5.
Collegare l'altra estremità del connettore a terra. Quindi collegare l'altra estremità del resistore alla massa e saldare la connessione. Per il connettore Arduino, crimpare le estremità dei connettori da filo a filo e spingere le estremità crimpate attraverso il connettore rettangolare.
Per impostare i LED, stagnare un filo riscaldando dal basso mentre si aggiunge la saldatura dall'alto. Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e utilizzare la punta per riscaldare la base del LED al contatto contenente il flusso. Dopo alcuni secondi, trascinare individualmente la saldatura su ciascun contatto e fissare il filo nero sul catodo usando un fermaglio per capelli.
Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e premere la punta sul filo fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie. Tenere premuto il filo e rimuovere il saldatore tenendo il filo in posizione. Posizionare una piccola quantità di pasta saldante sui pad per le connessioni LED e utilizzare una pinza per posizionare il LED sopra i pad.
Tenere il filo rosso pre-stagnato sull'anodo e utilizzare un fermaglio per capelli per tagliare il filo. Aggiungere la saldatura alla punta grande come dimostrato e premere la punta sulla connessione fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie e la pasta saldante si scioglie e diventa argento. Per realizzare i fili LED, posizionare un tubo termoretraibile da 4,76 millimetri sul filo tagliato a misura e un tubo termoretraibile da 3,18 millimetri sul connettore filo-filo.
Striscia e aggiungi flusso alle estremità del filo. Utilizzare le mani di aiuto per agganciare il connettore filo a filo e ruotare l'estremità del connettore con un'estremità del filo. Saldare insieme i materiali e collegare l'altro filo alla configurazione nello stesso modo e saldare.
Quindi agganciare i fili del LED alle mani di aiuto con del nastro adesivo sotto la base del LED. Quindi, mescolare la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore e distribuire la resina epossidica sulla parte superiore del LED saldato. Utilizzando la punta del trapano a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri attraverso la parte superiore della scatola su cui verrà posizionato il LED e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per creare una tacca su un lato del foro per fare spazio al filo LED.
Fissare un pezzo di pellicola per la privacy da 25 a 30 millimetri sulla scatola nera che copre il foro attraverso il quale il LED si illuminerà e fissare il LED all'esterno della scatola nera sulla parte superiore del foro. Per un sistema di controllo a quattro LED, praticare quattro fori da 0,83 centimetri a 3,81 centimetri di distanza nel coperchio della scatola e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per tagliare un foro rettangolare da 1,19 per 1,90 centimetri nell'angolo in alto a sinistra. Utilizzando una punta a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri nella parte posteriore della scatola e inserire un occhiello nel foro.
Per i LED controllati dal computer, carta vetrata l'area in cui il microcontrollore sarà incollato nella scatola e il lato inferiore del supporto del microcontrollore. Collegare il microcontrollore al supporto, quindi unire il supporto epossidico e la scatola prima di fissare il supporto nella scatola nera. Quindi posizionare il nastro biadesivo sulla clip e fissare la clip all'interno della scatola.
Nei campioni trasfettati per esprimere il fitocromo B ma non la ficocianina bilina, la perdita aumenta all'aumentare della quantità di DNA del reporter. Inoltre, quando l'intero interruttore del gene del fitocromo B, incluso il plasmide che produce il cromoquattro della ficocianina bilina, viene illuminato con luce rossa lontana, l'espressione della luciferasi aumenta anche con l'aumentare della quantità di costrutto reporter all'interno del mix di trasfezione. Allo stesso modo, quando le cellule sensibili alla luce sono illuminate con luce rossa, anche l'espressione della luciferasi aumenta con l'aumentare della quantità di reporter.
Quando si confrontano i livelli di induzione delle cellule trattate con luce rossa con le cellule trattate con luce rossa, si riscontra una piccola diminuzione dell'attivazione della piega con quantità crescenti di reporter. È essenziale seguire attentamente ogni passaggio durante la costruzione del circuito elettrico e ricontrollare i numeri stenopeici riga per riga prima di saldare ogni componente. Questo protocollo può essere utilizzato per la stimolazione ottica di molti tipi di campioni o strumenti optogenetici utilizzando una varietà di lunghezze d'onda e consente la programmazione dei programmi di illuminazione.
Panoramica
Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema di illuminazione versatile per esperimenti di optogenetica, che consente il controllo dell'espressione genica mediante luce rossa e luce rosso-lontana. Vengono fornite istruzioni dettagliate per l'assemblaggio del sistema e la programmazione dell'illuminazione a LED.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Optogenetica
- Controllo dell'espressione genica
- Sistemi di illuminazione
Sfondo
- La optogenetica permette un controllo preciso delle funzioni cellulari mediante luce.
- PhyB e PIF3 sono componenti chiave nella regolazione genica sensibile alla luce.
- I LED possono essere programmati per diversi schemi di illuminazione.
- Questo sistema è progettato per essere economico e adattabile a diverse configurazioni sperimentali.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la costruzione di un sistema di illuminazione optogenetico.
- Permettere ai ricercatori di controllare l'espressione genica utilizzando specifiche lunghezze d'onda della luce.
- Facilitare l'uso di strumenti optogenetici in diversi contesti sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di un circuito elettrico per il controllo di LED.
- Programmazione dei tempi di illuminazione e delle lunghezze d'onda dei LED.
- Assemblaggio di un microcontrollore per il controllo automatizzato.
- Verifica del sistema con diverse costruzioni reporter.
Risultati principali
- Costruzione con successo di un sistema di illuminazione flessibile.
- Aumento dell'espressione della luciferasi osservato con quantità maggiori di DNA reporter.
- Dimostrato il controllo dell'espressione genica mediante luce rossa e rosso-lontana.
- Il sistema consente stimolazione ottica su diversi tipi di campioni.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per l'esperimentazione optogenetica.
- I ricercatori possono utilizzare questo sistema per varie applicazioni nella regolazione genica.
- Un'accurata adesione al protocollo garantisce risultati soddisfacenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il controllo ottogenetico dei percorsi cellulari consente un'analisi meccanicistica precisa nella validazione degli obiettivi e nei test fenotipici. Un sistema di illuminazione programmabile a basso costo supporta una somministrazione riproducibile della luce per studi sull'espressione genica, riducendo la variabilità tecnica nei modelli preclinici. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva permettendo una stimolazione ottica standardizzata in diversi contesti sperimentali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi su interruttori genetici sensibili alla luce per chiarire la funzione del percorso e il meccanismo bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce intensità e temporizzazione regolabili dei LED per una perturbazione controllata dei percorsi di segnalazione nei saggi cellulari.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Supporta la preparazione di sistemi biologici standardizzati per la quantificazione delle risposte optogenetiche in seguito a perturbazioni chimiche o genetiche.
- Valore operativo: Facilita la standardizzazione dei saggi mediante programmi di illuminazione programmabili e selezione della lunghezza d'onda per ottenere letture riproducibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra una continuità dallo stadio di scoperta fino alla validazione preclinica, consentendo la stimolazione ottica di sistemi rilevanti per la malattia mediante parametri luminosi regolabili.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, quantificando le risposte dose-dipendenti alla luce rossa e infrarossa in saggi basati su reporter.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema di illuminazione si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta consentendo una perturbazione ottica controllata dell'espressione genica, supportando l'identificazione di composti promettenti attraverso uscite fenotipiche quantificabili.
- Biologia della Scoperta: Supporta la riduzione dei rischi meccanicistici consentendo un controllo temporale e spaziale preciso degli strumenti optogenetici per analizzare la funzione del bersaglio.
- Screening: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come l'espressione della luciferasi in condizioni definite di illuminazione.
- Analisi: Genera dati riproducibili di risposta alla dose di luce che alimentano l'analisi statistica per la validazione del bersaglio e la conferma dei risultati positivi.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo una piattaforma riutilizzabile per testare costrutti optogenetici in modelli di malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Progettato come capacità scalabile e adattabile per progetti multipli che richiedono il controllo ottico di processi cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli esperimenti controllati mediante luce.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità dei protocolli di illuminazione tra diversi laboratori e configurazioni sperimentali.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione tramite letture optogenetiche affidabili e quantificabili, che riducono i falsi positivi nella validazione degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione degli obiettivi adeguata al rischio, basata su risultati riproducibili della stimolazione ottica.
Considerazioni sull'Implementazione
- Conoscenza di base dell'elettronica per il montaggio di circuiti e la saldatura dei collegamenti LED.
- Accesso a microcontrollori compatibili con Arduino e strumentazione per saldatura per la costruzione del sistema.
- Standardizzazione dei protocolli di illuminazione tra i diversi gruppi per garantire condizioni sperimentali riproducibili.
- Considerazioni adattative per diversi strumenti optogenetici che richiedono lunghezze d'onda specifiche o intervalli di intensità particolari.
- Limitazione pratica: potrebbe essere necessaria una calibrazione manuale per ottimizzare la posizione dei LED e la penetrazione della luce per specifici tipi di campione.
