Costruire un sistema di illuminazione semplice e versatile per esperimenti optogenetici
January 12th, 2021
Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti optogenetici per controllare l'espressione genica con luce rossa e rossa lontana utilizzando PhyB e PIF3. Sono incluse istruzioni dettagliate per la costruzione di un sistema di illuminazione semplice e flessibile, che consente il controllo dell'espressione genica o di altre optogenetiche con un computer.
Il sistema consente ai ricercatori di costruire facilmente un sistema di illuminazione economico e versatile per esperimenti optogenetici. I vantaggi di questa tecnica includono la possibilità di programmare la temporizzazione dell'illuminazione dei LED con lunghezze d'onda disponibili che coprono lo spettro IR vicino visibile e che i LED possono essere utilizzati in una varietà di contesti. Per costruire un circuito elettrico, agganciare il circuito stampato alle mani di aiuto e inserire i fili del ponticello, collegandoli per formare i fori A1 e A3 a terra, il cavo del ponticello D2 nel foro stenopeico D6 e l'alimentatore più i fili del ponticello numero sette nel foro stenopeico A7. Piegare i terminali di 45 gradi e aggiungere flusso.
Dopo la saldatura, tagliare il dorso dei fili. Inserire un'estremità del connettore femmina saldato da filo a filo nel foro A5. Quindi collegare un'estremità del resistore al foro A5.
Collegare l'altra estremità del connettore a terra. Quindi collegare l'altra estremità del resistore alla massa e saldare la connessione. Per il connettore Arduino, crimpare le estremità dei connettori da filo a filo e spingere le estremità crimpate attraverso il connettore rettangolare.
Per impostare i LED, stagnare un filo riscaldando dal basso mentre si aggiunge la saldatura dall'alto. Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e utilizzare la punta per riscaldare la base del LED al contatto contenente il flusso. Dopo alcuni secondi, trascinare individualmente la saldatura su ciascun contatto e fissare il filo nero sul catodo usando un fermaglio per capelli.
Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande e premere la punta sul filo fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie. Tenere premuto il filo e rimuovere il saldatore tenendo il filo in posizione. Posizionare una piccola quantità di pasta saldante sui pad per le connessioni LED e utilizzare una pinza per posizionare il LED sopra i pad.
Tenere il filo rosso pre-stagnato sull'anodo e utilizzare un fermaglio per capelli per tagliare il filo. Aggiungere la saldatura alla punta grande come dimostrato e premere la punta sulla connessione fino a quando la saldatura sulla base del LED si scioglie e la pasta saldante si scioglie e diventa argento. Per realizzare i fili LED, posizionare un tubo termoretraibile da 4,76 millimetri sul filo tagliato a misura e un tubo termoretraibile da 3,18 millimetri sul connettore filo-filo.
Striscia e aggiungi flusso alle estremità del filo. Utilizzare le mani di aiuto per agganciare il connettore filo a filo e ruotare l'estremità del connettore con un'estremità del filo. Saldare insieme i materiali e collegare l'altro filo alla configurazione nello stesso modo e saldare.
Quindi agganciare i fili del LED alle mani di aiuto con del nastro adesivo sotto la base del LED. Quindi, mescolare la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore e distribuire la resina epossidica sulla parte superiore del LED saldato. Utilizzando la punta del trapano a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri attraverso la parte superiore della scatola su cui verrà posizionato il LED e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per creare una tacca su un lato del foro per fare spazio al filo LED.
Fissare un pezzo di pellicola per la privacy da 25 a 30 millimetri sulla scatola nera che copre il foro attraverso il quale il LED si illuminerà e fissare il LED all'esterno della scatola nera sulla parte superiore del foro. Per un sistema di controllo a quattro LED, praticare quattro fori da 0,83 centimetri a 3,81 centimetri di distanza nel coperchio della scatola e utilizzare uno strumento rotante ad alta velocità per tagliare un foro rettangolare da 1,19 per 1,90 centimetri nell'angolo in alto a sinistra. Utilizzando una punta a vanga, praticare un foro di 1,5 centimetri nella parte posteriore della scatola e inserire un occhiello nel foro.
Per i LED controllati dal computer, carta vetrata l'area in cui il microcontrollore sarà incollato nella scatola e il lato inferiore del supporto del microcontrollore. Collegare il microcontrollore al supporto, quindi unire il supporto epossidico e la scatola prima di fissare il supporto nella scatola nera. Quindi posizionare il nastro biadesivo sulla clip e fissare la clip all'interno della scatola.
Nei campioni trasfettati per esprimere il fitocromo B ma non la ficocianina bilina, la perdita aumenta all'aumentare della quantità di DNA del reporter. Inoltre, quando l'intero interruttore del gene del fitocromo B, incluso il plasmide che produce il cromoquattro della ficocianina bilina, viene illuminato con luce rossa lontana, l'espressione della luciferasi aumenta anche con l'aumentare della quantità di costrutto reporter all'interno del mix di trasfezione. Allo stesso modo, quando le cellule sensibili alla luce sono illuminate con luce rossa, anche l'espressione della luciferasi aumenta con l'aumentare della quantità di reporter.
Quando si confrontano i livelli di induzione delle cellule trattate con luce rossa con le cellule trattate con luce rossa, si riscontra una piccola diminuzione dell'attivazione della piega con quantità crescenti di reporter. È essenziale seguire attentamente ogni passaggio durante la costruzione del circuito elettrico e ricontrollare i numeri stenopeici riga per riga prima di saldare ogni componente. Questo protocollo può essere utilizzato per la stimolazione ottica di molti tipi di campioni o strumenti optogenetici utilizzando una varietà di lunghezze d'onda e consente la programmazione dei programmi di illuminazione.
Panoramica
Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema di illuminazione versatile per esperimenti optogenetici, che consente il controllo dell'espressione genica con luce rossa e lontana-rossa. Vengono fornite istruzioni dettagliate per la costruzione del sistema e la programmazione dell'illuminazione LED.
Componenti Principali dello Studio
Area di Scienza
- Optogenetics
- Controllo dell'espressione genica
- Sistemi di illuminazione
Sfondo
- L'optogenetica permette un controllo preciso delle funzioni cellulari usando la luce.
- PhyB e PIF3 sono componenti chiave nella regolazione genica responsiva alla luce.
- I LED possono essere programmati per vari programmi di illuminazione.
- Questo sistema è progettato per essere economico e adattabile a diversi setup sperimentali.
Scopo dello Studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la costruzione di un sistema di illuminazione optogenetico.
- Permette ai ricercatori di controllare l'espressione genica usando specifiche lunghezze d'onda della luce.
- Facilitare l'uso di strumenti optogenetici in diversi contesti sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di un circuito elettrico per il controllo dei LED.
- Programmazione dei tempi di illuminazione dei LED e delle lunghezze d'onda.
- Assemblaggio di un microcontroller per il controllo automatizzato.
- Test del sistema con varie costruzioni reporter.
Risultati Principali
- Costruzione riuscita di un sistema di illuminazione flessibile.
- Aumento dell'espressione della luciferasi osservato con maggiori quantità di DNA reporter.
- Controllo dimostrato sull'espressione genica usando luce rossa e lontana-rossa.
- Il sistema permette la stimolazione ottica su diversi tipi di campione.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo affidabile per la sperimentazione optogenetica.
- I ricercatori possono utilizzare questo sistema per varie applicazioni nella regolazione genica.
- L'aderenza attenta al protocollo garantisce risultati di successo.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of cellular pathways enables precise mechanistic interrogation in target validation and phenotypic screening. A low-cost, programmable illumination system supports reproducible light delivery for gene expression studies, reducing technical variability in preclinical models. This approach enhances predictive confidence by allowing standardized optical stimulation across diverse experimental contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables hypothesis testing of light-sensitive gene switches to clarify pathway function and target mechanism.
- Operational Value: Provides adjustable LED intensity and timing for controlled perturbation of signaling pathways in cellular assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports preparation of standardized biological systems for quantifying optogenetic responses across compound or genetic perturbations.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through programmable illumination schedules and wavelength selection for reproducible readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates continuity from discovery through preclinical validation by enabling optical stimulation of disease-relevant systems with tunable light parameters.
- Operational Value: Allows risk-adjusted advancement decisions by quantifying dose-dependent responses to red and far-red light in reporter-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The illumination system integrates into discovery biology workflows by enabling controlled optical perturbation of gene expression, supporting lead identification through quantifiable phenotypic outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing precise temporal and spatial control of optogenetic tools to interrogate target function.
- Screening: Enables quantitative dependent variable measurements such as luciferase expression under defined illumination conditions.
- Analytics: Generates reproducible light-dose response data that inform statistical analysis for target validation and hit confirmation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a reusable platform for testing optogenetic constructs in disease models.
- Enterprise Reuse: Designed as a scalable, adaptable capability for multiple projects requiring optical control of cellular processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in light-controlled experiments.
- Operational Value: Standardization and scalability of illumination protocols across laboratories and experimental setups.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable, quantifiable optogenetic readouts that reduce false positives in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible optical stimulation outcomes.
Implementation Considerations
- Basic electronics proficiency for circuit assembly and soldering of LED connections.
- Access to Arduino-compatible microcontrollers and soldering instrumentation for system construction.
- Standardization of illumination protocols across teams to ensure reproducible experimental conditions.
- Adaptation considerations for different optogenetic tools requiring specific wavelengths or intensity ranges.
- Practical limitation: Manual calibration may be required to optimize LED positioning and light penetration for specific sample types.
