Name: Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Scopri la differenziazione delle cellule precursori neurali indotta da impulsi di corrente continua in un sistema microfluidico. Questo metodo riduce i tempi di preparazione e i volumi di campione e reagenti, offrendo un approccio efficiente per la ricerca neuroscientifica e potenziali strategie terapeutiche.

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Gli autori ringraziano il professor Tang K. Tang, Istituto di Scienze Biomediche, Academia Sinica, per la sua assistenza nella fornitura di cellule staminali neurali del topo e progenitrici (mNPC). Gli autori ringraziano anche il professor Tang K. Tang e la signora Ying-Shan Lee, per la loro preziosa discussione sulla differenziazione degli MNPC.

1. Progettazione e fabbricazione del chip MOE
<ol><li>Disegnare modelli per singoli strati di metacrilato di polimetile (PMMA) e il nastro a doppia parte utilizzando un software appropriato (Figura 1A, Tabella dei materiali). Tagliare sia i fogli PMMA che il nastro a doppia mano con uno scriber per macchine laser CO2 (Figura 1B).<ol>
<li>Accendere lo scriber laser CO2 e collegarlo a un personal computer. Aprire il file del modello progettato utilizzando il software.</li>
		<li>Posizionare i fogli PMMA (275 mm x 400 mm) o il nastro a doppia mano (210 mm x 297 mm) sulla piattaforma dello scriber laser(Figura 2A). Mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica.</li>
		<li>Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi "stampare" il modello utilizzando lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano e ottenere singoli motivi sul foglio o sul nastro PMMA (Figura 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto. NOTA: Il disegno del modello PMMA e la lavorazione diretta del foglio PMMA sono stati eseguiti secondo un precedente rapporto17.</li>
	<li>Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA da 1 mm (strati 1, 2 e 3) e incollarli sotto una pressione di 5 kg /cm2 in un bonder termico per 30 minuti a 110 °C per formare l'assemblaggio del canale di flusso /stimolazione elettrica(Figura 2C). NOTA: Diversi lotti di lamiere PMMA ottenute commercialmente hanno una temperatura di transizione del vetro leggermente diversa (Tg). La temperatura di incollaggio ottimale deve essere testata a incrementi di 5 °C vicino al Tg.</li>
	<li>Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato 1 dell'assemblaggio del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida. NOTA: Gli adattatori sono realizzati in PMMA mediante stampaggio a iniezione. Le superfici piane nella parte inferiore sono per il collegamento al chip MOE. Gli adattatori con filetto a vite femmina da 1/4W-28 sono per il collegamento di spine bianche a tenuta di dita, connettori inferiori piatti o adattatori Luer. Fai attenzione quando usi colla cianoacrilato ad azione rapida. Evitare di spruzzi negli occhi.</li>
	<li>Disinfettare i substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3), il nastro a doppia fronte (Strato 4) e il PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5) utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV) per 30 minuti prima di assemblare il chip(Figura 1A).</li>
	<li>Aderire ai substrati PMMA da 1 mm (strati 1-3) sul PMMA di grado ottico da 3 mm (Strato 5) con il nastro a doppia aspetto (Strato 4) per completare l'assieme PMMA (Layers 1-5)(Figura 1A).</li>
	<li>Preparare il vetro di copertura pulito per l'assemblaggio sul chip.<ol>
<li>Riempire una diluizione dieci volte del detergente in un barattolo di colorazione (vedere il tavolo dei materiali) e pulire il vetro di copertura in questo detergente utilizzando un pulitore ad ultrasuoni per 15 minuti.</li>
		<li>Risciacquare accuratamente il barattolo di colorazione sotto l'acqua corrente del rubinetto per rimuovere tutte le tracce del detergente.</li>
		<li>Continuare il risciacquo con acqua distillata per rimuovere tutte le tracce di acqua del rubinetto e ripetere il passaggio 1.7.2 due volte.</li>
		<li>Asciugare il vetro di copertura pulito soffiandolo con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disinfettare l'assieme PMMA (Strati 1-5), il nastro a doppia parte (Strato 6) e il vetro di copertura (Strato 7) utilizzando l'irradiazione UV all'interno di un armadio di biosicurezza per 30 minuti prima di assemblare il truciolo(Figura 1A).</li>
	<li>Aderire al vetro di copertura pulito (Strato 7) all'assieme PMMA (Livelli 1-5) con il nastro a doppia fronte (Livello 6)(Figura 1A).</li>
	<li>Incubare il chip MOE in una camera a vuoto durante la notte; utilizzare l'assieme chip MOE per le procedure successive (Figura 3).</li>
</ol>2. Rivestimento della poli-L-lisina (PLL) sul substrato nelle regioni di coltura cellulare
<ol><li>Preparare il tubo in politetrafluoroetilene, il connettore a fondo piatto, il connettore cono, l'adattatore cono-Luer, la spina bianca a tenuta di dita (chiamata anche tappo), l'adattatore Luer, la siringa di blocco Luer e il bung in gomma nera(Figura 4A,Tabella dei materiali). Sterilizzare tutti i componenti di cui sopra in autoclave a 121 °C per 30 min.</li>
	<li>Sigillare le aperture degli adattatori a ponte di agar(Figura 1A)con le spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore flat-bottom all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi (Figura 4B). Collegare l'adattatore cono-Luer ai fermavi a 3.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di soluzione PLL allo 0,01% utilizzando una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'ingresso medio (Figura 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Collegare una siringa vuota da 3 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Riempire le aree di coltura cellulare con la soluzione PLL. Pompare manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro lentamente. Chiudi i due fermacock a 3 via per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali.</li>
	<li>Incubare il chip MOE a 37 °C durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di CO2 al 5%.</li>
</ol>3. Preparazione della rete di ponti salati
<ol><li>Dopo il passaggio 2.6, aprire i due fermavi a 3 via e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe.</li>
	<li>Prelevare 3 mL di mezzo completo (mezzo di manutenzione delle cellule staminali costituito dal mezzo di aquila modificato di Dulbecco / miscela nutritiva del prosciutto F-12 (DMEM / F12), supplemento B-27 al 2%, 20 ng/mL EGF e 20 ng/mL bFGF) in una siringa da 3 ml che si collega al fermallo a 3 way dell'ingresso medio (Figura 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> e Figura 4B- <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Aggiungere 3 mL di mezzo completo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Collegare una siringa vuota da 5 ml al fermago a 3 strade della presa media (Figura 4B- <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
	<li>Preparare la rete di ponti di sale (Figura 5).<ol>
<li>Tagliare il bung di gomma nera per produrre uno spazio e inserire gli elettrodi argento (Ag)/cloruro d'argento (AgCl) attraverso il bung di gomma nera e nella siringa di blocco Luer(Figura 4A).</li>
		<li>Sostituire la spina bianca con l'adattatore Luer e iniettare il 3% di agarosio caldo per riempire l'adattatore Luer. NOTA: Per la preparazione dell'agarosio caldo, sciogliere 3 g di polvere di agarosio in 100 mL di salina tamponata da fosfati (PBS) e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 min.</li>
		<li>Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer. Iniettare il 3% di agarosa calda attraverso il bung di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer usando la siringa con ago. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio. NOTA: Per aumentare la capacità di volume dell'agarosio, la siringa di blocco Luer è montata sull'adattatore Luer(figura 4 e figura 5). Quindi, i grandi elettrodi vengono inseriti nella siringa di blocco Luer. L'elettrodo è in grado di fornire una stimolazione elettrica stabile per l'esperimento a lungo termine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparazione di mNPC
<ol><li>Coltura degli mNPC1 nel mezzo completo in un pallone da coltura cellulare 25T a 37 °C in un incubatore pieno di atmosfera di CO2 al 5%. Sottocultura le cellule ogni 3-4 giorni, ed eseguire tutti gli esperimenti con cellule che hanno subito 3-8 passaggi dalla fonte originale.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml e spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min. Aspirare il supernatante e lavare le neurosfere con pbs (DPBS) di 1x Dulbecco. Spin-down delle neurosfere a 100 × g per 5 min.</li>
	<li>Aspirare il 1x DPBS e quindi rimpiorsi le neurosfere nel mezzo completo. Mescolare accuratamente e delicatamente.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml della sospensione della neurosfera utilizzando una siringa da 1 ml che si collega al fermallo a 3 via dell'uscita (Figura 4B- <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> ).</li>
</ol>5. Installazione del sistema microfluidico per la stimolazione dell'impulso CC (Figura 6)
<ol><li>Installare il chip MOE semisezionato sulla stufa ITO trasparente fissata su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile. NOTA: La temperatura superficiale ITO è controllata da un controller proporzionale-integrale-derivato e mantenuta a 37 °C. Una termocopia di tipo K viene bloccata tra il chip e il riscaldatore ITO per monitorare la temperatura delle regioni di coltura cellulare all'interno del chip. Il chip MOE è installato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile ed è adatto per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse nelle singole sezioni del canale. La fabbricazione del riscaldatore ITO e l'installazione del sistema di riscaldamento a coltura cellulare sono stati descritti inprecedenza 18,19.</li>
	<li>Infondere gli mNPC pompando manualemente nel chip MOE tramite la presa media. Incubare il chip MOE semisemito di cellule sul riscaldatore ITO a 37 °C per 4 ore.</li>
	<li>Dopo 4 ore, pompare il mezzo completo attraverso il chip MOE tramite l'ingresso medio a una portata di 20 μL/h utilizzando una pompa per siringhe. NOTA: Gli mNPC vengono coltivati e mantenuti nel chip per ulteriori 24 ore prima della stimolazione EF per consentire l'attacco cellulare e la crescita. Il liquido di scarto viene raccolto in una siringa vuota da 5 ml collegata al fermallo a 3 strade dell'uscita, indicata come "rifiuto" nella figura 6A. La configurazione del sistema microfluidico MOE è illustrata nella figura 6. Questo sistema microfluidico fornisce un continuo apporto di nutrizione alle cellule. Il mezzo fresco completo viene continuamente pompato nel chip MOE per mantenere un valore di pH costante. Pertanto, le cellule possono essere coltivate al di fuori di un incubatore di CO2.</li>
	<li>Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra con una magnitudine di 300 mV/mm ad una frequenza di 100 Hz a cicli di servizio del 50% (50% di time-on e 50% di tempo libero)(Figura 6B).<ol>
<li>Collegare i fili elettrici al multiplexer EF. Collegare i fili elettrici al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl.</li>
		<li>Collegare il multiplexer EF all'amplificatore utilizzando fili elettrici. Collegare il generatore di funzioni all'amplificatore e all'oscilloscopio digitale. NOTA: Il multiplexer EF è un circuito che include l'impedenza della camera di coltura nel circuito e collega tutte le singole camere in una rete elettronica parallela. Ognuna delle tre camere di coltura è collegata elettricamente in serie a un resistore variabile (Vr) e un amperometro (mostrato come μA nella figura 6A) nel multiplexer. La corrente elettrica attraverso ogni camera di coltura è variata controllando la Vr, e la corrente è mostrata sull'ammetro corrispondente. La forza del campo elettrico in ogni regione di coltura cellulare è stata calcolata dalla legge di Ohm, I= σEA, dove I è la corrente elettrica, σ (impostata come 1,38 S·m-1 per DMEM/F1220) è la conduttività elettrica del mezzo di coltura, E è il campo elettrico, e A è l'area trasversale della camera elettrotassica. Per la dimensione della regione di coltura cellulare mostrata nella figura 1, la corrente elettrica è rispettivamente ~87 mA e ~44 mA per l'impulso DC e DC al 50% del ciclo di servizio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sottosezione degli mNPC a impulsi CC quadrati con una magnitudine di 300 mV/mm alla frequenza di 100 Hz per 48h. Pompare continuamente il mezzo completo ad una velocità di 10 μL/h per fornire un'alimentazione adeguata alle cellule e mantenere un valore di pH costante nel mezzo.</li>
</ol>6. Test di immunofluorescenza degli MNPC dopo stimolazione CC pulsata
NOTA: In questo passaggio, tutto il reagente viene pompato tramite l'ingresso medio utilizzando una pompa per siringhe.
<ol><li>Dopo 3, 7 o 14 giorni di coltivazione in vitro (DIV) dopo la semina1, lavare le cellule con 1x PBS ad una portata di 25 μL/min per 20 min.</li>
	<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% (PFA). Pompare il 4% di PFA nel chip ad una portata di 25 μL/min per 20 min per sostituire il 1x PBS. Per sostituire il 4% di PFA, lavare le celle con 1x PBS a una portata di 25 μL/min per 20 min.</li>
	<li>Pompare lo 0,1% di Tritone X-100 nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 minuti per permeabilizzare le cellule. Ridurre la portata a 50 μL/h per altri 30 minuti per reagire con le cellule. Per sostituire lo 0,1% di Tritone X-100, lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 6 min.</li>
	<li>Bloccare le cellule con PBS contenente l'1% di albumina siere bovina (BSA) per ridurre il legame anticorpale non specifico. Pompare l'1% di BSA nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 100 μL/h e pompare per 1 h.</li>
	<li>Pompare gli anticorpi per la doppia immunosocienza nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min e incubare il truciolo per 18 ore a 4 °C. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.</li>
	<li>Pompare gli anticorpi secondari coniugati con Fluor Alexa nel chip ad una portata di 50 μL/min per 6 min. Ridurre la portata a 50 μL/h e pompare gli anticorpi per 1 h a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.</li>
	<li>Per la colorazione nucleare, pompare hoechst 33342 nel chip ad una portata di 20 μL/min per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare le celle con 1x PBS ad una portata di 50 μL/min per 15 min.</li>
	<li>Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale.</li>
</ol>7. Analisi delle immagini ed elaborazione dei dati
<ol><li>Analizzare le immagini fluorescenti utilizzando il software con strumenti di misurazione integrati (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Confrontare i nuclei controsostenibili hoechst (numero totale di cellule) nei gruppi di controllo e trattamento e calcolare la percentuale di cellule che esprimono ciascun marcatore fenotipico.</li>
</ol>

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<li>AChang, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+electrical+currents+stimulation+promotes+both+proliferation+and+differentiation+of+fetal+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells.</a> PLoS One. 6 (4), e18738(2011).</li>
<li>Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating+current+electric+fields+of+varying+frequencies%3A+effects+on+proliferation+and+differentiation+of+porcine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells.</a> Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante la fabbricazione del chip MOE, gli adattatori sono attaccati allo Strato 1 del chip MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida. La colla viene applicata su 4 angoli degli adattatori e quindi la pressione viene applicata uniformemente sugli adattatori. L'eccesso di quantità di colla deve essere evitato per garantire la completa polimerizzazione della colla. Inoltre, l'assemblaggio del chip MOE completato viene incubato in una camera a vuoto. Questo passaggio aiuta a rimuovere le bolle tra lo strato PMMA, il nast...

Le cellule precursori neurali (NPC, note anche come cellule staminali neurali e progenitrici) possono essere un candidato promettente per la strategia terapeutica neurodegenerativa1. I PNG indifferenziati hanno capacità di auto-rinnovo, multipotenza e capacità proliferativa2,3. Uno studio precedente ha riferito che la matrice extracellulare e i mediatori molecolari regolano la differenziazione dell'NPC. Il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) promuovono la proliferazione dei NPC, mantenendo così lo stato indifferenziato4.
Studi precedenti hanno riferito che la stimolazione elettrica può regolare le attività fisiologiche cellulari come ladivisione 5,lamigrazione 6,7,8,ladifferenziazione 1,9,10e la morte cellulare11. I campi elettrici (EFs) svolgono un ruolo vitale nello sviluppo e nella rigenerazione dello sviluppo del sistemanervoso centrale 12,13,14. Dal 2009 al 2019, questo laboratorio ha studiato le risposte cellulari all'applicazione di EF nel sistema microfluidico1,6,7,8,15,16,17. Un chip elettrotattico multicanale, otticamente trasparente (MOE) è stato progettato per essere adatto per la colorazione dell'immunofluorescenza per la microscopia confocale. Il chip aveva un'elevata trasparenza ottica e una buona durata e permetteva lo svolgimento simultaneo di tre esperimenti di stimolazione indipendenti e diverse condizioni immunostained in un unico studio. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo documento descrive lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine.

<table><tbody><tr><td>Substrati in PMMA da 1 mm (strati 1-3)</td><td>BHT</td><td>K2R20</td><td>Polimetilmetacrilato (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html</td></tr><tr><td>tubo di plastica da 15 mL</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>Tubo a fondo conico con tappo, assemblato, presterilizzato</td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Siringhe orali da 3 mL, senza ago</td></tr><tr><td>PMMA da 3 mm di grado ottico (Strato 5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY Foglio PMMA</td><td>Rubinetto a 3 vie in PMMA di grado ottico</td></tr><tr><td></td><td>NIPRO</td><td>NCN-3L</td><td>Rubinetto sterile monouso a 3 vie</td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3410</td><td>Siringhe orali da 5 mL, senza ago</td></tr><tr><td>Adattatore</td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>Adattatore PMMA personalizzato</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Agarosio, bassa temperatura di gelificazione</td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>A.A. Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>Amplificatore ad alta tensione</td></tr><tr><td>Software AutoCAD Autodesk</td><td></td><td>Versione educativa</td><td>Disegno</td></tr><tr><td>Supplemento B-27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>Integratore B-27 (50x), meno vitamina A</td></tr><tr><td>Fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>Chiamato anche FGF umano ricombinante-basico</td></tr><tr><td>Tappo di gomma nera</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Da 3 mL siringhe orali, senza ago</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>Reagente bloccante&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>CO2 laser scriber</td><td>Laser Tools and Technics Corp.</td><td>ILS-II</td><td>Acquistato da http://www.lttcorp.com/index.htm</td></tr><tr><td>connettore a cono</td><td>IDEX Health & Science</td><td>F-120X</td><td>Pezzo unico a tenuta di dita 10-32 conico, per 1/16" OD naturale</td></tr><tr><td>adattatore Cone-Luer</td><td>IDEX Salute & Science</td><td>P-659</td><td>Luer Adapter 10-32 Luer da femmina a femmina,</td></tr><tr><td>PEEK Microscopio a fluorescenza confocale</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Manuale utente Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>Acquisizione automatica di immagini time-lapse</td></tr><tr><td>Oscilloscopio digitale</td><td>Tektronix</td><td>TDS2024</td><td>Misura i segnali di tensione o corrente nel tempo in un circuito o componente elettronico per visualizzare ampiezza e frequenza.</td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td>Acquistato da http://en.thd.com.tw/</td></tr> <tr><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium/Miscela di nutrienti di prosciutto F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM/F-12, polvere, HEPES</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio</td></tr><tr><td>Multiplexer EF</td><td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td>Personalizzato</td><td>Monitora e controlla la corrente elettrica nei singoli canali</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Chiamato anche EGF umano ricombinante</td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica ad azione rapida</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>Adesivo istantaneo di forza (liquido)</td></tr><tr><td>Connettore a fondo piatto</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-206</td><td>Dado maschio senza flangia Delrin, 1/4-28 fondo piatto, per 1/16" OD blu</td></tr><tr><td>Generatore di funzioni</td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A</td><td>Sintetizzato a 15 MHz ad alte prestazioni&nbsp; generatore di funzioni&nbsp; con capacità di forma d'onda arbitraria incorporata</td></tr><tr><td>IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>Capra anti-topo IgG H& L (Alexa Fluor 488) capra preadsorbita</td></tr><tr><td>anti-coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>Anticorpo secondario policlonale di capra contro le IgG di coniglio - H& L (Alexa Fluor 555), preadsorbito</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Colorazione nucleare</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>Analizza le immagini fluorescenti&nbsp;</td></tr><tr><td>Indio... stagno&ndash; vetro ossido (ITO)</td><td>Merck</td><td>300739</td><td>Per riscaldatore ITO</td></tr><tr><td>Microscopio a contrasto di fase invertito</td><td>OLYMPUS</td><td>CKX41</td><td>Per l'osservazione della morfologia cellulare</td></tr><tr><td>Termocoppia di tipo K</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>Temperatura&nbsp; termocoppie</td></tr><tr><td>adattatore Luer</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P618-01</td><td>Luer adattatore femmina Luer a 1/4-28 maschio</td></tr><tr><td>polipropilene Luer lock siringa</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>Per ponti di sale agar</td></tr><tr><td>Topo anti-GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>Astrociti marcatore</td></tr><tr><td>Oligodendrocita &nbsp; pennarello&nbsp; O4&nbsp; R</td><td>& Sistemi D</td><td>MAB1326</td><td>Marcatore di oligodendrociti</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Fixing&nbsp; agente</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Vita di base</td><td>BL2651</td><td>Soluzione di lavaggio</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina (PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Soluzione di rivestimento</td></tr><tr><td>Occhiali di copertura di precisione spessore n. 1,5H</td><td>MARIENFELD</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>Tavolino motorizzato X-Y-Z programmabile</td><td>Tanlian Inc</td><td>Personalizzato</td><td>Acquistato da http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>Proporzionale... integrale&ndash; regolatore derivativo (PID)</td><td>Toho Electronics</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>Regolatore di temperatura&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo in PTFE</td><td>Professional Plastics Inc. Taiwan Branch</td><td>Diametro esterno 1/16 pollici</td><td>Tubo in PTFE traslucido bianco</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>Marcatore neurone</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 pompa a siringa singola programmabile</td></tr><tr><td>TFD4 detergente</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>Detergente per vetri</td></tr><tr><td>di copertura Bonder termico</td><td>Kuan-MIN Tech Co.</td><td></td><td>Personalizzato Acquistato da http://kmtco.com.tw/</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Soluzione permeabilizzata</td></tr><tr><td>Pulitore ad ultrasuoni</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>Pulitore ad ultrasuoni per sterilizzatori</td></tr><tr><td>Camera a vuoto</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.</td><td>DOV-30</td><td>Forno di essiccazione</td></tr><tr><td>sottovuoto Tappo a tenuta di dita bianco</td><td>IDEX Health & Science</td><td>P-316</td><td>1/4-28 a fondo piatto, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

I campi elettrici fisiologici (EF) svolgono un ruolo vitale nella migrazione cellulare, nella differenziazione, nella divisione e nella morte. Questo articolo descrive un sistema di coltura cellulare microfluidico che è stato utilizzato per uno studio di differenziazione cellulare a lungo termine usando la microscopia. Il sistema microfluidico è costituito dai seguenti componenti principali: un chip elettrotattico otticamente trasparente, un riscaldatore ITO (Indium-Tin-Oxide) trasparente, una pompa di riempimento dei supporti di coltura, un alimentatore elettrico, un amplificatore di potenza ad alta frequenza, un multiplexer EF, uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile e un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una fotocamera digitale. Il sistema microfluidico è utile per semplificare l'impostazione sperimentale complessiva e, a sua volta, il reagente e il consumo del campione. Questo lavoro comporta la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC). Nel mezzo di manutenzione delle cellule staminali, i PNG del topo (mNPC) si differenziarono in neuroni, astrociti e oligodendrociti dopo la stimolazione dell'impulso DC. I risultati suggeriscono che un semplice trattamento a impulsi CC potrebbe controllare il destino degli mNPC e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Il sistema può essere utilizzato per la coltura cellulare in più canali, per la stimolazione EF a lungo termine, per l'osservazione morfologica cellulare e per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse. Questo sistema microfluidico non solo riduce i tempi sperimentali richiesti, ma aumenta anche l'accuratezza del controllo sul microambiente.

La configurazione dettagliata del chip MOE è illustrata nella figura 1. Il chip microfluidico fornisce un approccio vantaggioso per ridurre le dimensioni di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Il chip MOE è stato progettato per eseguire tre esperimenti di stimolazione EF indipendenti e diverse condizioni di immunosocienza simultaneamente in un unico studio (Figura 3). Inoltre, il chip MOE...

In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.

Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Questo studio presenta un protocollo per la differenziazione delle cellule precursori neurali indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua in un sistema microfluidico. Questa tecnica fornisce un approccio utile per ridurre il tempo di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Inoltre, il chip MOE è adatto per osservazioni di microscopia confocale.Il semplice trattamento dell'impulso a corrente diretta può controllare il destino delle cellule precursori neurali del topo e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Per iniziare, disegna modelli per i singoli livelli PMMA e il nastro a doppia aspetto utilizzando un software appropriato. Accendere lo scriber laser ad anidride carbonica e collegarlo a un personal computer.Aprire il file del modello progettato utilizzando il software. Posizionare i fogli PMMA o il nastro a doppia mano sulla piattaforma dello scriber laser, quindi mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica. Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi utilizzare lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano.Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto. Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA di un millimetro e incollarli sotto una pressione di cinque chilogrammi per centimetro quadrato in un bonder termico per 30 minuti a 110 gradi Celsius per formare il flusso o l'assemblaggio del canale di stimolazione elettrica. Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato uno dei chip assemblaggio MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida.Disinfettare i substrati PMMA di un millimetro, il nastro a doppia fronte e il PMMA di grado ottico di tre millimetri utilizzando l'irradiazione ultravioletta per 30 minuti prima di assemblare il chip. Aderire ai substrati PMMA di un millimetro sul PMMA di grado ottico di tre millimetri con il nastro a doppia parte per completare l'assemblaggio PMMA. Aderire al coperchio pulito all'assieme PMMA con il nastro a doppia mano.Sigillare le aperture degli adattatori a ponte agar con spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore inferiore piatto all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi, quindi collegare l'adattatore Luer a cono ai fermanti a tre vie. Aggiungere due millilitri di soluzione 0,01%PLL utilizzando una siringa da tre millilitri che si collega al fermallo a tre strade dell'ingresso medio e collegare una siringa vuota da tre millilitri al fermallo a tre strade della presa media.Riempire le regioni di coltura cellulare con la soluzione PLL e pompare lentamente la soluzione di rivestimento avanti e indietro. Chiudi i due fermalusi a tre per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali. Incubare il chip MOE a 37 gradi Celsius durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di anidride carbonica al 5%.Aprire i due fermanti a tre e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe. Disegnare tre millilitri di mezzo completo in una siringa da tre millilitri che si collega al fermaporto a tre via dell'ingresso medio e aggiungerlo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Sostituire la spina bianca a tenuta di dita con l'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% per riempire l'adattatore.Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% attraverso il bong di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio. Installare il chip MOE seminato a celle sul riscaldatore ITO trasparente fissato su uno stadio motorizzato XYZ programmabile mantenuto a 37 gradi Celsius.Infondere gli mNPC pompando manualmente nel chip MOE attraverso la presa media, quindi incubare il chip MOE seminato a cellule sul riscaldatore ITO per quattro ore. Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra.Rimuovere tutti i connettori e gli adattatori inferiori piatti sul chip MOE e riempire gli adattatori con PBS, quindi sigillare le aperture dell'adattatore con parafilm. Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. La stimolazione dell'impulso DC ha portato a mNPC simultanei che si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti nel mezzo di mantenimento delle cellule staminali.Le percentuali di neuroni, astrociti e oligodendrociti nel gruppo di controllo e nel gruppo di stimolazione sono mostrate qui. Dopo il trattamento dell'impulso DC, gli mNPC hanno espresso un numero significativamente elevato di neuroni a DIV sette, astrociti a DIV tre e oligodendrociti a DIV sette e DIV 14 erano presenti a livelli relativamente più alti nei gruppi di stimolazione che nel gruppo di controllo. Le neurosfere formate da 30 a 40 cellule sono preferite per iniziare la differenziazione mNPC.La crescita troppo degli MNPC comprometterà la sopravvivenza cellulare durante il processo di differenziazione.

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Abbiamo dimostrato che l'espressione dei recettori più fattore di crescita epidermico (EGFR) aumenta la motilità delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un nuovo gel dispositivo basato microfluidica. Questa tecnologia può essere facilmente adattabile ad altri sistemi cellulari di mammifero, dove le fonti di cellule sono scarse, come le cellule staminali neurali, e il girarsi tempo è critico.

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Questo video dimostra l'uso di un chip microfluidico rivestito di matrice extracellulare per differenziare le cellule staminali neurali e progenitrici o NPC attraverso la stimolazione elettrica. Dopo la semina e l'adesione alla regione rivestita, le NPC crescono e l'applicazione di una corrente continua innesca la loro differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti.

Differenziazione indotta dalla stimolazione elettrica di cellule staminali neurali e progenitrici

Il video mostra la formazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico. Le cellule precursori neurali e le cellule progenitrici muscolari vengono seminate in diversi pozzetti all'interno del dispositivo e lasciate maturare rispettivamente in motoneuroni e miotubi. La creazione di un gradiente volumetrico e chimico porta allo sviluppo di giunzioni neuromuscolari attive.

Generazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico

Il video dimostra la differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC) utilizzando un dispositivo microfluidico che comprende un compartimento somatico e uno assonale separati da una barriera di microsolchi. Le NSC vengono introdotte nel compartimento somatico e possono aderire. Le NSC si differenziano in neuroni all'interno del compartimento somatico ed estendono gli assoni attraverso la barriera del microsolco fino al compartimento assonale.

Differenziazione delle cellule staminali neurali in neuroni utilizzando un dispositivo microfluidico compartimentalizzato

Sono descritti protocolli per singolo neurone microfluidica arraying e mascheramento acqua per il patterning plasma in-chip di rivestimenti biomateriale. Co-colture altamente interconnessi possono essere preparati utilizzando gli ingressi di cellule minimali.

Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella

Questo protocollo dimostra l'uso di chip microfluidici compartimentati, iniezione modellata in un copolimero ciclico olefin a neuroni coltivati differenziati dalle cellule staminali umane. Questi chip sono preassemblati e più facili da usare rispetto ai tradizionali dispositivi di poli(dimetilsiloxane) compartimentati. Qui sono descritti più paradigmi sperimentali comuni, tra cui l'etichettatura virale, l'isolamento fluido, l'asaxtomia e l'immunostaining.

Compartimentazione dei neuroni derivati da cellule staminali umane all'interno di chip microfluidici in plastica pre-assemblati

Presentiamo un sistema microfluidico per studi ad alta produttività su macchinari di vita complessi, composto da 1500 unità di coltura, una serie di pompe peristaltiche potenziate e un modulo di miscelazione in loco. Il chip microfluidico consente l'analisi delle condizioni micro-ambientali altamente complesse e dinamiche in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.

Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Le cellule del cancro al seno presentano proprietà dielettriche diverse rispetto alle cellule epiteliali mammarie non tumorali. È stato ipotizzato che, sulla base di questa differenza di proprietà dielettriche, le due popolazioni possano essere separate ai fini dell'immunoterapia. Per supportare questo, modelliamo un dispositivo microfluidico per ordinare le celle MCF-7 e MCF-10A.

Dispositivo microfluidico per la separazione di cellule di cancro al seno non metastatiche (MCF-7) e non tumorali (MCF-10A) mediante dielettroforesi AC

Scopri la differenziazione delle cellule precursori neurali indotta da impulsi di corrente continua in un sistema microfluidico. Questo metodo riduce i tempi di preparazione e i volumi di campione e reagenti, offrendo un approccio efficiente per la ricerca neuroscientifica e potenziali strategie terapeutiche.

Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici

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