Differenziazione delle cellule precursori neurali indotte dal campo elettrico nei dispositivi microfluidici
14 aprile 2021
In questo studio, presentiamo un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici (NPC) indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua (DC) in un sistema microfluidico.
Questo studio presenta un protocollo per la differenziazione delle cellule precursori neurali indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua in un sistema microfluidico. Questa tecnica fornisce un approccio utile per ridurre il tempo di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Inoltre, il chip MOE è adatto per osservazioni di microscopia confocale.
Il semplice trattamento dell'impulso a corrente diretta può controllare il destino delle cellule precursori neurali del topo e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Per iniziare, disegna modelli per i singoli livelli PMMA e il nastro a doppia aspetto utilizzando un software appropriato. Accendere lo scriber laser ad anidride carbonica e collegarlo a un personal computer.
Aprire il file del modello progettato utilizzando il software. Posizionare i fogli PMMA o il nastro a doppia mano sulla piattaforma dello scriber laser, quindi mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica. Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi utilizzare lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano.
Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto. Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA di un millimetro e incollarli sotto una pressione di cinque chilogrammi per centimetro quadrato in un bonder termico per 30 minuti a 110 gradi Celsius per formare il flusso o l'assemblaggio del canale di stimolazione elettrica. Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato uno dei chip assemblaggio MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida.
Disinfettare i substrati PMMA di un millimetro, il nastro a doppia fronte e il PMMA di grado ottico di tre millimetri utilizzando l'irradiazione ultravioletta per 30 minuti prima di assemblare il chip. Aderire ai substrati PMMA di un millimetro sul PMMA di grado ottico di tre millimetri con il nastro a doppia parte per completare l'assemblaggio PMMA. Aderire al coperchio pulito all'assieme PMMA con il nastro a doppia mano.
Sigillare le aperture degli adattatori a ponte agar con spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore inferiore piatto all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi, quindi collegare l'adattatore Luer a cono ai fermanti a tre vie. Aggiungere due millilitri di soluzione 0,01%PLL utilizzando una siringa da tre millilitri che si collega al fermallo a tre strade dell'ingresso medio e collegare una siringa vuota da tre millilitri al fermallo a tre strade della presa media.
Riempire le regioni di coltura cellulare con la soluzione PLL e pompare lentamente la soluzione di rivestimento avanti e indietro. Chiudi i due fermalusi a tre per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali. Incubare il chip MOE a 37 gradi Celsius durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di anidride carbonica al 5%.
Aprire i due fermanti a tre e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe. Disegnare tre millilitri di mezzo completo in una siringa da tre millilitri che si collega al fermaporto a tre via dell'ingresso medio e aggiungerlo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Sostituire la spina bianca a tenuta di dita con l'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% per riempire l'adattatore.
Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% attraverso il bong di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio. Installare il chip MOE seminato a celle sul riscaldatore ITO trasparente fissato su uno stadio motorizzato XYZ programmabile mantenuto a 37 gradi Celsius.
Infondere gli mNPC pompando manualmente nel chip MOE attraverso la presa media, quindi incubare il chip MOE seminato a cellule sul riscaldatore ITO per quattro ore. Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra.
Rimuovere tutti i connettori e gli adattatori inferiori piatti sul chip MOE e riempire gli adattatori con PBS, quindi sigillare le aperture dell'adattatore con parafilm. Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. La stimolazione dell'impulso DC ha portato a mNPC simultanei che si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti nel mezzo di mantenimento delle cellule staminali.
Le percentuali di neuroni, astrociti e oligodendrociti nel gruppo di controllo e nel gruppo di stimolazione sono mostrate qui. Dopo il trattamento dell'impulso DC, gli mNPC hanno espresso un numero significativamente elevato di neuroni a DIV sette, astrociti a DIV tre e oligodendrociti a DIV sette e DIV 14 erano presenti a livelli relativamente più alti nei gruppi di stimolazione che nel gruppo di controllo. Le neurosfere formate da 30 a 40 cellule sono preferite per iniziare la differenziazione mNPC.
La crescita troppo degli MNPC comprometterà la sopravvivenza cellulare durante il processo di differenziazione.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la differenziazione di cellule precursori neurali indotta da stimolazione con impulsi di corrente continua in un sistema microfluidico. Questa tecnica riduce il tempo di allestimento dell'esperimento, il volume del campione e il volume dei reagenti, risultando efficiente per applicazioni di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Microidraulica
Sfondo
- Le cellule precursori neurali (NPCs) sono fondamentali per comprendere lo sviluppo del sistema nervoso.
- La stimolazione mediante impulsi a corrente continua può influenzare il destino cellulare.
- I sistemi microfluidici permettono un controllo preciso delle condizioni sperimentali.
- Questo approccio può contribuire allo sviluppo di terapie per le malattie del sistema nervoso.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per la differenziazione delle cellule progenitrici neurali.
- Utilizzare la stimolazione a corrente continua come metodo per controllare il destino cellulare.
- Dimostrare l'efficacia di un sistema microfluidico nella ricerca neuroscientifica.
Metodi Utilizzati
- Progettazione di modelli per strati di PMMA e nastro doppia faccia.
- Utilizzo di un incisore a laser al biossido di carbonio per la fabbricazione.
- Applicazione di stimolazione con impulsi a corrente continua su NPC.
- Esecuzione di osservazioni mediante microscopia confocale per l'analisi.
Risultati principali
- Differenziazione riuscita di NPC utilizzando il protocollo proposto.
- Riduzione del tempo di allestimento dell'esperimento e dell'utilizzo delle risorse.
- Fattibilità dell'utilizzo del chip MOE per la microscopia.
- Potenziali applicazioni in strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso.
Conclusioni
- Il protocollo offre un approccio semplificato per la differenziazione delle NPC.
- La stimolazione con corrente continua è efficace nel controllo del destino cellulare.
- I sistemi microfluidici migliorano l'efficienza sperimentale nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questa piattaforma microfluidica consente un controllo preciso della differenziazione delle cellule precursori neurali mediante stimolazione con impulsi di corrente continua, offrendo un modello scalabile ed efficiente nell'uso delle risorse per la validazione di bersagli nella ricerca sulle malattie neurodegenerative. Riducendo la complessità sperimentale e il consumo di reagenti, supporta una valutazione meccanicistica precoce e un'elevata affidabilità predittiva nelle strategie di modulazione del destino cellulare. La compatibilità del sistema con stimolazioni a lungo termine e con l'imaging automatizzato ne favorisce l'integrazione in flussi di lavoro di scoperta mirati a terapie per il sistema nervoso.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di stimoli elettrici come regolatori del destino delle cellule precursori neurali, supportando la verifica di ipotesi mirate nei percorsi dello sviluppo neuronale.
- Valore operativo: Riduce i volumi di campione e reagenti grazie al confinamento microfluidico, abbattendo i costi nelle fasi iniziali di screening di bersagli.
- Valore predittivo: Fornisce letture quantitative della differenziazione neuronale, astrocitaria e oligodendrocitaria, consentendo decisioni basate sui dati riguardo all'avanzamento o meno verso bersagli modulatori.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera output di differenziamento standardizzati e riproducibili in condizioni controllate di campo elettrico, adatti all'ottimizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Consente il test multiplex di diverse condizioni mediante dispositivi a canali, aumentando la produttività nella valutazione di composti o stimoli.
- Prontezza del saggio: Supporta la coltura a lungo termine e l'imaging in time-lapse, permettendo il profilo cinetico delle dinamiche di differenziamento per la validazione del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Utilizza cellule precursori neurali di topo in un microambiente definito, aumentando la rilevanza rispetto ai processi di differenziamento neurale in vivo.
- Modellizzazione Preclinica: Permette la generazione di linee gliali e neuronali da un progenitore comune, utile per modellare disturbi del sistema nervoso.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Consente la valutazione del bias di differenziamento in seguito a stimolazione, fornendo informazioni sui profili meccanicistici di sicurezza ed efficacia.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, in particolare nelle fasi di validazione del bersaglio e identificazione dei composti promettenti, in cui è fondamentale comprendere il meccanismo d'azione dei regolatori del destino cellulare. Supporta le campagne di screening fornendo un sistema controllato e quantificabile per valutare l'attività biologica di modulatori elettrici o farmacologici. I risultati ottenuti dalla piattaforma—parametri di differenziazione specifici per linea cellulare—alimentano le analisi bioinformatiche utilizzate per selezionare i bersagli con un grado predittivo di affidabilità nei meccanismi di riparazione neurale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione bioelettrica nelle cellule precursori neurali, riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo bersaglio.
- Screening: Permette saggi di differenziamento riproducibili e quantitativi in condizioni definite di stimolazione elettrica, migliorando l'affidabilità del saggio.
- Analisi: Fornisce parametri misurabili (ad esempio, % di neuroni, astrociti, oligodendrociti) per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Modella la dinamica del differenziamento rilevante per i disturbi del sistema nervoso, sostenendo la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Progettato per un uso ripetuto in diverse condizioni sperimentali, promuove la standardizzazione e la coerenza tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi isolando la stimolazione elettrica come variabile definita nella determinazione del destino cellulare.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di differenziazione attraverso la precisione microfluidica, migliorando la riproducibilità tra diversi siti e team.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo letture precoci e meccanicistiche sull'impegno verso una linea cellulare, riducendo il rischio di fallimenti in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli che modulano la differenziazione neurale in base al rischio, migliorando l'efficienza nell'allocazione del capitale nei portafogli di neuroscienze.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'assemblaggio di dispositivi microfluidici, nell'elettrofisiologia e nella coltura di cellule staminali neurali.
- Richiede l'accesso a strumenti di fabbricazione laser, riscaldatori in ossido di indio e stagno (ITO), multiplexer di campo elettrico (EF) e sistemi di microscopia invertita.
- Necessita della standardizzazione dei parametri elettrici (larghezza dell'impulso, frequenza, ampiezza) tra gli esperimenti per ottenere risultati riproducibili.
- L'adattamento a cellule precursori neurali di origine umana potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei parametri di stimolazione e delle condizioni di coltura.
- La stabilità a lungo termine degli elettrodi e il bioingombro nei studi di stimolazione cronica rappresentano limitazioni pratiche da considerare.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
