Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare
5 dicembre 2020
Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.
Gli studi molecolari tradizionali del cervelletto sono stati condotti su interi estratti cerebellari, che possono mascherare eventuali distinzioni tra specifiche regioni cerebellari. Questo protocollo consente di valutare separatamente regioni distinte del cervelletto e consente l'esplorazione dei meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici a una varietà di comportamenti e alla progressione della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la dissezione riproducibile e rapida di quattro regioni cerebellari, i nuclei cerebellari profondi, la corteccia cerebellare anteriore e posteriore del Verme e la corteccia cerebellare degli emisferi.
Dopo aver decapitato il topo soppresso, praticare un'incisione con una lama di rasoio lungo la linea sagittale mediale della testa, iniziando dal naso e continuando fino in fondo. Separa la pelle e usa la lama del rasoio per tagliare via il muscolo su ciascun lato, tagliando oltre i canali uditivi. Usando le forbici da dissezione, taglia molte regioni del midollo spinale fino al punto in cui il tronco encefalico incontra il cervelletto, facendo attenzione a non danneggiare il cervelletto.
Inserire una delle lame delle forbici vascolari nello spazio tra il tronco encefalico e la colonna vertebrale e tagliare verso il condotto uditivo, sollevandolo verso l'alto mentre si taglia per limitare i danni al tessuto. Continuare a tagliare lungo il bordo del cranio verso i bulbi olfattivi. Usando la pinza smussata, stacca delicatamente la parte posteriore di questo cranio per scoprire la regione posteriore del cervello e del cervelletto.
Posiziona la pinza smussata lungo il bordo tagliato del cranio e stacca il cranio su e sopra il cervello. Taglia il resto del cranio con le forbici vascolari e le pinze smussate, eliminando la maggior parte dalla parte superiore del cervello. Sollevare leggermente il cervello con la micro spatola per rimuovere i bulbi olfattivi dal cranio rimanente e scollegare le fibre del tratto ottico.
A questo punto il cervello dovrebbe liberarsi facilmente. Metti il cervello nella capsula di Petri, sedendolo sul ghiaccio e rimuovi eventuali residui di cranio o altri detriti. Posiziona delicatamente il cervello nella matrice cerebrale con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
Assicurati che sia impostato a livello nella matrice e che la linea mediana sia al centro. Posiziona una lama di rasoio lungo la linea mediana sagittale, assicurandoti che la lama spinga fino in fondo alla matrice. Posiziona un'altra lama di rasoio a un millimetro di lato della prima lama.
Posiziona altre due lame in modo che tre lame vengano posizionate su un lato del cervello, tutte a un millimetro di distanza. Ripeti l'operazione sull'altro lato. Afferra con cautela l'estremità anteriore e posteriore delle lame di rasoio e sollevale direttamente dalla matrice.
Gettare il fazzoletto all'esterno delle lame del rasoio. Lentamente, separare una lametta alla volta dalle altre facendo attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto. Far scorrere la sezione di tessuto fuori dalla lama del rasoio e sul vetrino con la micro spatola.
Devono essere raccolte sei sezioni sagittali del cervello. Le sezioni laterali più avanzate avranno DCN visibile. Per isolare il DCN, tenere un puntale della pipetta da 200 microlitri perpendicolarmente al DCN e spingere verso il basso attraverso il tessuto oscillando saldamente in tutte le direzioni.
Sollevare la pipetta e confermare visivamente la presenza del tessuto nel puntale. Metti un dito nella parte superiore della punta e spingi verso il basso, provocando il rigonfiamento del tessuto. Inserire la punta in una provetta per microfiche correttamente etichettata e assicurarsi che il punzone per tessuti sia posizionato sul fondo della provetta.
Ripetere l'operazione per le restanti tre sezioni, posizionando i punzoni DCN nello stesso tubo. Congelare la provetta in azoto liquido. Spingere via il resto del tessuto cerebrale intorno al cervelletto nelle sezioni in cui è stato estratto il DCN.
Usa una pinza smussata per raccogliere delicatamente queste sezioni della corteccia cerebellare dell'emisfero e posizionarle nelle rispettive provette per microfiche, quindi congelarle rapidamente. Per le ultime due sezioni vermalali, spingere via il tessuto cerebrale circostante per lasciare solo il cervelletto. Usando una lama di rasoio, fai un taglio separando le labiali anteriori dalle labiali posteriori.
Assicurarsi che il taglio sia subito dopo la formazione del labiale sei e non includa il labiale 10. Utilizzando una pinza smussata, posizionare con cura le sezioni della corteccia cerebellare anteriore e le sezioni della corteccia cerebellare posteriore nelle rispettive provette per microfiche e congelarle lasciando le provette in azoto liquido per cinque minuti. Posizionare le provette per microfiche sul ghiaccio per evitare che il tessuto si scongeli troppo rapidamente e applicare 150 microlitri di soluzione di isolamento dell'RNA freddo nella provetta per microfiche, quindi omogeneizzare con un pestello sterilizzato.
Una volta omogeneizzato il tessuto, pipettare la soluzione su e giù per assicurarsi che non rimanga tessuto intatto. Inoltre, rompi eventuali piccoli pezzi di tessuto tirandoli su in una siringa da insulina alcune volte. Aggiungere altri 350 microlitri di reagente, pipettare su e giù per mescolare accuratamente e lasciare riposare a temperatura ambiente per cinque minuti.
Aggiungere 150 microlitri di cloroformio al tubo e agitarlo energicamente, quindi lasciarlo riposare per due o tre minuti. Centrifugare a 12.000 volte G a 15 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cautela le provette dalla centrifuga e impostare la temperatura della centrifuga a quattro gradi Celsius.
Trasferire solo la fase acquosa limpida in una nuova provetta, facendo attenzione a non interrompere l'interfase opaca. Conservare o gettare la soluzione rimanente nelle provette. Aggiungere alcol isopropilico al 100% in un rapporto uno a due e mescolare accuratamente pipettando su e giù.
Lasciare riposare il campione a temperatura ambiente per 10 minuti per far precipitare l'RNA fuori dalla soluzione. Centrifugare a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti, posizionando tutte le provette con lo stesso orientamento per facilitare la visualizzazione del pellet. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela le provette e rimuovere il surnatante con la pipetta, facendo attenzione a non rompere il pellet.
Il pellet è simile a un gel e difficile da vedere, quindi stima dove si trova in base all'orientamento delle provette nella centrifuga. Dopo aver rimosso tutto il surnatante, aggiungere 500 microlitri di etanolo al 75%, agitare brevemente e centrifugare a 7, 500 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante con cura, senza rompere il pellet.
Lasciare i tappi aperti per asciugare il campione per cinque-10 minuti. Una volta asciutto, risospendere il pellet in acqua libera di DNA a 20 microlitri per i campioni per DCN e 30 microlitri per tutti gli altri. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a ulteriori analisi.
Questo protocollo è stato utilizzato per sezionare quattro regioni distinte del cervelletto di topo e per esplorare le differenze regionali nell'espressione genica. I livelli di espressione di aldolasi C, parvalbumina e KCNG4 sono stati valutati utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. L'aldolasi C è più espressa nel verme cerebellare posteriore.
Ma più basso nel DCN e nella regione anteriore del verme rispetto alla dissezione cerebellare di massa. La parvalbumina è presente in modo simile nel verme anteriore del DCN, nel verme posteriore e nelle cortecce cerebellari dell'emisfero, rispetto agli estratti cerebellari di massa. KCNG4 è significativamente arricchito nel DCN e nel verme interno, ma non nel verme posteriore o negli emisferi rispetto all'estrazione di massa.
Per confrontare direttamente l'espressione dell'aldolasi C attraverso la corteccia cerebellare, i livelli di espressione sono stati confrontati con il verme anteriore. Il livello di espressione dell'aldolasi C era significativamente più alto nel verme posteriore e tendeva più alto negli emisferi cerebellari. L'RNA estratto da queste regioni può essere utilizzato anche nel sequenziamento dell'RNA, negli esperimenti.
Il confronto tra questi per le regioni cerebellari fornirebbe informazioni più dettagliate sui meccanismi molecolari, alla base delle funzioni discrete di queste regioni. Così come le potenziali differenze nella loro vulnerabilità alla malattia.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un metodo per la dissezione riproducibile e rapida di regioni cerebellari distinte—nello specifico gli emisferi, le regioni anteriori e posteriori del verme e i nuclei cerebellari profondi. L'obiettivo è chiarire le differenze molecolari nell'espressione genica che potrebbero essere alla base di specifici comportamenti associati a particolari regioni cerebellari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Molecolare
- Espressione Genica
Sfondo
- Si sa che il cervelletto influisce su diverse uscite comportamentali.
- Gli studi tradizionali spesso analizzano estratti interi del cervelletto, rischiando di oscurare le differenze regionali.
- Un approccio mirato potrebbe aiutare a scoprire meccanismi molecolari specifici in aree cerebellari distinte.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per isolare l'RNA da specifiche regioni cerebellari.
- Confrontare l'espressione genica tra le diverse regioni cerebellari.
- Facilitare lo studio dei meccanismi molecolari alla base del comportamento e delle malattie.
Metodi Utilizzati
- Il metodo prevede la dissezione di regioni cerebellari da topi sottoposti a eutanasia.
- Il modello biologico chiave comprende tessuti cerebellari di topo.
- L'RNA isolato viene processato per l'analisi dell'espressione genica.
- I passaggi procedurali critici includono una dissezione accurata, il congelamento rapido e l'omogeneizzazione del tessuto.
Risultati principali
- Il protocollo consente l'identificazione delle differenze molecolari tra le regioni cerebellari.
- I risultati includono informazioni su come regioni specifiche possano contribuire in modo unico al comportamento.
- Il processo permette l'esame delle variazioni nell'espressione genica rilevanti per la funzione cerebellare.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un nuovo metodo per dissezionare e analizzare le regioni cerebellari per studi molecolari.
- L'approccio facilita la comprensione della relazione tra meccanismi specifici delle regioni cerebellari e gli esiti comportamentali.
- Le conoscenze acquisite potrebbero approfondire la comprensione della base molecolare del coinvolgimento del cervelletto in varie malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La dissezione regionale del cervelletto permette un'analisi molecolare precisa di aree cerebrali distinte, affrontando una limitazione fondamentale nella ricerca neuroscientifica in cui gli estratti di tessuto intero oscurano l'eterogeneità funzionale. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi collegando i profili di espressione genica a specifiche sottoregioni del cervelletto coinvolte nelle vie del movimento, della cognizione, dell'affettività e della ricompensa. Permettendo l'isolamento riproducibile di tessuto da zone anatomiche definite, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici e contribuisce alla riduzione del rischio meccanicistico nei programmi di scoperta di farmaci per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando le impronte molecolari da regioni cerebellari coinvolte nel controllo motorio e nelle funzioni neuropsichiatriche.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato per la dissezione dei nuclei cerebellari profondi, della corteccia vermale e della corteccia emisferica, riducendo la variabilità nelle analisi omiche successive.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera input di RNA specifici per regione adatti a qPCR e RNA-seq, consentendo il confronto quantitativo dell'espressione genica tra sottoregioni del cervelletto.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi mediante protocolli di congelamento rapido e omogeneizzazione costante, migliorando la riproducibilità tra laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita l'esplorazione della vulnerabilità regionale nei modelli di malattia mediante il confronto di profili molecolari tra zone cerebellari definite anatomicamente.
- Valore operativo: Consente la biobancarizzazione di tessuti dissecati a −80°C, sostenendo studi longitudinali e confronti incrociati tra esperimenti nei percorsi di validazione degli obiettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, supportando l'identificazione di bersagli guidata da ipotesi e la validazione preclinica fornendo dati molecolari risolti anatomicamente dal cervelletto.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la riduzione del rischio biologico consentendo la correlazione dell'espressione genica (ad esempio, Aldolasi C, parvalbumina, KCNG4) con la funzione regionale del cervelletto.
- Screening: Produce estratti di RNA standardizzati adatti a rilevamenti ad alta sensibilità, facilitando confronti affidabili degli stati molecolari tra diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Genera letture quantitative da qPCR e RNA-seq che permettono ai team di valutare l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso con precisione regionale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari ai fenotipi comportamentali permettendo l'analisi di regioni associate all'affettività, alla cognizione e alla coordinazione motoria nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un framework di dissezione riutilizzabile applicabile a diverse linee di topi e modelli di malattia, riducendo lo sviluppo metodologico ridondante.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nei bersagli rivelando meccanismi molecolari specifici di regione che rimarrebbero oscurati da analisi dell'intero cervelletto.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a passaggi standardizzati di dissezione, congelamento e isolamento dell'RNA, riducendo la varianza tecnica.
- Valore strategico: Perfeziona le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti fornendo chiarezza meccanicistica sui bersagli cerebellari, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dei programmi del sistema nervoso centrale.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sui modelli di espressione regionale e sulla rilevanza per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in neuroanatomia e tecniche di dissezione microchirurgica per garantire una netta separazione delle regioni cerebellari.
- Presuppone l'accesso a attrezzature criogeniche (azoto liquido, congelatore a −80°C) e strumenti di precisione (forbici vettoriali, pinze a punta smussata, spatola microchirurgica) per la manipolazione dei tessuti.
- Necessita di una formazione standardizzata per tutti i team al fine di mantenere la coerenza nella profondità del prelievo tissutale e nell'identificazione delle regioni.
- Deve tenere conto del rischio di degradazione dell'RNA riducendo al minimo il tempo di lavorazione e mantenendo la catena del freddo dalla dissezione alla risospensione.
- È limitato dal rendimento tissutale proveniente da piccole regioni come il DCN, richiedendo un'ottimizzazione delle quantità iniziali per applicazioni successive come l'RNA-seq con input ridotto.
