Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica
6 giugno 2021
Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .
Questo metodo è adatto per l'imaging dal vivo della dinamica citoplasmatica utilizzando estratti di uova di rana, consentendo lo studio delle informazioni sul modello spaziale nel citoplasma. I campioni possono essere modellati in uno strato con uno spessore uniforme e regolabile e ripresi su un campo 2D o un volume 3D. Questo metodo è economico e facile da implementare.
Inizia applicando uno strato di nastro adesivo FEP su un vetrino con un applicatore a rulli. Tagliare il nastro adesivo eccessivo sui bordi con una lama di rasoio pulita. Quindi, preparare allo stesso modo i vetrini di copertura rivestiti con nastro FEP.
Quindi applicare un distanziatore per immagini adesivo a doppia faccia sul lato rivestito di nastro FEP del vetrino lasciando il rivestimento protettivo non sbucciato. Trasferire le uova in un becher di vetro da 400 millilitri e rimuovere il più possibile il tampone di deposizione delle uova decantando. Quindi incubare le uova in 100 millilitri di soluzione di dejellying appena preparata e ruotarle delicatamente.
Dopo circa tre minuti, versare la soluzione e aggiungere 100 millilitri di soluzione fresca di dejelly. Continuare l'incubazione fino a quando le uova sono ben imballate, ma evitare di lasciare le uova nella soluzione di dejellying per più di un totale di cinque minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il più possibile la soluzione di dejellying e lavare le uova in tampone MMR 0,25x.
Ruotare le uova, quindi versare il tampone. Ripetere alcune volte fino a quando non viene utilizzato un totale di un litro di tampone per i lavaggi. Quindi, lavare le uova alcune volte con un totale di 400 millilitri di tampone di lisi delle uova, rimuovendo le uova anomale tra i lavaggi.
Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento con una punta larga per trasferire le uova in una provetta centrifuga a fondo rotondo da 17 millilitri contenente un millilitro di tampone per lisi delle uova. Girare il tubo in una centrifuga clinica a 400 g per 15 secondi per confezionare le uova. Quindi rimuovere il più possibile il tampone di lisi dell'uovo utilizzando una pipetta Pasteur.
Determinare il volume approssimativo delle uova confezionate. quindi aggiungere cinque microgrammi per millilitro ciascuno di aprotinina, leupeptin e citocalasina B e 50 microgrammi per millilitro di cicloesamide direttamente sopra le uova confezionate. Schiacciare le uova concentrando il tubo per 15 minuti a 12.000 g e quattro gradi Celsius in un rotore a secchio oscillante.
Quindi, collegare un ago da 18 gauge a una siringa. Con la punta dell'ago smussare verso l'alto forare il tubo dal lato nella parte inferiore dello strato citoplasmatico e recuperare l'estratto disegnando lentamente. Trasferire l'estratto citoplasmatico recuperato in una nuova provetta da microcentrifuga e tenerlo in ghiaccio.
Quando è pronto per l'immagine, integrare l'estratto con i reagenti desiderati e le sonde di imaging a fluorescenza. Rimuovere il rivestimento protettivo superiore dal distanziatore di imaging sul vetrino preparato e depositare circa sette microlitri di estratto al centro del pozzetto. Applicare immediatamente il vetrino di copertura rivestito con nastro FEP con il lato FEP rivolto verso l'estratto per sigillare il pozzetto e procedere rapidamente all'imaging.
Impostare il vetrino su un microscopio invertito o verticale con un palco motorizzato e una fotocamera digitale. Immagini degli estratti nelle posizioni spaziali desiderate in intervalli di tempo sia nei canali di campo chiaro che di fluorescenza. Un esperimento time-lapse che utilizza estratti di uova di xenopus laevis per studiare l'auto-organizzazione del citoplasma durante l'interfase è mostrato qui.
Dopo circa 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente erano visibili aree citoplasmatiche impoverite di componenti citoplasmatici che diffondono la luce sia in campo chiaro che nei canali dei mitocondri. Entro circa 60 minuti a temperatura ambiente, un modello spaziale costituito da compartimenti simili a cellule dovrebbe essere ben stabilito con microtubuli che formano una struttura cava simile a una corona e mitocondri chiaramente suddivisi in ciascun compartimento. Qui viene mostrato un confronto delle prestazioni degli estratti nelle camere di imaging con e senza nastri FEP su vetro.
Nella camera realizzata con vetro nastrato FEP l'estratto si auto-organizzato in normali modelli simili a cellule. Nella camera in cui le superfici di vetro non erano coperte dal nastro FEP, l'estratto mostrava un campo luminoso anomalo e modelli di microtubuli che diventavano sempre più interrotti nel tempo. Non sono state osservate differenze significative nell'importazione nucleare della proteina GST-mCherry-NLS.
Le cose importanti da ricordare sono di passivare le superfici di vetro con nastro FEP e di rimuovere tutte le uova cattive durante la preparazione dell'estratto. Con questo sistema, possiamo facilmente controllare lo spessore del campione estratto, aprendo la strada all'imaging di modelli citoplasmatici in 3D, utilizzando la microscopia a foglio di luce.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo semplificato per la preparazione e l'acquisizione in diretta di estratti citoplasmatici non diluiti ottenuti da uova di Xenopus laevis. La tecnica consente l'esame della dinamica citoplasmatica e lo sviluppo di modelli spaziali all'interno del citoplasma, facilitando l'approfondimento dell'organizzazione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Microscopia
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La dinamica citoplasmatica è fondamentale per comprendere l'organizzazione cellulare.
- Estratti di uova di rana offrono un sistema pertinente per lo studio di questi processi.
- Le tecniche di imaging in tempo reale favoriscono l'esplorazione del patterning spaziale nel citoplasma.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis.
- Utilizzo del nastro FEP per la stabilità del campione durante l'acquisizione delle immagini.
- Acquisizione di immagini in tempo reale mediante marcatori fluorescenti e microscopia a campo chiaro.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dell'auto-organizzazione in estratti citoplasmatici nel tempo.
- Formazione di compartimenti simili a cellule con strutture di microtubuli ben definite.
- Il confronto delle prestazioni di imaging in base ai trattamenti superficiali ha evidenziato effetti significativi sull'organizzazione dell'estratto.
Conclusioni
- Lo studio descrive un metodo pratico per l'analisi mediante imaging delle strutture e della dinamica citoplasmatica.
- I risultati migliorano la nostra comprensione dei processi cellulari e sottolineano l'importanza delle tecniche di preparazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
Questo metodo consente l'acquisizione di immagini in tempo reale della dinamica citoplasmatica in estratti di uovo di Xenopus laevis, fornendo un sistema scalabile ed economico per lo studio della formazione di schemi spaziali e dei processi di auto-organizzazione rilevanti per l'organizzazione cellulare. Eliminando la necessità di trattamenti chimici della superficie e utilizzando materiali di consumo prodotti in massa, permette una visualizzazione riproducibile e ad alta risoluzione dell'organizzazione di microtubuli, nucleo e mitocondri in un ambiente controllato in vitro. L'approccio aumenta la fiducia predittiva negli studi meccanicistici del comportamento citoplasmatico, sostenendo la validazione precoce di bersagli e lo sviluppo di saggi nelle fasi iniziali dei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima scoperta e validazione del bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di auto-organizzazione citoplasmatica e di patterning spaziale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica in un sistema di estratto fisiologicamente rilevante.
- Biomarcatore traslazionale: Facilita l'identificazione di caratteristiche citoplasmatiche dinamiche che potrebbero correlare con stati cellulari funzionali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Standardizzazione del saggio: Fornisce una piattaforma riproducibile per la preparazione di estratti con spessore e stabilità uniformi mediante passivazione con nastro FEP.
- Output quantitativi: Consente la misurazione della dinamica citoplasmatica e dell'organizzazione spaziale tramite immagini in campo chiaro e in fluorescenza a intervalli di tempo.
- Prontezza per lo screening: Offre un sistema scalabile e a basso costo, compatibile con microscopia a campo ampio e confocale, per la valutazione dell'effetto di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Modello Rilevante per le Malattie: Funge da modello meccanicistico per lo studio di processi citoplasmatici conservati, rilevanti per la divisione e l'organizzazione cellulare.
- Convalida Predittiva: Permette di ridurre i rischi associati a bersagli coinvolti nella regolazione del citoscheletro e nel patterning spaziale, grazie alla visualizzazione diretta dell'auto-organizzazione dell'estratto.
- Continuità Traduttiva: Collega le osservazioni della fase di scoperta alla validazione preclinica, stabilendo un modello citoplasmatico coerente e pronto per l'analisi mediante imaging.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio allo sviluppo del saggio e alla validazione preclinica, in particolare per bersagli che influenzano la dinamica del citoscheletro e l'organizzazione subcellulare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione diretta della dinamica di microtubuli e mitocondri in estratti in interfase.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio grazie alla preparazione standardizzata degli estratti e a condizioni di imaging stabili, senza trattamenti chimici delle superfici.
- Analisi: Genera dati quantitativi spaziali e temporali sull'organizzazione citoplasmatica, consentendo analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico fornendo un modello coerente per lo studio di processi conservati di organizzazione cellulare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile e a basso costo, adattabile a diversi bersagli e campagne di screening.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi sull'organizzazione citoplasmatica.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso la preparazione standardizzata degli estratti e il passivamento superficiale basato su nastro FEP.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo una visualizzazione precoce degli effetti fenotipici sulla dinamica citoplasmatica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio fornendo informazioni meccanicistiche sui composti che influenzano l'organizzazione cellulare.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di uova di Xenopus, nella preparazione di estratti e nelle tecniche di imaging in vivo.
- È subordinato all'accesso a centrifughe, sistemi di microscopia (a campo chiaro/confocale) e nastro adesivo in FEP e distanziatori per imaging.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi per quanto riguarda i protocolli di lavaggio delle uova, di desgelatinizzazione e di recupero degli estratti.
- L'adattamento all'imaging 3D potrebbe richiedere l'integrazione con microscopia a foglio luminoso e l'ottimizzazione del controllo dello spessore del campione.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla qualità delle uova e la necessità di rimuovere le uova anomale durante la preparazione per garantire la coerenza degli estratti.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
