Name: Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare limpatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Scopri la transfezione inversa di adipociti 3T3-L1 per studiare l'espressione di proteine e micro-RNA. Questo metodo efficiente consente esperimenti funzionali su segnalazione insulinica e metabolismo glucidico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dall'INSERM, dall'Université Côte d'Azur e dall'Agenzia Nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso il programma Investimenti per il futuro Laboratorio di Eccellenza (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. è sostenuta da sovvenzioni della Société Francophone du Diabète (SFD), dell'Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), dell'Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e della Fondation Benjamin-Delessert. J.G. è supportato da ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. è sostenuta dalla sovvenzione ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e da una sovvenzione della Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, che è anche supportato dalla GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).

NOTA: Utilizzare tecniche sterili per eseguire tutte le fasi del protocollo in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare. Vedere tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti e le apparecchiature.
1. Differenziazione dei fibroblasti murini 3T3-L1 in adipociti
<ol><li>Coltivare i fibroblasti 3T3-L1 in piatti da 100 mm in DMEM medio di coltura senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% siero di vitello neonato e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1A). Posizionare i piatti in un incubatore di colture tissutali (7% CO2 e 37 °C).</li>
	<li>Due giorni dopo la confluenza, cambiare il terreno di coltura, sostituendo con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 1% di penicillina e streptomicina integrate con 0,25 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,25 μM di desametasone, 5 μg/ml di insulina e 10 μM di rosiglitazone. NOTA: Ci vogliono 5 giorni per raggiungere la confluenza quando le cellule vengono seminate a 300.000 cellule per piatto da 100 mm.</li>
	<li>Due giorni dopo, sostituire il terreno di coltura con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina integrati con 5 μg / mL di insulina e 10 μM di rosiglitazone e incubare per 2 giorni. Quindi, nutrire le cellule ogni 2 giorni con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1B).</li>
	<li>Trasfettate gli adipociti 3T3-L1 7-8 giorni dopo l'inizio del protocollo di differenziazione. NOTA: È importante raggiungere un alto livello di differenziazione (>80%) prima della trasfezione per evitare la proliferazione dei fibroblasti rimanenti dopo la trasfezione, che porterebbe a una popolazione mista di cellule che potrebbe influenzare i risultati.</li>
</ol>2. Preparazione di piastre precoate
<ol><li>Il giorno prima o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 μg/mL in etanolo al 30% da una soluzione stock a 1 mg/mL. Aggiungere 250 μL di collagene per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e 125 μL per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzo.</li>
	<li>Lasciare il piatto senza il coperchio sotto il cappuccio della coltura fino a quando il collagene si asciuga. Lavare due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS). NOTA: le piastre precoate sono disponibili per l'acquisto.</li>
</ol>3. Preparazione della miscela di trasfezione
NOTA: La concentrazione finale di siRNA è compresa tra 1 e 100 nM (da 1 a 100 pmol di siRNA per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti). La concentrazione finale del miR mimic è 10 nM (10 pmol/pozze). Determinare la migliore concentrazione di ciascun siRNA, miR mimic o altro oligonucleotide prima di iniziare l'esperimento per evitare effetti fuori bersaglio. Eseguire esperimenti di trasfezione in triplice copia per facilitare l'analisi statistica dei risultati. Preparare tutti i reagenti in eccesso per tenere conto della normale perdita durante il pipettaggio.
<ol><li>Mescolare mediante pipettaggio (volume/volume) il siRNA (o altri oligonucleotidi) con minimale essenziale migliorato (Tabella 1). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere il reagente di trasfezione e il minimal essential medium migliorato al siRNA e il pipetto da miscelare (Tabella 1). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (durante questo periodo, procedere al paragrafo 4). Aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzo della piastra rivestita di collagene.</li>
</ol>4. Preparazione degli adipociti 3T3-L1
<ol><li>Lavare le celle nella capsula di Petri da 100 mm due volte con D-PBS. Aggiungere 5x tripsina alle cellule (1 mL per piatto da 100 mm), assicurandosi di coprire tutta la superficie con la tripsina. Attendere 30 s e rimuovere con attenzione la tripsina.</li>
	<li>Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatrice. Toccare la parabola da 100 mm per staccare le celle.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina. Pipettare con cura il mezzo su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di celle automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 105 celle / mL di mezzo. Seminare 800 μL della sospensione/pozzetti cellulare di una piastra a 12 pozzetti (5 x 105 cellule) o 400 μl della sospensione/pozzettino cellulare di una piastra a 24 pozzetti (2,5 x 105 cellule) contenente la miscela di trasfezione. NOTA: Una capsula di Petri da 100 mm di adipociti consentirà la preparazione di una piastra da 12 pozzetti o di una piastra da 24 pozzetti. Un piatto da 100 mm di solito contiene 6-7 x10 6 adipociti, che corrispondono a 5 x10 5 adipociti per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.</li>
	<li>Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari (7% CO2 e 37 °C) e non disturbare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina. NOTA: È anche possibile seminare le cellule in piastre a 48 e 96 pozzetti precoate di collagene, ma prendere maggiori precauzioni quando si sostituisce il mezzo per evitare il distacco degli adipociti.</li>
</ol>5. Analisi funzionale di adipociti 3T3-L1 trasfettato
<ol><li>Target di studio knockdown 24-48 h e 48-96 h dopo siRNA o miR mimic delivery per mRNA e proteine, rispettivamente.</li>
	<li>Eseguire analisi funzionali degli adipociti trasfetti per studiare la segnalazione dell'insulina, l'assorbimento del glucosio, la secrezione di adipochine, la lipolisi e la lipogenesi.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento presenta un protocollo dettagliato per la differenziazione e la trasfezione di adipociti maturi. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi come, ma non solo, siRNA, imitazioni di micro-RNA e anti-micro-RNA in adipociti 3T3-L1, che è una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo metodo ha alcune limitazioni che devono essere considerate. Questo protocollo non è efficiente per la trasfezione con DNA plasmidic...

L'obesità è considerata un importante fattore di rischio per numerose malattie metaboliche, tra cui la resistenza all'insulina (IR), il diabete di tipo 2 (T2D) e le malattie cardiovascolari1. Le terapie attuali non sono riuscite a fermare la prevalenza in costante aumento di queste malattie e la gestione dell'IR di pazienti obesi e diabetici rimane un importante problema clinico. Il tessuto adiposo svolge un ruolo cruciale nel controllo dell'omeostasi energetica e la sua espansione patologica durante l'obesità contribuisce allo sviluppo di IR e T2D2,3. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Molti studi di ricerca hanno studiato il ruolo degli RNA codificanti proteine nella fisiologia degli adipociti e la loro associazione con l'obesità.
Più recentemente, la scoperta di RNA non codificanti (ncRNA), in particolare micro-RNA (miR), ha forgiato nuovi concetti relativi al meccanismo di regolazione dei programmi di espressione genica. Gli studi hanno dimostrato che gli ncRNA sono importanti regolatori della funzione degli adipociti e che la loro disregolazione svolge un ruolo importante nelle malattie metaboliche4. Pertanto, la manipolazione di proteine e ncRNA negli adipociti è cruciale per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro impatto su patologie come il T2D. Tuttavia, manipolare l'espressione di proteine e ncRNA in vivo e negli adipociti primari rimane molto impegnativo, favorendo l'uso di modelli di adipociti in vitro.
I fibroblasti murini 3T3-L1 si differenziano facilmente in adipociti maturi, funzionali e insulino-responsi, che sono una linea cellulare ben caratterizzata utilizzata per studiare la funzione degli adipociti (ad esempio, segnalazione di insulina, assorbimento di glucosio, lipolisi e secrezione di adipochine)5,6,7,8,9,10. Queste proprietà rendono gli adipociti 3T3-L1 un modello interessante per modulare l'espressione di proteina-codifica e nc-RNA per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità. Sfortunatamente, mentre i fibroblasti 3T3-L1 sono facili da trasfettare utilizzando reagenti disponibili in commercio, gli adipociti 3T3-L1 differenziati sono una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo è il motivo per cui numerosi studi che manipolano l'espressione genica nelle cellule 3T3-L1 si sono concentrati sulla differenziazione degli adipociti piuttosto che sulla funzione degli adipociti.
Per molto tempo, l'unica tecnica efficiente per trasfezionare gli adipociti è stata l'elettroporazione5, che è noiosa, costosa e può causare danni alle cellule. Questo documento riporta una tecnica di trasfezione inversa che utilizza un reagente di trasfezione comune, che riduce il tempo pratico per la trasfezione, non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare ed è molto meno costoso dell'elettroporazione. Questo protocollo è perfettamente adatto per la trasfezione di siRNA e altri oligonucleotidi come i micro-RNA mimics (miR mimics) e anti-miRs. Il principio del protocollo di trasfezione inversa è quello di incubare il reagente di trasfezione e gli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare e quindi seminare gli adipociti maturi nei pozzetti. Quindi, gli adipociti si riattaccano alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Questa metodologia semplice, efficiente e poco costosa consente di studiare il ruolo degli RNA e dei miR codificanti proteine nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2,5% di tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>diluita a 5x con D-PBS</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Non-targeting Pool</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I da pelle di vitello</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Medium Eagles's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4,5 g/L di D-glucosio; L-glutammina; no Piruvato</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr> Controllo <tr><td>negativo marcato con FAM si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Reagente glicerolo libero</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione standard di glicerolo</td><td>Anticorpo</td><td></td> Sigma-Aldrich G7793 <td></td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Diluizione : 0,5 & micro; g/mL</td></tr><tr><td>Terreno minimo essenziale migliorato (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, umano ricombinante</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA imita Horizon</td><td>Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Saggi Hs_RNU6-2_11</td><td>Saggi Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Siero per vitelli neonati</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Olio rosso O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Scoperta</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina e streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo perilipina-1</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3470</td><td>Diluizione: 1/1000</td></tr><tr><td>Piastra di Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9272</td><td>Diluizione: 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Phospho Thr308</td><td>anticorpo Cell Segnalazione</td><td>9275</td><td>Diluizione : 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-tubulina anticorpo</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Diluizione : 0,5 &; g/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 anticorpo</td><td>R& Sistemi D</td><td>MAB5136</td><td>Diluizione : 0,1 &micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-rna sulla funzione degli adipociti

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

L'alterazione della funzione degli adipociti contribuisce alla patogenesi delle malattie metaboliche tra cui il diabete di tipo 2 e l'insulino-resistenza. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti rimane molto impegnativo. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare i fibroblasti murini in adipociti maturi e per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti maturi attraverso la trasfezione inversa utilizzando oligonucleotidi a RNA a interferenza piccola (siRNA) e micro-RNA che imitano (miR mimic). Questo protocollo di trasfezione inversa prevede l'incubazione del reagente di trasfezione e degli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare a cui vengono aggiunti gli adipociti maturi. Gli adipociti sono quindi autorizzati a riattaccarsi alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Analisi funzionali come lo studio della segnalazione dell'insulina, dell'assorbimento del glucosio, della lipogenesi e della lipolisi possono essere eseguite sugli adipociti maturi 3T3-L1 trasfetti per studiare l'impatto della manipolazione di proteine o micro-RNA sulla funzione degli adipociti.

Utilizzando la procedura di reverse-transfection qui descritta per modulare l'espressione di proteine o micro-RNA negli adipociti 3T3-L1, gli adipociti hanno dimostrato di preservare la loro morfologia dopo la trasfezione (Figura 1B,C). Infatti, 2 giorni dopo la trasfezione, gli adipociti erano ben diffusi e attaccati alla piastra e presentavano goccioline lipidiche multiloculari che sono una caratteristica degli adipociti 3T3-L1 maturi. Il c...

Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Questo protocollo consente di manipolare proteine, o espressione di microRNA, in adipociti differenziati per studiare il loro ruolo nella funzione degli adipociti. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi in adipociti 3T3-L1 di topo. Questo metodo può essere applicato anche ai preadipociti umani differenziati in adipociti.A dimostrare la procedura sarà Melanie Gaudfrin, un tecnico del nostro laboratorio. Coltiva i fibroblasti 3T3-L1 in piatti da 100 millimetri in DMEM senza piruvato, glucosio 25 millimolare, siero di vitello appena nato al 10% e penicillina e streptomicina all'uno percento. Posizionare i piatti in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius e al sette percento di anidride carbonica.Due giorni dopo la confluenza, cambiare il terreno di coltura, sostituendolo con DMEM senza piruvato, 25 millimolare di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina integrati con 0,25 millimolari IBMX, 0,25 desametasone micromolare, cinque microgrammi per millilitro di insulina e 10 rosiglitazone micromolare. Incubare i piatti per due giorni. Due giorni dopo, sostituire il terreno di coltura con DMEM senza piruvato, 25 millimolari di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina integrati con cinque microgrammi per millilitro di insulina e 10 rosiglitazone micromolare e incubare per altri due giorni.Nutrire le cellule ogni due giorni con DMEM senza piruvato, glucosio 25 millimolare, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina e mantenere le cellule nell'incubatrice. Un giorno o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 microgrammi per millilitro in etanolo al 30% da una soluzione stock a un milligrammo per millilitro. Aggiungere 250 microlitri di collagene per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti o 125 microlitri per pozzetti per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzo.Lasciare il piatto senza il coperchio sotto il cappuccio della coltura fino a quando il collagene si asciuga. Quindi lavarlo due volte con D-PBS. Pipettare il siRNA con un mezzo essenziale minimo migliorato per miscelare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.Aggiungere il reagente di trasfezione e il mezzo essenziale minimo migliorato al siRNA e alla pipetta per mescolare. Incubarlo per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzo della piastra rivestita di collagene.Lavare le cellule nella capsula di Petri da 100 millimetri due volte con D-PBS. Aggiungere 5x tripsina alle cellule, assicurandosi di coprire l'intera superficie con la tripsina. Attendere 30 secondi e rimuovere con attenzione la tripsina.Incubare la capsula di Petri per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatrice. Quindi toccare il piatto per staccare le cellule, evitando danni alle cellule. Aggiungere 10 millilitri di DMEM senza piruvato, 25 millimolari di glucosio, 10% FCS e l'uno per cento di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina.Pipettare con cura il mezzo su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di celle automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 0,625 milioni di cellule per millilitro di mezzo. Seminare 800 microlitri della sospensione cellulare per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti o 400 microlitri della sospensione cellulare per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente la miscela di trasfezione.Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari e non disturbarle per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, glucosio 25 millimolare, 10% FCS e penicillina e streptomicina all'uno per cento e restituire le cellule all'incubatrice. I punti temporali tipici per rilevare l'abbattimento del bersaglio dopo la consegna di siRNA o miR sono da 24 a 48 ore per l'mRNA e da 48 a 96 ore per le proteine.Esperimenti funzionali possono essere eseguiti su adipociti trasfetti tra cui la segnalazione di insulina, l'assorbimento di glucosio, la secrezione di adipochine, la lipolisi e la lipogenesi. Gli adipociti hanno dimostrato di preservare la loro morfologia dopo la trasfezione. Due giorni dopo la trasfezione, gli adipociti hanno presentato goccioline lipidiche multiloculari con contenuto lipidico non diverso tra gli adipociti trasfettate e non trasfettate.L'espressione dell'mRNA di vari marcatori di differenziazione è rimasta invariata nelle cellule trasfettate rispetto a quella degli adipociti non trasfettate. Il protocollo di trasfezione inversa è efficiente in quanto oltre il 70% degli adipociti sono stati trasfettate. Tre giorni dopo la trasfezione con siRNA contro Perilipin-1, il livello di mRNA di Perilipin-1 era diminuito del 70% e il livello proteico del 63% L'espressione di Perilipin-1 è stata analizzata anche al microscopio a fluorescenza quattro giorni dopo la trasfezione ed è risultato essere diminuita del 92% rispetto alla sua espressione negli adipociti di controllo.La trasfezione inversa di adipociti con microRNA che imita oligonucleotidi per up-regolare l'espressione di miR-34a è mostrata qui. La sovraespressione di miR-34a ha portato alla diminuzione dell'espressione della proteina VAMP2 del 50%L'abbattimento della perilipina-1 negli adipociti 3T3-L1 ha portato ad un aumento della lipolisi basale mentre la sovraespressione di miR-34a ha portato all'inibizione della fosforilazione della proteina chinasi B indotta dall'insulina e all'assorbimento del glucosio. È importante raggiungere un alto livello di differenziazione degli adipociti per eseguire la trasfezione su adipociti di nuova differenziazione e monitorare attentamente il trattamento degli adipociti con tripsina.Dopo la trasfezione, è possibile eseguire esperimenti funzionali sugli adipociti per studiare l'impatto della manipolazione di proteine o microRNA sulla segnalazione dell'insulina, sull'assorbimento del glucosio, sulla lipogenesi e sulla lipolisi.

an-adipocyte-cell-culture-model-to-study-impact-protein-micro-rna

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Il tessuto adiposo (AT) può influenzare l'omeostasi di tutto il corpo, quindi è importante comprendere i meccanismi molecolari della differenziazione e della funzione degli adipociti. Forniamo un protocollo per ottenere nuove informazioni su questi processi analizzando l'omeostasi degli adipociti, la differenziazione e l'esposizione all'ipossia come modello per l'apoptosi indotta degli adipociti.

Meccanismo di regolazione dei numeri adipociti in organismi adulti attraverso la differenziazione e l&#39;apoptosi omeostasi

Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.

Una piattaforma di Microphysiologic per grasso umano: Sandwich tessuto adiposo bianco

La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall'adiposo umano e come impostare il MAAC.

Isolamento e cultura degli adipociti maturi umani utilizzando le colture aggregate adipocite mature membrana (MAAC)

Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Qui, descriviamo un protocollo per isolare, coltivare e fenotipizzare le cellule endoteliali microvascolari dal tessuto adiposo sottocutaneo umano (hSATMVECs). Inoltre, descriviamo un modello sperimentale di cross-talk hSATMVEC-adipociti.

Studio del cross-talk tra cellule endoteliali adipose e adipociti nel tessuto adiposo sottocutaneo umano

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Test di sensibilità visiva in lucertole utilizzando un paradigma di condizionamento operante che si avvale di riproduzione video di casuale-puntino kinematograms e generati dal computer invertebrati.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Generate dal computer usando stimoli il drago Jacky come modello.

Computer-Generated modello animale Stimoli

Scopri la transfezione inversa di adipociti 3T3-L1 per studiare l'espressione di proteine e micro-RNA. Questo metodo efficiente consente esperimenti funzionali su segnalazione insulinica e metabolismo glucidico.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare limpatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti (Video) | JoVE Journal

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Esplora altri video