Sintesi di pirazolo dipendente dal pH, imidazolo e fluorofori di Isoindolone Dipyrrinone usando un approccio di condensazione claisen-schmidt

La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt è una reazione secolare, riportata per la prima volta da Claisen e Schmidt contemporaneamente nel 1881. Comporta l'aggiunta enolata assistita dalla base di un chetone o di un'aldeide, mostrata in blu, in un'aldeide aromatica, mostrata in rosso. Inizialmente, l'aggiunta dell'enolato comporta la formazione di un alcol, come mostrato tra parentesi.

Tuttavia, una successiva disidratazione alla fine produce un enone. Poiché l'aro-aldeide non contiene un idrogeno alfa, non può formare un enolato. Di conseguenza, basi spesso deboli, come l'idrossido, possono essere utilizzate per generare l'enolato.

La condensazione di Claisen-Schmidt è stata usata per generare un certo numero di composti nel corso degli anni. Tuttavia, è stato ampiamente utilizzato per unire i sistemi di anelli aromatici dei calconi e dei flavanoni, che sono mostrati in rosso e blu. La porzione blu indica che derivata dall'enolato e dal rosso è della porzione aromatica.

I calconi e i flavanoni sono fondamentali per una serie di molecole biologicamente attive che possiedono una serie di attività, come antibatterico, antifungino, antinfiammatorio e antitumoro, a seconda del modello di sostituzione. Un'altra ampia classe di molecole generate dalla reazione di condensazione di Claisen-Schmidt sono i composti colmanici della metina di cui diamo esempi in questo studio. Il nostro laboratorio è interessato ai costituenti fluorescenti della bilirubina pigmentata, che produce naturalmente un prodotto di degradazione dell'eme.

La sintesi della bilirubina e di molti dei suoi costituenti ruota attorno alla condensazione di tipo Claisen-Schmidt, che può essere visualizzata nelle strutture visualizzate dall'enolato blu e dai componenti dell'aldeide aromatica rossa. Tipicamente, i costituenti diretti della bilirubina, come i dipirrinone, non sono fluorescenti. Tuttavia, se si conciano i due gruppi azotati con un gruppo metilene o carbonile, le molecole risultanti diventano altamente fluorescenti, come nel caso delle xantoglow.

Normalmente, i dipirrinone assorbono la luce UV o blu, il che si traduce in un processo di isomerizzazione da Z a E. Come i dipirrinones non abbreviati, la N nei dipirrinoni colati assorbe anche la luce UV o blu, ma differiscono in quanto si rilassano in uno stato eccitato tramite fluorescenza. Di recente abbiamo scoperto una serie di derivati del dipirrinone che in realtà fluoresce senza un ponte covalente che collega i due gruppi azotati.

Invece, un legame idrogeno sembra scoraggiare il processo di isomerizzazione da Z a E, portando ad una modalità di fluorescenza. Inoltre, è stata fatta una scoperta imprevista che queste molecole possono essere deprotono nei mezzi di base, portando a spettri di emissione di assorbimento verso il rosso negli stati deprotonati. Di conseguenza, queste molecole possono avere valore come sonde di pH ratiometriche.

Vengono utilizzati i derivati fluorescenti del dipirrinone, generando un leggero adattamento nella tradizionale reazione di condensazione di Claisen-Schmidt. Questo protocollo si discosta dalla tradizionale reazione di condensazione di Claisen-Schmidt in quanto un enolato vinilegoo derivato da un pirrolinone o isoindolone è la sorgente nucleofila. L'enolato vinilegoo aggiunge ad un'aldeide di pirazolo o imidazolo per generare una piccola libreria di analoghi di dipirrinone.

La procedura utilizzata per creare questa libreria è illustrata nel video. Tuttavia, passi analoghi possono essere usati per eseguire la tradizionale reazione claisen-schmidt. Mentre la reazione di Claisen-Schmidt è stata ed è ancora una reazione sintetica ampiamente utilizzata, questo è il primo conteggio video di questo metodo, a cui siamo consapevoli.

Per prepararsi alla sintesi di un analogo fluorescente dipyrrinone tramite condensazione aldolare, pesare equivalenti uguali del nucleofilo scelto e dell'elettrofilo. Quindi aggiungerli a un pallone inferiore rotondo da 25 millilitri contenente una barra di agitazione magnetica. Misurare cinque millilitri di etanolo usando un cilindro graduato.

Quindi aggiungere l'etanolo al pallone inferiore rotondo. Misurare 2,4 millilitri di idrossido di potassio molare precedentemente preparato utilizzando un cilindro graduato. Quindi aggiungere l'idrossido di potassio al pallone.

Per impostare il pallone in reflusso, applicare una quantità sufficiente di grasso sottovuoto sul giunto in vetro macinato di un condensatore di reazione per evitare il sequestro dei giunti di vetro macinato. Collegare il condensatore a un alimentatore di acqua fredda, quindi attaccare il giunto unto del condensatore al pallone inferiore rotondo. Quindi posizionare il pallone in un bagno d'olio o su un blocco riscaldante in alluminio in grado di mantenere una temperatura costante tramite coppia termica con un agitatore a piastra calda.

Riscaldare alla temperatura di reflusso lasciando che la reazione si mescola. La miscela di reazione deve essere monitorata mediante cromatografia a strato sottile in una, tre, sei, 12 e 24 ore per valutare la velocità di reazione e verificare il consumo completo delle materie prime. Lasciare raffreddare il pallone a temperatura ambiente, quindi evaporare il solvente etanolo utilizzando un evaporatore rotante.

Mettere il pallone in un bagno di ghiaccio e lasciare che il pallone equilibra alla temperatura del bagno di ghiaccio nel corso di cinque minuti. Neutralizzare l'idrossido di potassio rimanente nel pallone aggiungendo 1,7 millilitri di acido acetico in un'unica porzione. Se la formazione di cristalli si è verificata dopo la neutralizzazione, seguire la procedura di purificazione della filtrazione sottovuoto.

Se non è stata osservata alcuna formazione cristallina, seguire la procedura di purificazione della cromatografia della colonna flash. Posizionare un pezzo rotondo di carta da filtro sopra l'imbuto e bagnare leggermente la carta usando acqua deionizzata per aderire all'imbuto. Per prepararsi alla filtrazione sottovuoto dei cristalli, montare un imbuto Hirsch o Buchner su un pallone laterale utilizzando un adattatore in gomma montato.

Per evitare l'intasamento della carta filtrante che può impedire la filtrazione, abbiamo utilizzato un imbuto Hirsch o Buchner più grande di quello tipico per processi di filtrazione su scala simili. Versare il contenuto dal pallone inferiore rotondo sulla carta da filtro e lasciare filtrare la miscela. Risciacquare i cristalli durante il processo di filtrazione utilizzando 10 millilitri di acqua deionizzata ghiacciata.

Dopo la filtrazione, trasferire i cristalli in un pallone inferiore rotondo da 25 millilitri. Applicare una leggera mano di grasso sottovuoto a un adattatore di vetro a linea sottovuoto ad alta potenza, quindi collegare l'adattatore al pallone inferiore rotondo. Fissare il giunto in vetro con una clip Keck.

Per preparare il vuoto ad alta potenza per asciugare i cristalli di qualsiasi solvente residuo, raffreddare adeguatamente la trappola per vuoto di vetro con una miscela di ghiaccio secco e acetone. Collegare una linea di vuoto ad alta potenza all'adattatore di vetro collegato al pallone inferiore rotondo. Accendere la pompa per vuoto ad alta potenza e lasciare asciugare i cristalli per almeno un'ora.

Una volta che i cristalli sono stati sufficientemente asciugati sotto vuoto, spegnere la pompa del vuoto e rilasciare la guarnizione sottovuoto per rimuovere il pallone inferiore rotondo. Pesare i cristalli essiccati per segnalare la resa percentuale di reazione. Per prepararsi alla purificazione tramite cromatografia a colonna flash, aggiungere la miscela trattata con acido che non formava cristalli dalla procedura di sintesi a un imbuto separatore.

Misurare 10 millilitri di diclorometano usando un cilindro graduato e utilizzarlo per diluire la miscela trattata con acido nell'imbuto separatore. Chiudere e scuotere delicatamente l'imbuto separatore assicurandosi di sfogarsi frequentemente. In seguito, due livelli separati dovrebbero essere visibili nell'imbuto separatore.

Estrarre lo strato acquoso utilizzando altri cinque millilitri di diclorometano. Completare questo passaggio altre due volte. Unire tutte le frazioni organiche e aggiungere una quantità sufficiente di solfato di sodio anidro per asciugare le frazioni organiche.

Trasferire le frazioni organiche essiccate in un pallone di fondo rotondo e rimuovere il diclorometano utilizzando un evaporatore rotante. Diluire il residuo rimanente con altri cinque millilitri di diclorometano. Preparare una colonna utilizzando circa 75 grammi di gel di silice e utilizzarla per eseguire la cromatografia a colonna flash sul campione, utilizzando il 10% di metanolo in diclorometano come eluente.

Evaporare l'eluente dalle frazioni raccolte utilizzando un evaporatore rotante. Preparare la pompa per vuoto ad alta potenza e la trappola per solventi di vetro, come descritto in precedenza nella procedura di purificazione della filtrazione sottovuoto, e lasciare asciugare il solido raccolto sotto vuoto alto per almeno un'ora. Una volta che i cristalli sono stati sufficientemente asciugati sotto vuoto, pesare i cristalli essiccati per segnalare la resa percentuale di reazione.

Per confermare la struttura di ciascuno degli analoghi del dipirrinone nella libreria, sono stati utilizzati diversi metodi spettroscopici in combinazione, tra cui spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, spettroscopia infrarossa e spettrometria di massa ad alta risoluzione. UV-Vis e spettroscopia fluorescente sono stati utilizzati nella caratterizzazione fotofisica degli analoghi fluorescenti del dipirrinone. Usando la reazione di condensazione di Claisen-Schmidt, siamo stati in grado di sintetizzare una piccola libreria di 10 composti, inclusa quella di un composto di controllo che non può impegnarsi in legami idrogeno intermolecolari.

Le rese per gli analoghi del dipirrinone variavano da circa il 40% a quasi quantitativo e sono elencate sotto ogni molecola. I composti con le rese quantici più elevate, sia nella forma protonata che in forma deprototonata, sono derivati da 2-formylimidazolo e sono visualizzati in scatole rosa. Il composto di controllo, che non fluoresce, è in una scatola di ciano.

I derivati del dipirrinone sotto una lampada standard a lunghezza d'onda lunga 365 nanometri danno la fluorescenza osservata. Si può osservare visivamente la fluorescenza spostamento verso il rosso che deriva dalla deprotonazione. Attraverso il colore delle fiale, passano dal blu al ciano di colore.

Per dati più quantitativi sulle proprietà fotofisiche e altre proprietà fisiche dei derivati del dipirrinone, invochiamo gli spettatori alla tabella due nella parte scritta del manoscritto. Nel complesso, la reazione di condensazione di Claisen-Schmidt fornisce l'accesso a una serie di composti aromatici biciclici legati alla metina. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni.

La reazione dipende dall'uso sia di un nucleofilo enolabile che di un elettrofilo aldeide non enoluibile, come un'aro-aldeide, al fine di subire una condensa di successo. Nel non soddisfare questo requisito di base, i tentativi di eseguire questa reazione probabilmente si tradurranno nell'incapacità di collegare tra loro i sistemi ad anello e/o la generazione di prodotti collaterali concorrenti. Un'altra considerazione è che le condizioni di base sono utilizzate per generare il nucleofilo enolato che può creare incompatibilità con gruppi funzionali suscettibili a reazioni con idrossido.

In questi casi, è possibile sostituire l'idrossido con basi azotate o carbonato che è stato realizzato con DBU, trietilammina, piperidina, base di Hunig e carbonato di sodio. Abbiamo semplicemente scelto di utilizzare idrossido di potassio a causa della sua disponibilità e delle relative spese. Nonostante queste limitazioni, il metodo delineato nel protocollo può fornire un mezzo per accoppiare anelli aromatici per numerosi sistemi attraverso una reazione in un solo passaggio proceduralmente semplice ed economica.

Nel caso degli analoghi del dipirrinone che abbiamo sintetizzato, la condensazione di Claisen-Schmidt ha permesso una delle vie più accessibili ai fluorofori dipendenti dal pH descritti fino ad oggi. Tuttavia, i progetti futuri di analoghi del dipirrinone saranno sviluppati utilizzando la procedura delineata al fine di generare composti fluorescenti con una maggiore capacità di legame dell'idrogeno intermolecolare e valori pKa inferiori. Anticipare queste sonde potenziate dipendenti dal pH possederà rese quantiche più elevate, consentendo al contempo la visualizzazione delle fluttuazioni del pH per una gamma più ampia di eventi intracellulari.