Name: Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso lorgano di Corti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse di cellule vive per studiare la migrazione di cellule staminali mesenchimali verso l'organo di Corti. Questo metodo semplificato riduce tempi e costi rispetto ai protocolli tradizionali.

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Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) della National Research Foundation (NRF) della Corea e del Fondo di ricerca universitaria Hallym.

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua.
1. Dissezione delle cocche
<ol><li>Sterilizzare la cappa di coltura del tessuto di flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per ~ 30 minuti e spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo prima dell'uso. Lasciare asciugare le superfici.</li>
	<li>Posizionare gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti e asciugare prima dell'uso.</li>
	<li>Utilizzare una lama operativa per decapitare topi postnatali di 3-4 giorni (Figura 2A).</li>
	<li>Posizionare il cranio sotto uno stereomicroscopio nella cappa di flusso laminare e immergere il tessuto in etanolo al 70%.</li>
	<li>Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale (1x soluzione di sale bilanciato di Hank, 1 mM HEPES) per rimuovere l'etanolo.</li>
	<li>Tagliare l'altura del cranio con una lama chirurgica(Figura 2B,C).</li>
	<li>Esporre il cranio tirando la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio (Figura 2D).</li>
	<li>Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi (Figura 2E).</li>
	<li>Aprire il cranio e rimuovere ilencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con forcep smussate (Figura 2F,G).</li>
	<li>Utilizzando micro forcep, separare i coclea dall'osso temporale (Figura 2H).</li>
	<li>Trasferire le cocche in una piastra di Petri contenente soluzione di dissezione tissutale.</li>
	<li>Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare, lasciando solo il tessuto molle cocleare interno(Figura 2I,J).</li>
	<li>Tenere il modiolo delle coclee con le flessori e il condotto cocleare con un'altra coppia di forcelle e separare lentamente i due tessuti (Figura 2K).</li>
	<li>Rimuovere la vascolarizzazione della striata e la membrana tectoriale staccandole delicatamente(Figura 2L,M).</li>
	<li>Posizionare un coverslip di plastica sterilizzato in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti su un coverslip di 9 mm di diametro, assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso(Figura 2N-P).</li>
	<li>Immobilizzare il tessuto premendo la membrana del Reissner e il tessuto di modiolo rimanente sul copriletto con pinze(Figura 2N-P).</li>
	<li>Trasferire il copriletto con il tessuto incorporato al centro di un piatto confocale di 35 mm di diametro.</li>
	<li>Posizionare il cilindro di clonazione del vetro sul piatto, con l'espianto cocleare posizionato al centro del piatto, e aggiungere 100 μL di mezzo di coltura di espianto (DMEM/F12, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di integratore N2, ampicillina (10 μg/mL))10 all'interno del cilindro(Figura 2Q).</li>
	<li>Piastra 5 × 103 cellule di MSC con proteina fluorescente verde derivata dal midollo osseo del topo (GFP) in 2 mL di mezzo di coltura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% supplemento N2, 10 μg/mL di ampicillina) al di fuori del cilindro divetro (Figura 2R).<ol>
<li>Quando gli MBC sono confluenti all'80-90%, passare loro staccandoli con acido tetraacetico tripsideina-etilendiammina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire con cura il piatto confocale in un incubatore umidificato e incubare durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.</li>
	<li>Aspirare tutto il mezzo all'interno e all'esterno del cilindro, quindi rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di mezzo di coltura fresco al piatto confocale e incubare il piatto di coltura tissutale in un incubatore umidificato fino a quando non è pronto per l'analisi.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2.jpg"> Figura 2. Dissezione di una coclea di topo e cocultura dell'organo di Corti e MSC. (A) Decapitazione del topo, (B) e (C) dissezione saligittale mediana della testa, (D) e(E) dissezione coronale del cervello, (F) e (G) rimozione del cervello e dell'osso temporale, (H) coclea, (I) rimozione della parete cocleare ossea, (J) isolamento della coclea, (K) separazione del condotto cocleare dal modiolo, (L) separazione della vascolarizzazione della striata (SV) e legamento a spirale (SL) dall'organo di Corti, (M) rimozione della membrana tectoriale, (N-P) fissazione della coccina su un foglietto di copertura di plastica, (Q) posizione di coverslip e cilindro di vetro nella piastra confocale,(R)inoculazione di MSC. Barra in scala bianca (A-E) = 1 cm; barra di scala arancione (F, G, P) e gialla (H,I) = 1 mm; barra in scala verde (J-O) = 0,5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig2v2large.jpg" target="_blank">mm.</a>
2. Imaging time-lapse
<ol><li>Per gli esperimenti qui presentati, utilizzare un sistema di microscopia confocale con un sistema di incubazione superiore dello stadio.</li>
	<li>Accendere il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.</li>
	<li>Impostare le condizioni dell'incubatore stage-top posto sul palco del microscopio confocale a 37 °C e al 5% di atmosfera di CO2.</li>
	<li>Posizionare il piatto campione sul recipiente di fissaggio del piatto, coprire con il coperchio di fissaggio del piatto e chiudere la camera con il coperchio del riscaldatore superiore.</li>
	<li>Regola lo zoom e lo stato attivo per localizzare l'organo di Corti e MSC nel campo visivo.</li>
	<li>Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di individuazione selezionare un obiettivo Plan-Apochromat 20x (apertura numerica 0.8) e una superficie di ritaglio 0,5x.</li>
	<li>In Acquisizionefare clic su configurazione intelligente e selezionare EGFP.</li>
	<li>Aprire la linguetta del canale in Acquisizionee impostare la potenza laser su 0,2%, il foro stenopeica a 44 μm, il guadagno principale a 750 Ve il guadagno digitale su 1,0.</li>
	<li>Fare clic su ESID in fase di configurazione dell'imaging e impostare il guadagno ESID su 4 e il guadagno digitale su 7.5. </li>
	<li>Clicca su Tessere e palo per produrre 210 tessere.</li>
	<li>Aprire la strategia focus e selezionare la modalità messa a fuoco.</li>
	<li>In serie temporaliimpostare la durata su 24 h e l'intervallo su 10 min.</li>
	<li>In Acquisizioneimpostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su 8, la direzione in bidirezionale, la media su 4x e i bit per pixel su 16.</li>
	<li>Clicca sull'esperimento iniziale per iniziare l'esperimento.</li>
</ol>3. Modifica del file di immagine
<ol><li>In elaborazionefare clic su cucituree impostare la sovrapposizione minima sul 5% e il passaggio massimo al 10%.</li>
	<li>Fare clic sull'esportazionedei film , impostare uncompressoe impostare la velocità su 7.5.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspirare il mezzo con attenzione e lavare il campione due volte con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per 5 minuti.</li>
	<li>Fissare il campione con formalina al 4% in PBS per 15 minuti e lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Permeabilizzare il campione nello 0,1% di Tritone X-100 in PBS per 10 minuti e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 250 μL di reagente phalloidin-iFluor 647 (diluizione 1:1000 in PBS) e incubare il campione per 1 h a temperatura ambiente sullo shaker.</li>
	<li>Lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.</li>
	<li>Trasferire il coverslip sullo scivolo di vetro e aggiungere 2 gocce di soluzione di montaggio.</li>
	<li>Posizionare delicatamente una coverlip sullo scivolo.</li>
	<li>Sigillare il copripago con smalto chiaro e conservare a 4 °C al buio fino a quando non si osservano le cellule.</li>
	<li>Immagina la diapositiva usando un microscopio confocale con un filtro appropriato a eccitazione/emissione (Ex/Em)=650/665 nm per la filloidina e a Ex/Em=488/507 nm per EGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+hearing+loss+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngologic+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Global hearing loss prevention.</a> Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+migration+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell migration and tissue repair.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+MSC+from+selected+species%3A+Features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Mammalian MSC from selected species: Features and applications.</a> Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).</li>
<li>Rojewski, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+standardized+manufacturing+protocol+for+mesenchymal+stromal+cells%3A+A+systematic+comparison+of+validation+and+manufacturing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data.</a> Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).</li>
<li>Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cell+homing%3A+Mechanisms+and+strategies+for+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement.</a> iScience. 15, 421-438 (2019).</li>
<li>Ahn, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+enhance+efficacy+of+SPION-labeled+stem+cell+homing+by+magnetic+attraction%3A+a+systemic+review+with+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis.</a> International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).</li>
<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Sykova, E., Jendelova, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+stem+cells+in+brain+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury.</a> Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Rask-Andersen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cochlea%3A+anatomical+characteristics+and+their+relevance+for+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).</li>
<li>Kamiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+transplantation+accelerates+hearing+recovery+through+the+repair+of+injured+cochlear+fibrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes.</a> The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).</li>
<li>Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+safety+and+efficacy+of+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cell+transplantation+in+sensorineural+hearing+loss+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Audiology+and+Otology%22%5BJournal%5D)">Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients.</a> Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).</li>
<li>Vanden Berg-Foels, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+tissue+regeneration%3A+chemoattractants+for+endogenous+stem+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Oshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+hair+cell-like+cells+from+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 141 (4), 704-716 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il trapianto di MBC in siti danneggiati per promuovere la rigenerazione delle cellule danneggiate è stato ampiamente studiato e l'effetto terapeutico è evidente. Il trapianto e la successiva differenziazione dei CSC sono stati segnalati per ripristinare l'udito nei ratti con perdita dell'udito indotta da acido 3-nitropropionico13. Sebbene Lee et al. Fino a poco tempo fa, quasi 12 esperimenti sono stati condotti per ripristinare l'udito nel modello di roditore mediante trapi...

La perdita dell'udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell'udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell'udito sonodanneggiate 1. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.
Sono stati tentati diversi approcci per trattare la perdita dell'udito; in particolare, un approccio di rigenerazione che utilizza i CTC è emerso come un trattamento promettente. Quando il tessuto è danneggiato, i CSC vengono naturalmente rilasciati nel sistema circolatorio e migrano verso il sito della lesione dove secernono varie molecole per formare un microambiente che promuove larigenerazione 2. Pertanto, è importante sviluppare un metodo per trattare i tessuti danneggiati attraverso la migrazione dei CBC impiantati esternamente agli organi bersaglio e la loro successiva secrezione di molecole che causano una potente regolazione immunitaria, angiogenesi e anti-apoptosi per migliorare il ripristino della funzionecellulare danneggiata 3,4,5.
Il processo di homing in cui i CSC migrano verso tessuti danneggiati può essere l'ostacolo più importante da superare. Gli MSC hanno un meccanismo sistemico di homing con passaggi sequenziali di tethering/rolling, attivazione, arresto, trasmigrazione/diapedesi e migrazione6,7,8. Attualmente sono in corso sforzi per individuare modi per migliorare questi passaggi. Varie strategie, tra cui la modificazione genetica, l'ingegneria delle superfici cellulari, l'adescamento in vitro e la guida magnetica,sono state testate 6,7. Inoltre, sono stati fatti diversi tentativi per promuovere la protezione e la rigenerazione delle cellule ciliate uditivi affinando i CTC nel sito della coclea danneggiata. Tuttavia, tenere traccia dei CSC in vivo richiede molto tempo e manodopera e richiede competenze altamente specializzate9.
Per risolvere questo problema, è stato messo a punto un metodo per osservare l'affinamento dei CFC nella coclizione attraverso la microscopia confocale time-lapse che fotografa la migrazione delle cellule per diverse ore (Figura 1). È stato sviluppato all'inizio del XX secoloed è recentemente diventato un potente strumento per studiare la migrazione di cellule specifiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61947/61947fig01.jpg" style="font-size: 14px;"> Figura 1: Astratto grafico. (A) Dopo che l'organo sezionato di Corti è stato aderito su un copripasta di plastica con forcep, il copripasta viene posizionato su un piatto microscopico confocale con fondo di vetro da 35 mm e (B) il cilindro di vetro è posizionato. (C) Dopo aver riempito l'interno del cilindro di vetro con CCC con etichetta GFP media,(D)con mezzo vengono aggiunti con attenzione all'esterno del cilindro. (E) Dopo l'incubazione durante la notte,(F)il cilindro di vetro viene rimosso e le immagini vengono scattate con un microscopio confocale. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC = cellule staminali mesenchimali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61947/61947fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10X PBS Buffer</td><td>GenDEPOT</td><td>P2100-104</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalina</td><td>T& I</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>sigma</td><td>A5354-10ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>sigma&nbsp;</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>piatto confocale</td><td>SPL</td><td>200350</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocale&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti</td><td>SPL</td><td>20009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsheild con</td><td>DAPI sigma&nbsp;</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Dumont</td><td>0508-L5-P0</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>integratore N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina-iFluor 647 Reagente</td><td>abcam</td><td>ab176759</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a tavolino</td><td>TOKAI HIT</td><td>WELSX</td><td></td></tr><tr><td>Ceppo C57BL/6 cellule staminali menenchimali di topo con GFP</td><td>cyagen</td><td>MUBMX-01101</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di corti

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

Per studiare gli effetti delle cellule staminali mesenchimali (CSC) sulla rigenerazione e sul trattamento cellulare, questo metodo tiene traccia della migrazione MSC e dei cambiamenti morfologici dopo la co-coltura con epitelio cocleare. L'organo di Corti è stato immobilizzato su un coverslip di plastica premendo una porzione della membrana del Reissner generata durante la dissezione. I CSC confinati da un cilindro di vetro migrarono verso l'epitelio cocleare quando il cilindro fu rimosso. La loro localizzazione predominante è stata osservata nel modiolo dell'organo di Corti, allineato in una direzione simile a quella delle fibre nervose. Tuttavia, alcuni CSC erano localizzati nell'area limbus e mostravano una forma allungata orizzontalmente. Inoltre, la migrazione nell'area delle cellule cieche è stata aumentata e la morfologia dei CSC è cambiata in varie forme dopo il trattamento con kanamicina. In conclusione, i risultati di questo studio indicano che la cocultura dei CSC con epitelio cocleare sarà utile per lo sviluppo di terapie attraverso il trapianto cellulare e per studi di rigenerazione cellulare in grado di esaminare varie condizioni e fattori.

La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L'organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiolare e...

In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

I metodi in vitro esistenti per studiare la migrazione delle MSC includono i protocolli Transwell o di guarigione delle ferite. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare la migrazione delle MSC all'espianto in tempo reale. In termini di cultura dell'espianto, il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è quello di ottenere una riduzione dei tempi e dei costi, nonché una semplificazione delle fasi sperimentali.Questa tecnica può essere utilizzata per osservare l'homing delle cellule staminali verso il bersaglio in tempo reale, portando allo sviluppo di modelli con un'efficienza di homing ottimizzata. La rimozione della membrana tettoia è difficile per i ricercatori inesperti. A seconda della fase di sviluppo, capire il momento giusto per rimuovere la membrana tectoriale è importante per il successo di questo protocollo.A dimostrare la procedura saranno il Dr.Jeong-Eun Park e Dr.Su Hoon Lee, professori ricercatori del mio laboratorio. Iniziare sterilizzando la cappa di coltura tissutale a flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per circa 30 minuti. Spruzzare tutte le superfici con etanolo al 70% prima dell'uso e lasciarle asciugare.Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti, quindi asciugarli prima dell'uso. Dopo aver decapitato un topo di tre o quattro giorni, immergere la parte anteriore in etanolo al 70% e metterlo al microscopio seriale nella cappa a flusso laminare. Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale per rimuovere l'etanolo.Tagliare la linea centrale del cranio con la lama chirurgica, quindi esporre il cranio tirando verso il basso la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio. Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi, quindi aprire il cranio e rimuovere il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con una pinza smussata. Utilizzando una micropinza, separare la coclea dall'osso temporale e trasferirla in una capsula di Petri contenente una soluzione di dissezione tissutale.Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare lasciando solo il tessuto molle cocleare interno. Tenere il modiolo della coclea con una pinza e il dotto cocleare con un altro paio di pinze, quindi separare lentamente i due tessuti. Rimuovere la stria vascolare e la membrana tectoriale staccandole delicatamente.Posizionare un vetrino coprioggetti in plastica sterilizzata in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti sul vetrino assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso. Immobilizzare il tessuto premendo la membrana di Reissner e il tessuto modiolo rimanente sul vetrino coprioggetti con una pinza. Trasferire il vetrino coprioggetti con il fazzoletto incorporato al centro di un piatto confocale da 35 millimetri.Posizionare il cilindro di clonazione in vetro sulla piastra con l'espiante cocleare posizionato al centro della piastra e aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura per espiantazione nel cilindro. Posizionare 5.000 cellule staminali mesenchimali derivate da GFP o MSC derivate dal midollo osseo in due millilitri di terreno di coltura all'esterno del cilindro di vetro e mettere il piatto nell'incubatore. Dopo aver coltivato le cellule come descritto nel manoscritto del testo, aspirare tutto il terreno all'interno e all'esterno del cilindro e rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.Aggiungere due millilitri di terreno di coltura fresco al piatto. Metterlo in un'incubatrice umidificata fino al momento dell'analisi. Utilizzare un sistema di microscopia confocale con un'incubatrice da palco.Accendi il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer. Impostare le condizioni dell'incubatore superiore del palco a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in atmosfera. Posizionare il sample piatto sul recipiente di fissaggio della piastra, coprirlo con il coperchio di fissaggio della piastra e chiudere la camera con il coperchio superiore del riscaldatore.Regola lo zoom e la messa a fuoco per localizzare l'organo di Corti e le MSC nel campo visivo. Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di localizzazione, selezionare un obiettivo plan-apocromatico 20X o un'apertura numerica 0,8 e un'area di ritaglio 0,5X.In Acquisizione, fare clic su Configurazione intelligente e selezionare EGFP. Apri la scheda del canale in fase di acquisizione e imposta la potenza del laser allo 0,2%, il foro stenopeico a 44 micrometri, il guadagno master a 750 volt e il guadagno digitale a 1,0. Fare clic su ESID in Configurazione imaging e impostare il guadagno ESID su quattro e il guadagno digitale su 7,5.Fai clic sulle tessere e picchetta per produrre 210 tessere. Aprire la strategia di messa a fuoco e selezionare la modalità di messa a fuoco. In Serie temporali impostare la durata su 24 ore e l'intervallo su 10 minuti.Durante l'acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su otto, la direzione su bidirezionale, la media su 4X e i bit per pixel su 16. Fare clic su avvia esperimento per iniziare l'esperimento. Il percorso bidimensionale delle cellule staminali mesenchimali o MSC è stato tracciato in un metodo di guarigione delle ferite utilizzando un cilindro di vetro come barriera tra le MSC e l'organo di Corti.Quando l'organo di Corti è stato coltivato, i fibroblasti sono cresciuti molto rapidamente verso l'esterno dalle cellule ciliate esterne nello strato più esterno. La maggior parte delle MSC marcate con GFP sono state espulse dai fibroblasti a crescita rapida. Ciononostante, alcuni sono penetrati nello strato di fibroblasti e sono migrati con successo nell'organo di Corti.I risultati di 72 ore di incubazione hanno mostrato che le MSC migravano verso l'organo di Corti ed erano localizzate principalmente nel modiolo e nell'area con le fibre nervose cocleari separate dal modiolo. La morfologia delle MSC è stata alterata in una forma radiale simile a quella delle fibre nervose. Le cellule sono state trasformate in una forma lineare lungo la linea del limbus, piuttosto che l'area delle cellule ciliate.Le MSC sono state in grado di migrare e crescere nell'area di raccolta delle fibre nervose penetrando i vari strati cellulari e le barriere fisiche. Quando il danno alle cellule ciliate è stato indotto da un trattamento di 16 ore con kanamicina e le cellule sono state coltivate per ulteriori 72 ore dopo la rimozione della kanamicina, le MSC sono state localizzate non solo nel modiolo, ma anche nelle cellule ciliate esterne. L'immobilizzazione del tessuto è un passo importante in questo protocollo in cui è attaccato l'organo di Corti.Non cade facilmente. Questo è un consiglio banale, ma utile per una coltura di espiantazione di successo. Questo metodo può essere adattato per studiare l'efficacia degli esosomi secreti dalle MSC.

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Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Processi cellulari come la migrazione delle cellule sono stati tradizionalmente studiati su due dimensioni, superfici in plastica rigida. Questo rapporto descrive una tecnica per la visualizzazione diretta di localizzazione delle proteine ​​e l'analisi dinamica della proteina in cellule di migrare in modo più fisiologicamente rilevanti, matrice tridimensionale.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

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Immagini dal vivo della coclea embrionale dei mammiferi è impegnativo, perché i processi di sviluppo a portata di mano operano su un gradiente temporale nell'arco di dieci giorni. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura e quindi l'imaging embrionale dei tessuti espianto cocleare preso da un topo reporter fluorescente in cinque giorni.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Combinando approcci di trapianto cellulare, marcatura citoscheletrica e perdita/guadagno di funzione, questo protocollo descrive come la piastra precordale prospettica del pesce zebra in migrazione possa essere utilizzata per analizzare la funzione di un gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Descriviamo i metodi per l'etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l'imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .

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Scopri l'imaging time-lapse di cellule vive per studiare la migrazione di cellule staminali mesenchimali verso l'organo di Corti. Questo metodo semplificato riduce tempi e costi rispetto ai protocolli tradizionali.

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