Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti
4 dicembre 2020
In questo studio, presentiamo un metodo di imaging in tempo reale utilizzando la microscopia confocale per osservare le cellule che si muovono verso il tessuto danneggiato mediante incubazione ex vivo con l'epitelio cocleare contenente l'organo di Corti.
I metodi in vitro esistenti per studiare la migrazione delle MSC includono i protocolli Transwell o di guarigione delle ferite. Il metodo qui descritto può essere utilizzato per monitorare la migrazione delle MSC all'espianto in tempo reale. In termini di cultura dell'espianto, il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è quello di ottenere una riduzione dei tempi e dei costi, nonché una semplificazione delle fasi sperimentali.
Questa tecnica può essere utilizzata per osservare l'homing delle cellule staminali verso il bersaglio in tempo reale, portando allo sviluppo di modelli con un'efficienza di homing ottimizzata. La rimozione della membrana tettoia è difficile per i ricercatori inesperti. A seconda della fase di sviluppo, capire il momento giusto per rimuovere la membrana tectoriale è importante per il successo di questo protocollo.
A dimostrare la procedura saranno il Dr.Jeong-Eun Park e Dr.Su Hoon Lee, professori ricercatori del mio laboratorio. Iniziare sterilizzando la cappa di coltura tissutale a flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per circa 30 minuti. Spruzzare tutte le superfici con etanolo al 70% prima dell'uso e lasciarle asciugare.
Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti, quindi asciugarli prima dell'uso. Dopo aver decapitato un topo di tre o quattro giorni, immergere la parte anteriore in etanolo al 70% e metterlo al microscopio seriale nella cappa a flusso laminare. Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale per rimuovere l'etanolo.
Tagliare la linea centrale del cranio con la lama chirurgica, quindi esporre il cranio tirando verso il basso la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio. Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi, quindi aprire il cranio e rimuovere il proencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con una pinza smussata. Utilizzando una micropinza, separare la coclea dall'osso temporale e trasferirla in una capsula di Petri contenente una soluzione di dissezione tissutale.
Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare lasciando solo il tessuto molle cocleare interno. Tenere il modiolo della coclea con una pinza e il dotto cocleare con un altro paio di pinze, quindi separare lentamente i due tessuti. Rimuovere la stria vascolare e la membrana tectoriale staccandole delicatamente.
Posizionare un vetrino coprioggetti in plastica sterilizzata in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti sul vetrino assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso. Immobilizzare il tessuto premendo la membrana di Reissner e il tessuto modiolo rimanente sul vetrino coprioggetti con una pinza. Trasferire il vetrino coprioggetti con il fazzoletto incorporato al centro di un piatto confocale da 35 millimetri.
Posizionare il cilindro di clonazione in vetro sulla piastra con l'espiante cocleare posizionato al centro della piastra e aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura per espiantazione nel cilindro. Posizionare 5.000 cellule staminali mesenchimali derivate da GFP o MSC derivate dal midollo osseo in due millilitri di terreno di coltura all'esterno del cilindro di vetro e mettere il piatto nell'incubatore. Dopo aver coltivato le cellule come descritto nel manoscritto del testo, aspirare tutto il terreno all'interno e all'esterno del cilindro e rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.
Aggiungere due millilitri di terreno di coltura fresco al piatto. Metterlo in un'incubatrice umidificata fino al momento dell'analisi. Utilizzare un sistema di microscopia confocale con un'incubatrice da palco.
Accendi il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer. Impostare le condizioni dell'incubatore superiore del palco a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in atmosfera. Posizionare il sample piatto sul recipiente di fissaggio della piastra, coprirlo con il coperchio di fissaggio della piastra e chiudere la camera con il coperchio superiore del riscaldatore.
Regola lo zoom e la messa a fuoco per localizzare l'organo di Corti e le MSC nel campo visivo. Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di localizzazione, selezionare un obiettivo plan-apocromatico 20X o un'apertura numerica 0,8 e un'area di ritaglio 0,5X.
In Acquisizione, fare clic su Configurazione intelligente e selezionare EGFP. Apri la scheda del canale in fase di acquisizione e imposta la potenza del laser allo 0,2%, il foro stenopeico a 44 micrometri, il guadagno master a 750 volt e il guadagno digitale a 1,0. Fare clic su ESID in Configurazione imaging e impostare il guadagno ESID su quattro e il guadagno digitale su 7,5.
Fai clic sulle tessere e picchetta per produrre 210 tessere. Aprire la strategia di messa a fuoco e selezionare la modalità di messa a fuoco. In Serie temporali impostare la durata su 24 ore e l'intervallo su 10 minuti.
Durante l'acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su otto, la direzione su bidirezionale, la media su 4X e i bit per pixel su 16. Fare clic su avvia esperimento per iniziare l'esperimento. Il percorso bidimensionale delle cellule staminali mesenchimali o MSC è stato tracciato in un metodo di guarigione delle ferite utilizzando un cilindro di vetro come barriera tra le MSC e l'organo di Corti.
Quando l'organo di Corti è stato coltivato, i fibroblasti sono cresciuti molto rapidamente verso l'esterno dalle cellule ciliate esterne nello strato più esterno. La maggior parte delle MSC marcate con GFP sono state espulse dai fibroblasti a crescita rapida. Ciononostante, alcuni sono penetrati nello strato di fibroblasti e sono migrati con successo nell'organo di Corti.
I risultati di 72 ore di incubazione hanno mostrato che le MSC migravano verso l'organo di Corti ed erano localizzate principalmente nel modiolo e nell'area con le fibre nervose cocleari separate dal modiolo. La morfologia delle MSC è stata alterata in una forma radiale simile a quella delle fibre nervose. Le cellule sono state trasformate in una forma lineare lungo la linea del limbus, piuttosto che l'area delle cellule ciliate.
Le MSC sono state in grado di migrare e crescere nell'area di raccolta delle fibre nervose penetrando i vari strati cellulari e le barriere fisiche. Quando il danno alle cellule ciliate è stato indotto da un trattamento di 16 ore con kanamicina e le cellule sono state coltivate per ulteriori 72 ore dopo la rimozione della kanamicina, le MSC sono state localizzate non solo nel modiolo, ma anche nelle cellule ciliate esterne. L'immobilizzazione del tessuto è un passo importante in questo protocollo in cui è attaccato l'organo di Corti.
Non cade facilmente. Questo è un consiglio banale, ma utile per una coltura di espiantazione di successo. Questo metodo può essere adattato per studiare l'efficacia degli esosomi secreti dalle MSC.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un metodo di imaging in tempo reale mediante microscopia confocale per osservare la migrazione delle cellule verso tessuti danneggiati. La tecnica consente di seguire in tempo reale l'omissione delle cellule staminali verso tessuti bersaglio, fornendo informazioni sulle dinamiche della migrazione cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Migrazione cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
- Tecniche di imaging in tempo reale
Sfondo
- I metodi in vitro esistenti per lo studio della migrazione cellulare comprendono i protocolli Transwell e quelli di guarigione della ferita.
- Questo studio si concentra su un metodo che semplifica il processo sperimentale.
- Comprendere i tempi di rimozione della membrana tettoriale è fondamentale per l'applicazione corretta del protocollo.
- Il metodo mira a ridurre il tempo e i costi associati alle tecniche tradizionali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo di imaging in tempo reale per osservare la migrazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC).
- Migliorare la comprensione dell'efficienza dell'omissione delle cellule staminali.
- Fornire un protocollo semplificato ai ricercatori.
Metodi Utilizzati
- Microscopia confocale per l'immagine in tempo reale.
- Incubazione ex vivo con epitelio cocleare.
- Tracciamento delle cellule staminali mesenchimali verso gli espianti.
- Rimozione della membrana tectoria come parte del protocollo.
Risultati principali
- Monitoraggio con successo della migrazione delle cellule staminali mesenchimali in tempo reale.
- Vantaggi dimostrati rispetto ai metodi tradizionali.
- Fornito informazioni sui tempi di rimozione della membrana tettoriale.
- Agevolato lo sviluppo di modelli con efficienza di homing ottimizzata.
Conclusioni
- Il metodo offre un approccio economico ed efficiente per lo studio della migrazione cellulare.
- L'imaging in tempo reale migliora la comprensione della dinamica delle cellule staminali.
- Applicazioni future potrebbero portare a strategie terapeutiche migliorate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging in tempo reale di cellule vive della migrazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) verso l'organo del Corti fornisce informazioni utili per la scoperta di medicina rigenerativa in fase precoce. Questo metodo permette la visualizzazione diretta dell'omming delle cellule, dell'adattamento morfologico e della risposta al danno tissutale, sostenendo la previsione di strategie terapeutiche basate su cellule. Il suo flusso di lavoro semplificato e gli output quantitativi lo rendono uno strumento prezioso per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei portafogli di R&S preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'osservazione diretta dell'omming e dell'integrazione delle cellule staminali mesenchimali con espianti di tessuto cocleare.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando i modelli di migrazione e le modifiche morfologiche in condizioni di lesione.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio per approcci rigenerativi basati su cellule.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma riproducibile e quantitativa per valutare la migrazione e la localizzazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC).
- Standardizza le condizioni di imaging su cellule vive per l'analisi comparativa tra variabili sperimentali.
- Consente lo screening di fattori che influenzano l'efficienza dell'omming delle cellule staminali e l'interazione con i tessuti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la patologia simulando scenari di lesione e riparazione cocleare.
- Permette l'identificazione di biomarcatori traslazionali attraverso letture morfologiche e di localizzazione.
- Colma il divario tra scoperta e validazione preclinica consentendo il monitoraggio in tempo reale del comportamento cellulare terapeutico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di imaging su cellule vive si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo test basati su ipotesi relative alla migrazione cellulare, al targeting tissutale e al potenziale rigenerativo.
- Biologia della scoperta: Quantifica la dinamica della migrazione delle cellule staminali mesenchimali e l'adattamento morfologico in risposta a segnali tissutali e lesioni.
- Screening: Fornisce saggi di migrazione standardizzati e riproducibili, adatti alla valutazione di fattori o condizioni candidati.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi in time-lapse sulla localizzazione cellulare, sulla morfologia e sulle traiettorie di migrazione.
- Ricerca traslazionale: Modella ambienti tissutali e risposte a lesioni rilevanti per le malattie, per la valutazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma flessibile, adattabile ad altri tipi cellulari o espianti tissutali, per una ricerca più ampia nel campo della rigenerazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle strategie rigenerative basate su cellule e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Riduce la complessità sperimentale, il tempo e i costi rispetto ai saggi di migrazione tradizionali.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione fornendo evidenze quantitative in tempo reale sul comportamento cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei candidati per la terapia cellulare e degli approcci rigenerativi in base alla gestione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagineologia di cellule vive e nella dissezione dei tessuti, in particolare per gli espianti cocleari.
- Necessita dell'accesso a microscopia confocale con controllo ambientale per acquisizioni a lungo termine.
- La standardizzazione dell'immobilizzazione del tessuto e della rimozione della membrana è fondamentale per la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri modelli di tessuto potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per la manipolazione degli espianti.
- Le barriere fisiche e la sovraproliferazione di fibroblasti possono influenzare le letture relative alla migrazione e devono essere gestite adeguatamente.
