Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità
9 febbraio 2021
Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.
Questo protocollo utilizza un metodo riciclabile e modificato nella produzione di composti spirociclici. Il test MTT aiuta a rispondere alla domanda relativa alla citotossicità di queste nuove molecole. Questa tecnica produce nuove molecole modificabili utilizzando un materiale di partenza rigenerante.
Il test MTT fornisce risultati biologici relativamente rapidi e facili da analizzare Inizia eseguendo la sintesi in fase solida dei cicli etero spirociclici sei e sette, come precedentemente dimostrato. Preparare 20 millilitri di una soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro utilizzando PBS sterile come diluente. Filtrare e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.
Quindi, preparare una diluizione uno-a-uno della soluzione MTT in DMEM. Preparare un millilitro ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri di composti in esame in DMSO. Conservali a meno 20 gradi Celsius.
Preparare 200 microlitri per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock. Uno a 1000 in mezzo libero da siero. Nei semi di coltura tissutale, COS sette cellule in mezzo completo su coltura tissutale a fondo piatto hanno trattato 96 piastre di pozzetto ad una concentrazione di 4.000 cellule per 200 microlitri per pozzetto.
Utilizzando un pipeter multicanale. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aspirare il surnatante dai pozzetti usando una pipetta di pascolo di vetro collegata a una pompa per vuoto.
Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro precedentemente preparate. Quindi restituire le cellule all'incubatore. Dopo 24 ore, aspirare il surnatante dai pozzetti e aggiungere 200 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto.
Incubare il piatto per quattro ore. Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazane. Aggiungere 200 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli.
Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Misurare l'assorbanza per ciascun pozzetto a 590 o 600 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza.
Le cuciture gox spirocicliche sei e sette sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato. Il progresso della reazione è stato monitorato rilevando la scomparsa dell'alfa beta insatura Esther utilizzando la spettroscopia infrarossa. Il test MTT è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare.
Il cisplatino, che è noto per indurre la morte cellulare ad alte concentrazioni, è servito come controllo positivo. Come previsto, maggiore è la concentrazione di cisplatino, minore è la vitalità cellulare. Il test MTT è stato quindi utilizzato per testare i composti spirociclici sei e sette e la furfurilammina.
La furfurilammina e la cucitura spirociclica gox six hanno mostrato citotossicità simile. Tuttavia, la tossicità del composto spirociclico sette era notevolmente maggiore di quella della furfurilammina e sei. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la N-alchilazione eseguita utilizzando alogenuri acilici voluminosi è stata trovata per ridurre il tasso di eliminazione beta riducendo così la resa del prodotto.
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Panoramica
Questo studio descrive un metodo per valutare la citotossicità di nuovi ossimi spirociclici mediante il saggio MTT. Il protocollo sottolinea la sintesi in fase solida e valuta la vitalità delle cellule COS7 trattate con i composti sintetizzati.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Saggi biologici
- Test di citotossicità
- Sintesi di composti spirociclici
Sfondo
- Ricerca sui composti spirociclici
- Importanza della citotossicità nello sviluppo di farmaci
- Utilizzo del saggio MTT come metodo affidabile
Metodi Utilizzati
- Sintesi in fase solida di eterocicli spirociclici
- Linea cellulare COS7 come modello biologico
- Saggio MTT per la misurazione della vitalità cellulare
Risultati principali
- Confronto degli effetti citotossici di composti spirociclici e furfurylamine
- Le osservazioni hanno indicato che il composto spirociclico sette ha mostrato una tossicità maggiore rispetto agli altri
- I risultati sono stati convalidati utilizzando il cisplatino come controllo positivo
Conclusioni
- Lo studio dimostra l'efficacia dei composti spirociclici nell'indurre la morte cellulare
- I risultati forniscono informazioni preziose per la ricerca sul cancro e lo sviluppo di farmaci
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo lavoro presenta una sintesi semplificata in fase solida di eterocicli spirociclici, riducendo il numero di passaggi sintetici ed eliminando reagenti tossici, il che migliora l'efficienza nella generazione di composti promettenti nella scoperta di farmaci antitumorali. Il saggio MTT consente uno screening rapido e quantitativo della citotossicità a concentrazioni micromolari di composti, supportando la validazione precoce del bersaglio e la riduzione dei rischi meccanicistici. Insieme, questi metodi aumentano la capacità predittiva nella selezione di scaffold spirociclici da sottoporre a ulteriori valutazioni precliniche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi degli effetti citotossici in nuovi eterocicli spirociclici per valutare la validità dell'ipotesi terapeutica.
- Valore operativo: La sintesi in fase solida su resina con legante REM a basso carico permette l'introduzione di catene laterali aromatiche ingombranti, ampliando la diversità chimica per studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: I dati di citotossicità ottenuti dal saggio MTT supportano decisioni di avanzamento o interruzione quantificando l'induzione della morte cellulare rispetto al controllo con cisplatino.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Il saggio MTT fornisce un risultato colorimetrico riproducibile della vitalità cellulare in cellule COS7 trattate con composti in esame.
- Valore operativo: Il reagente MTT disponibile in commercio e il protocollo semplice consentono la compatibilità con schermate ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Le soluzioni di lavoro preparate in DMSO e diluite in mezzo privo di siero garantiscono una somministrazione costante dei composti tra le replicazioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Il profilo di citotossicità dei composti spirociclici e della furfurilammina stabilisce una base struttura-attività per l'ottimizzazione successiva.
- Rilevanza preclinica: La tossicità differenziale osservata—in particolare la citotossicità accentuata del composto spirociclico sette—supporta l'identificazione di composti promettenti guidata dalla relazione struttura-attività (SAR).
- De-risking meccanicistico: L'uso del cisplatino come controllo positivo convalida la sensibilità del saggio e rafforza la fiducia negli effetti specifici dei composti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro integrato colloca la sintesi in fase solida seguita da screening della citotossicità basato sul MTT come ponte tra la scoperta e la fase preclinica per la valutazione di composti eterociclici in oncologia.
- Biologia della Scoperta: La sintesi in fase solida consente la rapida generazione di scaffold spirociclici modificabili per la verifica di ipotesi e l'analisi dei percorsi biologici.
- Screening: Il saggio MTT fornisce misurazioni quantitative della vitalità basate su punto finale per confrontare potenza e selettività dei composti.
- Analisi: Le letture di assorbanza a 590–600 nm, normalizzate rispetto ai pozzetti bianco, forniscono dati affidabili per la stima dell'IC50 utili alla modellizzazione struttura-attività.
- Ricerca Translazionale: Il ranking di citotossicità dei composti (ad esempio, composto sette > sei ≈ furfurilammina) guida la selezione per approfondimenti meccanicistici.
- Riutilizzo Aziendale: La piattaforma in fase solida e il saggio MTT sono adattabili a diverse librerie di eterocicli, sostenendo un'infrastruttura di scoperta riutilizzabile.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: La riduzione dei passaggi sintetici e l'eliminazione di reagenti tossici migliorano la sicurezza e la scalabilità del percorso sintetico per la sintesi di librerie.
- Valore operativo: La resina con linker REM a basso carico consente la compatibilità con sostituenti ingombranti, aumentando le probabilità di successo sintetico per chemiotipi diversi.
- Valore strategico: Il profilo di citotossicità accelera l'identificazione di hit spirociclici potenti, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Dati quantitativi di vitalità supportano la priorizzazione corretta per rischio dei candidati spirociclici ai fini dell'ottimizzazione in chimica medicinale.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza nella sintesi organica in fase solida e nella manipolazione delle colture cellulari per ottenere risultati riproducibili.
- La strumentazione include un lettore di piastre a 96 pozzetti in grado di misurare l'assorbanza a 590–600 nm e un'appaio di coltura tissutale per la somministrazione sterile dei composti.
- La standardizzazione tra i diversi gruppi richiede una preparazione costante della soluzione di MTT, il suo stoccaggio a –20°C e protocolli di somministrazione in triplicato.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere un'ottimizzazione della densità di semina cellulare e dei tempi di incubazione in base ai tassi di proliferazione.
- Alogenuri acilici ingombranti nei passaggi di N-alchilazione possono ridurre i tassi di eliminazione beta e abbassare il rendimento del prodotto, come indicato nel protocollo.
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