Name: Sintesi delleterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Scopri la sintesi di eterocicli spirociclici e il saggio di citotossicità con l'assay MTT su cellule COS7. Questo metodo valuta la viabilità cellulare per la ricerca sullo sviluppo di farmaci antitumorali.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del Faculty Research Council a K.S.H. (Office of Research and Grants, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. e J.F.M. sono destinatari della borsa di studio Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. e B.M.R. sono destinatari delle borse di ricerca STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Siamo grati al Dr. Matthew Berezuk e al Dr. Philip Cox per la guida sui saggi biologici.

NOTA: Diversi prodotti chimici e reagenti biologici utilizzati in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Consultare le schede di sicurezza dei materiali (MSDS) pertinenti prima dell'uso. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza approvati dalla Occupational Safety and Health Administration, guanti adeguati, camici da laboratorio, pantaloni lunghi e scarpe chiuse) prima di iniziare l'esperimento. Inoltre, adottare adeguate pratiche di sicurezza durante l'esecuzione della sintesi e la manipolazione di sostanze chimiche tossiche e reagenti (cappa aspirante).
1. Sintesi in fase solida di eterocicli spirociclici 6 e 7
NOTA: La sintesi era basata sul lavoro precedentemente pubblicato11,12. Il protocollo aggiornato rivela che l'apertura dell'anello catalizzata dal fluoruro di tetrabutilammonio dell'eterociclo triciclico non era necessaria, e quindi la sua eliminazione accorcia la procedura sintetica.
<ol><li>Eseguire l'aggiunta Michael di furfurilamina al linker REM (durata: 25 minuti di configurazione + 24 ore di tempo di reazione).<ol><li>Aggiungere 1 g (1 equivalente [equiv.]) di resina REM, 20 mL (20 equiv.) di dimetilformammide (DMF) e 2,4 mL di furfurilammina in un recipiente di reazione in fase solida da 25 ml. Agitare il recipiente di reazione a temperatura ambiente per 24 ore dopo l'inizio della reazione. NOTA: Assicurarsi una miscelazione accurata in modo che la resina non si trovi sul fondo del recipiente.</li>
		<li>Lavare la resina con DMF 1x dopo aver completato la reazione. Quindi, lavare 4 volte, alternando diclorometano (DCM) e metanolo. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire addizione Michael in tandem/cicloaddizione 1,3-dipolare (durata: 25 min setup + 48 h tempo di reazione).<ol><li>Alla resina secca, aggiungere 1,48 ml (5 equiv.) di trietilammina (TEA), 0,637 g (2 equiv.) di nitro-olefina e 10 mL di toluene secco al recipiente di reazione.</li>
		<li>Quindi, aggiungere 1,085 ml (4 equiv.) di cloruro di trimetilsilile (TMSCl) al recipiente di reazione in una cappa aspirante ben ventilata. NOTA: Poiché questa reazione produce gas HCl, non tappare il recipiente di reazione fino a quando il gas non è stato rilasciato sotto una cappa aspirante.</li>
		<li>Tappare saldamente il recipiente di reazione e agitare a temperatura ambiente per 48 ore. NOTA: Assicurare un'accurata miscelazione della resina con i reagenti.</li>
		<li>Utilizzare 5 ml di metanolo per estinguere la reazione.</li>
		<li>Scolare il recipiente per rimuovere la soluzione, quindi lavare 4x, alternando DCM e metanolo. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la N-alchilazione dell'eterociclo legato alla resina per formare l'ammina quaternaria (durata: 10 min setup + 24 h di reazione).<ol><li>Alla resina secca nel recipiente di reazione, aggiungere 5 ml di DMF e 10 equiv. di alogenuro alchilico e agitare a temperatura ambiente per 24 ore. NOTA: Assicurarsi un'accurata miscelazione dei reagenti con la resina.</li>
		<li>Lavare la resina con DMF 1x dopo aver completato la reazione. Quindi, utilizzare DCM e metanolo alternativamente per lavare 4x. Asciugare la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire β-eliminazione dell'ammina quaternaria per scissione dal supporto polimerico (durata: 15 min setup + 24 h tempo di reazione).<ol><li>Alla resina secca nel recipiente di reazione, aggiungere 3 ml di DCM e 1,49 ml (5 equiv.) di TEA per scindere l'eterociclo dal supporto polimerico.</li>
		<li>Agitare la miscela di reazione per 24 ore per garantire un'accurata miscelazione della resina con la soluzione. Lavare 4x, alternando DCM e metanolo. Raccogliere l'eluizione da tutti i lavaggi e concentrare tramite evaporazione rotatoria.</li>
		<li>Triturare con metanolo per purificare l'ossima spirociclica. Asciugare accuratamente la resina nel recipiente di reazione dopo i lavaggi per riutilizzarla in esperimenti futuri.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Saggio di citotossicità mediante MTT 14
<ol><li>Preparare 20 mL di una soluzione MTT da 5 mg/mL utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS, 0,9% NaCl in acqua) come diluente. Filtrare e conservare a -20 °C. Quindi, preparare una diluizione 1:1 della soluzione MTT dal punto 2.1 in terreno di coltura cellulare senza siero (DMEM).</li>
	<li>Preparare 1 mL ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 mL da 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM e 0,01 μM di composti in esame in dimetilsolfossido (DMSO). Conservare a -20 °C. Preparare 200 μL per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock 1:1000 in terreno privo di siero in provette da 1,5 ml.</li>
	<li>Nella cappa di coltura tissutale, seminare cellule COS-7 (cellule renali di scimmia verde africana, rene di Cercopithecus aethiops ) in mezzo completo [DMEM con siero bovino fetale al 10% (FBS)] su piastre a fondo piatto, trattate con coltura tissutale a 96 pozzetti a una concentrazione di 4 × 103 cellule/200 μL per pozzetto utilizzando un pipettatore multicanale. Le cellule COS-7 sono state scelte perché (1) sono cellule comunemente utilizzate per i saggi di citotossicità e (2) erano già disponibili nell'istituzione.</li>
	<li>Incubare cellule COS-7 per 24 ore a 37 °C in atmosfera contenente il 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare il surnatante dai pozzetti utilizzando una pipetta Pasteur di vetro collegata a una pompa per vuoto. Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro preparate al punto 2.2 (vedere tabella 1). Incubare le cellule come descritto al punto 2.4.</li>
	<li>Aspirare il surnatante dai pozzi. Aggiungere 200 μL di soluzione MTT a ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C in atmosfera contenente il 5% di CO2 per 4 ore.</li>
	<li>Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazan. Aggiungere 200 μL di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli di formazan viola. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 590 nm14 o 600 nm per ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza. Sottrarre il valore medio di fondo di assorbanza dal valore di assorbanza di ciascun pozzetto trattato. Normalizzare i dati come percentuale del valore medio di dosaggio zero (media dei tre valori di dose zero). Tracciare i dati sull'asse y: lineare (% di vitalità relativa della cella); Asse X: log (concentrazione). Tracciare ogni serie come una singola curva (ad esempio, i dati triplicati dovrebbero avere 3 curve)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La sintesi dei composti spirociclici era basata su precedenti ricerche condotte da questo laboratorio, ma con alcune modifiche (Figura 1)11,12. L'avanzamento di ogni fase di reazione è stato monitorato mediante spettroscopia IR. Michael aggiunta del linker REM 1 con furfurilammina ha permesso di legare polimericamente 2 (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).</sup...

È noto che l'inibizione di piccole molecole dell'interazione dell'omologo doppio minuto 2 del topo ubiquitina-ligasi E3 (MDM2) con p53 ripristina l'induzione mediata da p53 dell'apoptosi delle cellule tumorali 1,2,3. MDM2 è un regolatore negativo della via p53 ed è spesso sovraespresso nelle cellule tumorali 4,5,6,7,8,9. Recenti studi cristallografici e biochimici hanno rivelato che piccole molecole contenenti una struttura spirociclica possono inibire efficacemente le interazioni MDM2-p5310. La struttura spirociclica (Figura 1, sfumata in blu) è considerata un motivo privilegiato in quanto la derivatizzazione di questo rigido sistema di anelli ortogonali ha portato alla scoperta di nuovi farmaci terapeutici. L'accesso a questa interessante architettura rappresenta una sfida quando si utilizzano tecniche di sintesi organica tradizionali. Sebbene siano stati studiati gli effetti terapeutici delle molecole spirocicliche nei sistemi biologici, la sintesi di queste molecole è ancora un processo ingombrante. I prodotti collaterali indesiderati, l'utilizzo di condizioni difficili e i metalli di transizione pericolosi sono spesso problematici.
Il potenziale uso del motivo spirociclico nello sviluppo di farmaci ha portato allo sviluppo di un protocollo che utilizza la sintesi in fase solida per generare una libreria di molecole con il motivo in aggiunta ad altri gruppi funzionali intercambiabili11,12. La separazione dei prodotti e dei reagenti tra le fasi potrebbe essere ottenuta semplicemente utilizzando un linker REM collegato a un cordone di resina e un contenitore filtrante in fase solida. Ciò ridurrebbe i passaggi e potenzialmente aumenterebbe i rendimenti. Questo approccio sintetico potrebbe produrre una vasta gamma di potenziali candidati farmaci. Tuttavia, l'efficacia di queste molecole in un sistema biologico richiederebbe ulteriori indagini.
Per determinare la citotossicità di questi composti spirociclici, è stato utilizzato il saggio MTT13,14. Questo metodo misura la vitalità cellulare e può essere utilizzato per determinare indirettamente la citotossicità cellulare. Diverse concentrazioni degli inibitori sono state aggiunte alle cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti e la proporzione di cellule viventi è stata misurata mediante analisi colorimetrica dell'entità della riduzione della MTT gialla da parte delle deidrogenasi mitocondriali al composto formazan viola (Figura 2). L'attività è più spesso riportata come un valore IC 50, la concentrazione alla quale la crescita cellulare è inibita del50% rispetto a un controllo non trattato. Questo articolo descrive il protocollo per il saggio MTT e i risultati preliminari di queste nuove molecole spirocicliche.

<table><tbody><tr><td><forte>CELLULE</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule COS-7 (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Cellule renali di scimmia verde africana</td></tr><tr><td><forte>CHIMICA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Bromoottano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>Alchil-alogenuro</td></tr><tr><td>allilbromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>Alchil-alogenuro</td></tr><tr><td>benzilbromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>Alchil-alogenuro</td></tr><tr><td>cisplatino</td><td>Cayman Chemical</td><td>13119</td><td>Controllo della citotossicità</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Dimetilformammide (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>DMEM, ad alto contenuto di glucosio, con L-glutammina</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Furfurilammina</td><td>Acros Organics</td><td></td><td>119800050 reagente&nbsp;</td></tr><tr><td>Iodometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>Alchil-alogenuro</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>MTT ((3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro)</td><td>EMD Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Resina REM</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>Supporto polimerico; 0,500 mmol/g loading</td></tr><tr><td>trans-&beta;-nitrostirene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>Reagente nitro-olefinico</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Trietilammina (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>Reagente per l'eliminazione della beta</td></tr><tr><td>Cloruro di trimetilsilil (TMSCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>386529</td><td>Reagente; ATTENZIONE - altamente volatile; crea HCl gas</td></tr><tr><td>VETRERIA/STRUMENTAZIONE</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL recipiente di reazione in fase solida</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>Vetreria con filtro</td></tr><tr><td>Lettore di piastre a 96 pozzetti</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>AVANCE III NMR Spectrometer</td><td>Bruker</td><td>N/</td><td>A Instrument; 300 MHz; Solventi: CDCl3 e CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>Strumento</td></tr> da <tr><td>polso Strumento</td><td>Burrell</td><td>Scientific 757950819</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Gli eterocicli spirociclici sono stati recentemente riportati in letteratura come potenziali farmaci per la terapia del cancro. La sintesi di questi nuovi sistemi ad anello ortogonale è impegnativa. Recentemente è stata pubblicata una metodologia efficiente per sintetizzare questi composti che descrive la sintesi in fase solida in quattro fasi anziché le cinque fasi precedentemente riportate. Il vantaggio di questa sintesi più breve è l'eliminazione dell'uso di reagenti tossici. La resina a base di linker Regenerating Michael (REM) a basso carico è risultata cruciale nella sintesi poiché le versioni ad alto carico hanno impedito l'aggiunta di reagenti contenenti ingombranti catene laterali feniliche e aromatiche. Il saggio colorimetrico 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) è stato utilizzato per esaminare la citotossicità delle concentrazioni micromolari di queste nuove molecole spirocicliche in vitro. MTT è prontamente disponibile in commercio e produce risultati relativamente veloci e affidabili, rendendo questo test ideale per questi eterocicli spirociclici. Sono state testate strutture ad anello ortogonali e furfurilammina (un precursore nel metodo di sintesi contenente un motivo ad anello simile a 5 membri).

Le ossime spirocicliche 6 e 7 sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato (Figura 1). Michael aggiunta di furfurilammina ad un linker REM 1b ha fornito resina legata al polimero 2. Il progresso della reazione è stato monitorato mediante spettroscopia infrarossa (IR) rilevando la scomparsa dell'estere α,β-insaturo a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 legata allo spirociclico è stata formata da 2 attraverso un intermedio transitorio 3. L...

Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Questo protocollo utilizza un metodo riciclabile e modificato nella produzione di composti spirociclici. Il test MTT aiuta a rispondere alla domanda relativa alla citotossicità di queste nuove molecole. Questa tecnica produce nuove molecole modificabili utilizzando un materiale di partenza rigenerante.Il test MTT fornisce risultati biologici relativamente rapidi e facili da analizzare Inizia eseguendo la sintesi in fase solida dei cicli etero spirociclici sei e sette, come precedentemente dimostrato. Preparare 20 millilitri di una soluzione MTT da cinque milligrammi per millilitro utilizzando PBS sterile come diluente. Filtrare e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.Quindi, preparare una diluizione uno-a-uno della soluzione MTT in DMEM. Preparare un millilitro ciascuna di soluzioni madre in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri di composti in esame in DMSO. Conservali a meno 20 gradi Celsius.Preparare 200 microlitri per dose delle soluzioni di lavoro dei composti in esame diluendo le concentrazioni di stock. Uno a 1000 in mezzo libero da siero. Nei semi di coltura tissutale, COS sette cellule in mezzo completo su coltura tissutale a fondo piatto hanno trattato 96 piastre di pozzetto ad una concentrazione di 4.000 cellule per 200 microlitri per pozzetto.Utilizzando un pipeter multicanale. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, aspirare il surnatante dai pozzetti usando una pipetta di pascolo di vetro collegata a una pompa per vuoto.Dosare le cellule in triplice copia con i composti in esame utilizzando le soluzioni di lavoro precedentemente preparate. Quindi restituire le cellule all'incubatore. Dopo 24 ore, aspirare il surnatante dai pozzetti e aggiungere 200 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto.Incubare il piatto per quattro ore. Aspirare delicatamente il surnatante dai pozzetti senza disturbare i cristalli viola formazane. Aggiungere 200 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli.Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Misurare l'assorbanza per ciascun pozzetto a 590 o 600 nanometri utilizzando un lettore di piastre a 96 pozzetti. Utilizzare pozzetti senza celle come sfondo e calcolare la media del valore di assorbanza.Le cuciture gox spirocicliche sei e sette sono state sintetizzate utilizzando un protocollo modificato. Il progresso della reazione è stato monitorato rilevando la scomparsa dell'alfa beta insatura Esther utilizzando la spettroscopia infrarossa. Il test MTT è stato utilizzato per determinare la vitalità cellulare.Il cisplatino, che è noto per indurre la morte cellulare ad alte concentrazioni, è servito come controllo positivo. Come previsto, maggiore è la concentrazione di cisplatino, minore è la vitalità cellulare. Il test MTT è stato quindi utilizzato per testare i composti spirociclici sei e sette e la furfurilammina.La furfurilammina e la cucitura spirociclica gox six hanno mostrato citotossicità simile. Tuttavia, la tossicità del composto spirociclico sette era notevolmente maggiore di quella della furfurilammina e sei. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che la N-alchilazione eseguita utilizzando alogenuri acilici voluminosi è stata trovata per ridurre il tasso di eliminazione beta riducendo così la resa del prodotto.

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Biologia

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Sono state sviluppate nuove vie per la sintesi di eterocicli contenenti azoto utilizzando la cercosporina come fotocatalizzatore privo di metalli.

Cercosporin-Fotocalalyzed [4/1]- e [4-2]-Annulations of Azoalkenes In Condizioni lievi

La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt è una metodologia importante per la generazione di composti aromatici biciclici coniugati colma di metina. Utilizzando una variante mediata dalla base della reazione aldola, è possibile accedere a una gamma di molecole fluorescenti e/o biologicamente rilevanti attraverso un approccio sintetico generalmente economico e operativamente semplice.

Sintesi di pirazolo dipendente dal pH, imidazolo e fluorofori di Isoindolone Dipyrrinone usando un approccio di condensazione claisen-schmidt

I composti tiofenesulfonammidici sono potenti e specifici inibitori dei regolatori del quorum sensing del vibrione LuxR/HapR che ne bloccano l'attività in vivo, impedendo così la trascrizione dei geni per la virulenza, la motilità e i biofilm. Questo protocollo descrive in dettaglio come questi composti vengono sintetizzati, modellati in silico e analizzati in vivo per l'attività contro LuxR/HapR.

Sintesi e dosaggio di inibitori del quorum sensing del vibrione

Qui presentiamo un protocollo per la progettazione guidata dalla struttura dell'interazione di legame proteina-ligando tra Sanglifehrin A e Ciclofilina A/Ganoderiolo-F, essenziale per scoprire nuovi farmaci. La stabilità del complesso ligando-recettore è stata valutata tramite simulazione della dinamica molecolare.

Progettazione e sviluppo guidati dalla struttura di nuovi inibitori della ciclofilina A e derivati del ganoderiolo-F: un approccio in-silico

Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Qui presentiamo un protocollo per identificare potenziali candidati farmaci antitubercolosi tramite screening fenotipico, comprendendo la sintesi chimica di un composto di 4-aminochinolina, la determinazione della sua concentrazione inibitoria minima contro Mycobacterium tuberculosis e la valutazione della sua citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi.

Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Scopri la sintesi di eterocicli spirociclici e il saggio di citotossicità con l'assay MTT su cellule COS7. Questo metodo valuta la viabilità cellulare per la ricerca sullo sviluppo di farmaci antitumorali.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

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