Name: Preparazione del campione dellimpianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Scopri un metodo HPLC-MS/MS per la quantificazione rapida e accurata di nucleosidi e nucleotidi nelle piante. Questa tecnica riproducibile analizza 10-20 campioni in due giorni, applicabile a diverse specie vegetali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali (KJQN202060), dalla National Natural Science Foundation of China (31900907), dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20190528), dal Centro internazionale per l'ingegneria genetica e le biotecnologie (CRP / CHN20-04_EC) a M.C., e i Fondi di Ricerca Fondamentale per le Università Centrali (LGZD202004) a X.L.

1 Crescita delle piante e raccolta dei materiali
<ol><li>Assicurarsi che i semi di Arabidopsis siano sterilizzati in etanolo al 70% per 10 minuti e seminati sulle piastre di agar, che sono state preparate con nutrienti Murashige e Skoog a metà resistenza.</li>
	<li>Incubare le piastre contenenti semi di Arabidopsis sotto scuro a 4 °C per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce di 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C e 8 h scure a 20 °C.</li>
	<li>Raccogliere 100 mg di piantine di 2 settimane (peso fresco) e congelare l'azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti. ATTENZIONE: I ricercatori devono indossare in modo appropriato guanti, occhiali protettivi e un camice da laboratorio per evitare la contaminazione dei tessuti umani durante la raccolta dei materiali.</li>
</ol>2 Estrazione nucleosidi/nucleotidi
<ol><li>Macinato 100 mg di tessuti vegetali congelati con 7-8 perline d'acciaio in un miscelatore pre-freddo per 5 minuti ad una frequenza di 60 Hz.</li>
	<li>Preparare la soluzione di estrazione, che contiene metanolo, acetonitrile e acqua in un rapporto di 2:2:1.</li>
	<li>Rimostrare i materiali omogeneizzati (compresa la maggior parte dei metaboliti ma non le proteine) con 1 mL di soluzione di estrazione.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione risultante a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire 0,5 ml della sospensione in un nuovo tubo da 1,5 ml e congelare l'azoto liquido.</li>
	<li>Evaporare il campione congelato in un tintore congelante e rimescolare in 0,1 mL di acetonitrile al 5% e 95% di acqua.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione risultante (0,1 mL) a 40.000 x g per 10 min a 4 °C. Caricare il supernatante in una fiala per la misurazione LC-MS/MS.</li>
</ol>3 Misurazione LC-MS/MS
<ol><li>Preparare un tampone di acetato di ammonio da 10 mM sciogliendo 1,1 g di acetato di ammonio in 2 L di acqua doppia deionizzata (fase mobile A). Regolare il pH al 9,5 per il 10% di ammonio e acido acetato.</li>
	<li>Preparare 2 L di metanolo ultrapuro al 100% (fase mobile B1) per la misurazione dei nucleosidi. Inoltre, preparare 2 L di acetonitrile ultrapuro al 100% (fase mobile B2) per la misurazione dei nucleotidi.</li>
	<li>Iniettare 0,02 mL di estrazione di metaboliti pretrattati di ciascun campione dal passaggio 2.7 in un sistema HPLC con pompe binarie (LC) accoppiate con un triplo spettrometro di massa quadrupolo (MS). ATTENZIONE: il sistema HPLC utilizza una colonna C18 (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavoro a 25 °C) tamponamento con fase mobile A e B1(Figura 1A)per la separazione dei nucleosidi e utilizzare una colonna di carbonio grafitico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavorando a 25 °C) con fase mobile A e B2(figura 1B)per la separazione dei nucleotidi. Ogni campione è stato iniettato tre volte per la replica tecnica.</li>
	<li>Programmate il metodo come illustrato nella tabella 1 per la colonna C18 e il metodo come illustrato nella tabella 2 per la colonna PGC. Impostare una portata di 0,65 mL min-1. NOTA: Le transizioni di massa (tabella 3) sono state monitorate da spettrometro di massa. Le condizioni di analisi dello spettro di massa di otto nucleosidi e cinque nucleotidi contenenti quelli canonici e modificati sono elencate nella tabella 3.</li>
	<li>Registrare le aree di picco di ogni composto bersaglio (Figura 1).</li>
</ol>4 Generazione delle curve di calibrazione standard
<ol><li>Mettere insieme sei estrazioni di campioni, prodotte seguendo la descrizione della sezione 2, e vortice. Quindi, aliquota di nuovo a sei estrazioni (stesso volume) per ottenere ogni sfondo.</li>
	<li>Aggiungere sei diverse concentrazioni di ogni norma a queste sei estrazioni, rispettivamente, e iniettarle una per una dopo il passaggio 3.3.</li>
	<li>Registrare le aree di picco di ogni standard a diverse concentrazioni attraverso le transizioni di massa come descritto nei passaggi 3.4 e 3.5.</li>
	<li>Tracciate l'area di picco rispetto alla concentrazione nominale di ogni standard per generare una curva a sei punti. NOTA: Le aree di picco dei nucleosidi/nucleotidi registrate nel passaggio 3.5 dovrebbero rientrare nell'intervallo delle curve di taratura standard.</li>
	<li>Calcolare l'equazione di una linea retta per ogni composto standard: Y = aX + b</li>
</ol>5 Quantificazione dei metaboliti
<ol><li>Calcolare il contenuto dei metaboliti utilizzando l'area di picco registrata nel passaggio 3.5 e l'equazione dal passaggio 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Gli organismi contengono vari nucleosidi/nucleotidi, inclusi quelli canonici e aberranti. Tuttavia, l'origine e gli endpoint metabolici di essi, in particolare i nucleosidi modificati, sono ancora oscuri. Inoltre, l'attuale comprensione della funzione e dell'omeostasi del metabolismo dei nucleosidi/nucleotidi deve ancora essere esplorata ed ampliata. Per studiarli, è necessario utilizzare un metodo preciso e standard per questi metaboliti di identificazione e quantificazione. Qui, abbiamo descritto un protocollo che util...

I nucleosides/nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi, che sono i precursori degli acidi nucleici e di molti coenzimi, come la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), e importanti nella sintesi di macromolecole come fosfolipidi, glicolipidi e polisaccaridi. Strutturalmente, il nucleoside contiene una nucleobase, che può essere un'adenina, guanina, uracile, citosina o timina, e una moiety zuccherina, che può essere un ribosio o un deossiribosio1,2. I nucleotidi hanno fino a tre gruppi fosfatici che si legano alla posizione a 5 atomi di carbonio della moiety zuccherina dei nucleosidi3. Il metabolismo dei nucleotidi nelle piante è essenziale per la germinazione dei semi e la crescita dellefoglie 4,5,6. Per comprendere meglio il loro ruolo fisiologico nello sviluppo delle piante, è necessario stabilire i metodi per la quantificazione assoluta dei diversi nucleosidi/nucleotidi in vivo.
Uno degli approcci più comunemente usati per misurare nucleosidi/ nucleotidi utilizza una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con un rivelatore uv-vis4,7,8,9,10,11. Nel 2013, utilizzando HPLC, Dahncke e Witte hanno quantificato diversi tipi di nucleosidi in Arabidopsis thaliana7. Hanno identificato un contenuto migliorato di guanosina in un mutante di inserimento del DNA T mirato nel gene della deaminasi della guanosina rispetto alla pianta di tipo selvatico. Un altro nucleoside pirimidina, la citidina, è stato anche rilevato quantitativamente nelle piante che utilizzano questo metodo, il che ha portato all'identificazione di un gene di deaminasi citidina in buona fede4. Basato sul rivelatore UV, questo metodo, tuttavia, non può facilmente distinguere i nucleosidi che hanno spettro e tempi di ritenzione simili, ad esempio guanosina o xanthosina. Il limite di rilevamento del metodo HPLC è relativamente alto, quindi, è frequentemente usato per la misurazione di alto contenuto di nucleosidi in vivo, come citidina, uridina e guanosina.
Inoltre, la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) può essere utilizzata anche nella misurazione nucleoside. Beneficiando di esso, Hauck et. al. ha rilevato con successo uridina e acido urico, che è un metabolita a valle della via catabolica nucleoside, nei semi di A. thaliana12. Tuttavia, gc viene normalmente utilizzato per separare i composti volatili ma non adatto alle sostanze termo labili. Pertanto, una cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) è probabilmente una tecnica analitica più adatta e accurata per l'identificazione, la separazione e la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi13,14. Diversi studi precedenti hanno riferito che una colonna HILIC può essere utilizzata per la separazione di nucleosidi e nucleotidi15,16 e standard interni isotopicamente etichettati sono stati utilizzati per la quantificazione composta17. Tuttavia, entrambi i componenti sono relativamente costosi, in particolare gli standard commerciali etichettati isotopici. Qui, segnalamo un approccio LC-MS/MS economicamente applicabile per la misurazione di nucleosidi / nucleotidi. Questo metodo è già stato utilizzato con successo per la quantificazione di diversi nucleosidi /nucleotidi, tra cui ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, nelle piante e Drosophila. Inoltre, il metodo che qui riferiamo può essere utilizzato anche in altri organismi.

<table><tbody><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>colonna Hypercarb</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-metiladenosina</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-metilguanosina</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Murashige e Skoog Medium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>colonna Polaris 5 C18A</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridina</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotidi sono elementi costitutivi di acidi nucleici, parti di cosubstrati e coenzimi, molecole di segnalazione cellulare e portatori di energia, che sono coinvolti in molte attività cellulari. Qui descriviamo un metodo rapido e affidabile per la qualificazione assoluta del contenuto nucleoside/nucleotidico nelle piante. In breve, 100 mg di materiale vegetale omogeneizzato sono stati estratti con 1 mL di tampone di estrazione (metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto di 2:2:1). Successivamente, il campione è stato concentrato cinque volte in un essiccatore a congelatore e quindi iniettato in una colonna di HPLC-MS/MS. Le transizioni di massa di ogni nucleoside e nucleotide sono state monitorate dalla spettrometria di massa. Il contenuto dei nucleosidi e dei nucleotidi è stato quantificato in base ai loro standard esterni (ESTD). Utilizzando questo metodo, quindi, i ricercatori possono facilmente quantificare nucleosides / nucleotidi in diverse piante.

Qui, mostriamo l'identificazione e la quantificazione della N1-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, nelle piantine di tipo selvatico Arabidopsis (Col-0) di 2 settimane come esempio. Il profilo della spettrometria di massa indica che gli ioni prodotto generati dallo standard N1-metilladenosina sono 150 m/z e 133 m/z(figura 2A), e lo stesso profilo si osserva anche nell'estrazione Col-0(figura 2B).<...

Qui viene descritto un metodo preciso e riproducibile per la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Questo metodo utilizza un HPLC-MS/MS.

Preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Nucleosides e nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi. Il loro metabolismo è necessario per lo sviluppo cellulare. Questo approccio fornisce un potente strumento per la quantificazione di questi metaboliti.Questo metodo consente una quantificazione rapida e accurata di nucleosidi e nucleotidi nelle piante. I pre-trattamenti completi del campione e le analisi LC-MS/MS hanno una soluzione di circa due giorni per un set di 10-20 campioni. Questo metodo può essere applicato a tutte le piante e anche ad altri organismi.A dimostrare la procedura sarà Changhua Zhu, professore associato del Laboratorio Chen. Per coltivare le piante, assicurarsi che i semi arabidopsis vengano sterilizzati in 70%etanolo per 10 minuti e seminati su piastre di agar con 1/2 forza di nutrienti Murashige e Skoog. Incubare le piastre al buio a quattro gradi Celsius per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce a 22 gradi Celsius e otto ore di buio a 20 gradi Celsius.Raccogliere 100 milligrammi di piantine di due settimane e congelarle in azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti. Macinare 100 milligrammi di tessuti vegetali congelati con da sette a otto perline di acciaio in un miscelatore preritolato per cinque minuti ad una frequenza di 60 Hertz. Preparare la soluzione di estrazione, che contiene metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto tra due e due a uno.Rimostrare i materiali omogeneizzati con un millilitro della soluzione di estrazione. Centrifugare la soluzione risultante a 12.000 XG per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi trasferire 0,5 millilitri della sospensione in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e congelarlo in azoto liquido. Evaporare il campione congelato in un essiccatore a congelatore e riprenosirlo in 0,5 millilitri di acetonitrile al 5% e 95% di acqua.Centrifugare la soluzione risultante a 4.000 XG per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Caricare il supernatante in una fiala per la misurazione LC-MS/MS. Preparare un tampone di acetato di ammonio millimolare sciogliendo 1,5 grammi di acetato di ammonio in due litri di acqua doppia deionizzata.Regolare il pH a 9,5 con il 10% di ammonio e acido acetato. Preparare due litri di ultrapuro 100%metanolo per la misurazione dei nucleosidi, quindi preparare due litri di acetonitrile ultrapuro per la misurazione dei nucleotidi. Iniettare 0,02 millilitri dell'estrazione di metaboliti pretrattati di ogni campione precedentemente preparato in un sistema HPLC con pompe binarie accoppiate con un triplo spettrometro di massa quadruplo.Per generare le curve di calibrazione standard, raggruppare sei estrazioni di campioni insieme e vortice la miscela, quindi aliquotarla nuovamente a sei estrazioni per ottenere ogni sfondo. Aggiungere sei diverse concentrazioni di ogni standard rispettivamente a queste sei estrazioni e iniettarle una per una nel sistema HPLC. Registrare le aree di picco di ogni standard a diverse concentrazioni attraverso le transizioni di massa.Questo protocollo è stato utilizzato per identificare e quantificare l'N1-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, in piantine di tipo selvatico Arabidopsis vecchie di due settimane. Il profilo di spettrometria di massa indicava che gli ioni prodotto generati dallo standard N1-metilladenosina sono a rapporti 150 e 133 MZ. E lo stesso profilo è stato osservato nell'estrazione zero della Colombia.A causa dell'elevata abbondanza dello ione prodotto di 150 MZ, la transizione di massa da 282,1 a 150 è stata selezionata per l'identificazione N1-metilladenosina. Il tempo di conservazione del picco di destinazione è stato di 7,05 minuti. Come il tempo di conservazione dello standard N1-metilladenosina.Una serie di concentrazione di standard N1-metilladenosina è stata aggiunta in sei estrazioni di campioni. I campioni standard sono stati iniettati nella LC-MS/MS e le aree di picco aumentate della N1-metilladenosina sono state tracciate rispetto alle concentrazioni nominali delle norme. Le sei estrazioni di fondo uguali sono importanti per effettuare una curva di taratura accurata e ripetibile per la quantificazione.Il nostro metodo può essere applicato per esplorare le vie metaboliche nelle piante. Confrontando i profili dei metaboliti tra mutanti di tipo selvatico e mutanti a perdita di funzione, si potrebbe disegnare il flusso metabolico.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.

I radicali liberi in Chemical Biology: da comportamento chimico a sviluppo Biomarker

Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati ​​e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.

Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione

Biomassa vegetale offre una risorsa rinnovabile per più prodotti, compreso il combustibile, mangimi, prodotti alimentari e una varietà di materiali. In questo articolo analizziamo le proprietà di albero di tabacco (Nicotiana glauca) e pioppo fonti adatti per una pipeline bioraffineria.

Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l&#39;industria con sede a Bio

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.

Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell'essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.

Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi

Descriviamo qui metodi per la quantificazione sensibile e accurata delle lesioni 8-oxo-7, 8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deossiadenosina (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2a '-deossiguanosina (1,N2-DGUO) nel DNA. I metodi sono stati applicati alla valutazione degli effetti del particolato fine ambientale (PM2,5) nei tessuti (polmone, fegato e rene) dei topi a/J esposti.

Quantificazione di tre lesioni del DNA mediante spettrometria di massa e valutazione dei loro livelli nei tessuti di topi esposti a particolato fine ambientale

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per un metodo di sequenziamento basato su LC-MS che può essere utilizzato come metodo diretto per sequenziare RNA corto (&lt;35 nt per corsa) senza un intermedio di cDNA e come metodo generale per sequenziare diverse modifiche nucleotidiche in un singolo studio con precisione a base singola.

2D-HELS MS Seq: Un metodo generale basato su LC-MS per il sequenziamento diretto e de novo di miscele di RNA con diverse modifiche nucleotidiche

In questo protocollo, presentiamo un flusso di lavoro ottimizzato, che combina una preparazione efficiente e veloce del campione di molti campioni. Inoltre, forniamo una guida passo-passo per ridurre le variazioni analitiche per la valutazione ad alto rendimento degli studi GWAS metabolici.

Studi di associazione multiomica su larga scala (Mo-GWAS): linee guida per la preparazione e la normalizzazione dei campioni

Le modificazioni post-trascrizionali dell'RNA rappresentano uno strato poco studiato di regolazione della traduzione che è stato recentemente collegato alla plasticità del sistema nervoso centrale. Qui, viene descritta la preparazione del campione e l'approccio di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem per la caratterizzazione simultanea di numerose modifiche dell'RNA in singoli neuroni.

Caratterizzazione delle modifiche dell'RNA in singoli neuroni utilizzando la spettrometria di massa

Scopri un metodo HPLC-MS/MS per la quantificazione rapida e accurata di nucleosidi e nucleotidi nelle piante. Questa tecnica riproducibile analizza 10-20 campioni in due giorni, applicabile a diverse specie vegetali.

Preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS

Esplora altri video