Sferoidi cardiaci come tessuti cardiaci bioingegnerati in vitro per studiare la fisiopatologia del cuore umano
23 gennaio 2021
Questo protocollo mira a fabbricare sferoidi cardiaci 3D (CS) co-coltivando cellule in gocce appese. I CS incorporati nel collagene vengono trattati con doxorubicina (DOX, un agente cardiotossico) a concentrazioni fisiologiche per modellare l'insufficienza cardiaca. I test in vitro che utilizzano CS trattati con DOX possono essere utilizzati per identificare nuove terapie per i pazienti con insufficienza cardiaca.
Una delle principali sfide nell'ingegneria di un tessuto cardiaco umano include la sua vascolarizzazione. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello in vitro del cuore umano co-coltivando cellule trovate in vivo. Questi includono miociti cardiaci, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali cardiache.
Tutte insieme, queste cellule consentono la ricapitolazione del microambiente cardiaco umano, compresi i suoi componenti molecolari, cellulari ed extra cellulari. Li usiamo nel nostro laboratorio per testare diversi farmaci alla ricerca di saggi sulla tossicità dei farmaci. Questi includono la doxorubicina, un noto farmaco cardiotossico che colpisce il cuore umano anche anni dopo il suo trattamento.
Coltimo separatamente fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali e miociti prima di formare sferoidi. Per coltivare cardiomiociti, raccogliamo il flaconcino da meno 80 gradi e lo riscaldamo a 37 gradi per quattro minuti in un bagno d'acqua. Quindi spruzziamo la fiala criogenica con il 70% di etanolo e la spostiamo in un armadio di biosicurezza.
Raccogliamo delicatamente la sospensione cellulare e la trasferiamo in un tubo Falcon da 15 millilitri. Raccogliamo un millilitro di mezzo di placcatura prebellico, risciacquiamo il flaconcino crio una volta e poi lo aggiungiamo al tubo Falcon da 50 millilitri, una goccia alla volta ogni quattro secondi. Mentre aggiungi il mezzo di placcatura, scuoti delicatamente il tubo Falcon.
Con una pipetta a cella, raccogliere sette millilitri di mezzo di placcatura e aggiungerlo delicatamente al tubo Falcon da 15 millilitri. Una volta aggiunto il volume finale del mezzo di placcatura al tubo Falcon, trasferire la sospensione cellulare ai contenitori di tessuto codificati con fibronectina. Infine, spostare le cellule in un'incubatrice.
Dopo due giorni, raccogliamo i contenitori di tessuto dall'incubatrice e controlliamo la confluenza cellulare al microscopio. A questo punto, spostiamo il pallone in un armadio di biosicurezza e rimuoviamo il mezzo di placcatura. Risciacquiamo delicatamente le cellule con lo stesso mezzo di placcatura dal pallone tissutale quattro o cinque volte.
Lo sostituiamo con un nuovo mezzo di manutenzione e li spostiamo in un incubatore per uno o due giorni aggiuntivi. Il giorno in cui creiamo impiccagioni di colture, raccogliamo tutti e tre i tipi di cellule dall'incubatrice. Ci scheggiamo nelle cellule rimuovendo il supporto.
Li risciacquiamo con tre millilitri di PBS. E infine aggiungiamo i trucioli nelle cellule. I contenitori vengono quindi spostati in un'incubatrice e incubati per un massimo di cinque minuti.
Per generare sferoidi cardiaci, co-coltimo 20.000 cellule per goccia appesa. Questi includono 10.000 cardiomiociti, mille fibroblasti cardiaci e 5.000 cellule interne cardiache. Questi sono co-coltivati in piatti a goccia sospesa 384 pozzi.
Sono placcati usando il nostro sistema di movimentazione dei liquidi. Aggiungiamo anche PBS sulle pareti laterali delle piastre di caduta appese per evitare che le colture si asciughino nell'incubatrice. Spostare con cura la piastra di caduta appesa contenente celle nell'incubatrice.
Tra i tre e i quattro giorni si formerà lo sferoide. Raccogliamo la piastra di caduta sospesa dall'incubatrice e controlliamo che gli sferoidi si formino all'interno di ogni pozzo. Come mostrato in queste immagini, abbiamo un insieme di sferoidi all'interno del centro di ogni pozzo.
Una volta formati, raccogliamo sferoidi e li incorporiamo nei gel di collagene. Una punta della pipetta viene tagliata all'interno in modo da prevenire danni allo sferoide. Gli sferoidi vengono raccolti e trasferiti in un tubo Falcon da 50 millilitri dove vengono riuniti.
Spiniamo giù la sospensione dello sferoide a 300 G per cinque minuti per separarli dal mezzo. Usiamo 96 piastre di pozzo con pareti scure per immaginire sferoidi, il supporto viene rimosso o sostituito con un gel di collagene in un tubo Falcon. L'idrossido di sodio viene aggiunto alla sospensione del gel sferoide prima che siano placcati nella piastra della parete scura.
100 microliter di sospensione dello sferoide vengono aggiunti in ogni pozzo e incubati per 30 minuti a 37 gradi. I farmaci, tra cui doxorubicina e altri agenti, vengono aggiunti alla piastra dello sferoide e incubati per 24 ore. Il giorno seguente, abbiamo preparato una soluzione contenente calcio AM e omodimero di etidio, etichettando vivono rispettivamente sotto le cellule.
Questa soluzione è preparata per aggiungere il centesimo a questa piastra filtrante. Gli sferoidi vengono quindi incubati a 37 gradi per un'ora. Usiamo un lettore di piastre per misurare la fluorescenza del calcio AM e il loro omodimero di etidio nella piastra.
Queste misurazioni vengono quindi utilizzate dal nostro software per eseguire un'analisi statistica. Misuriamo l'attività contrattile degli sferoidi trattati con i diversi farmaci utilizzando un sistema ottico ionico. Gli sferoidi vengono spostati allo stadio tra due elettrodi.
Ciò consente sia di controllare che di misurare l'attività contrattile in base al potenziale sul campo. In questo modo, possiamo testare diverse tensioni e intervalli di frequenza per stimolare gli sferoidi. Uno sferoide all'epoca è stato identificato e utilizzato per quelle misurazioni.
Gli sferoidi che non hanno ricevuto doxorubicina saranno in grado di costruire seguendo la stimolazione elettrica. Al contrario, gli sferoidi trattati con doxorubicina non si contrarranno. Per visualizzare la forma di rete cellulare endoteliale all'interno di ogni sferoide, li abbiamo fissati con una soluzione di paraformaldeide del 4% per un'ora a temperatura ambiente.
Abbiamo spostato la piastra su uno shaker che consente la delicata permeazione della soluzione attraverso il gel. Il PFA viene rimosso e risciacquato tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. Abbiamo portato la mobilitazione ovviamente aggiungendo una soluzione allo 0,02% di Triton X in PVSA per 20 minuti a temperatura ambiente.
La soluzione di blocco contiene 3%BSA in PBC, che viene quindi aggiunto alla piastra per un'ora a temperatura ambiente. Una soluzione contenente l'anticorpo primario contro CD 31. Un marcatore per l'endoteliale viene aggiunto alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi.
Il giorno seguente, la soluzione di anticorpo primario viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. La soluzione anticorpale secondaria contenente anche la macchia esagonale viene aggiunta alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi. Infine, la seconda soluzione anticorpale viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio.
Dopo essere rimasto con anticorpi primari e secondari, la piastra può essere immagine utilizzando il nostro microscopio confocale. Una corretta rete vascolare è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione delle cellule cardiache. Gli sferoidi cardiaci presentano una rete cellulare endoteliale che ricapitola meglio quella presente nel cuore umano rispetto alle colture monostrato delle cellule cardiache.
Date le caratteristiche uniche, gli sferoidi cardiaci rappresentano strumenti avanzati per i test in vitro per la ricerca cardiovascolare.
Panoramica
Questo protocollo descrive la fabbricazione di sferoidi cardiaci tridimensionali (CS) mediante la co-coltura di miociti cardiaci, fibroblasti e cellule endoteliali in gocce sospese. I CS vengono trattati con doxorubicina per modellare lo scompenso cardiaco e testare potenziali terapie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Test di tossicità dei farmaci
- Modellizzazione dell'insufficienza cardiaca
Sfondo
- La creazione di tessuto cardiaco umano presenta sfide, in particolare per quanto riguarda la vascolarizzazione.
- I modelli in vitro possono riprodurre il microambiente del cuore umano.
- La doxorubicina è un agente notoriamente cardiotoxico che altera la funzione cardiaca.
- La co-coltura di diversi tipi cellulari è essenziale per generare sferoidi cardiaci funzionali.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello in vitro affidabile del tessuto cardiaco.
- Studiare gli effetti della doxorubicina sui sferoidi cardiaci.
- Identificare potenziali terapie per i pazienti con insufficienza cardiaca.
Metodi Utilizzati
- Co-coltura di miociti cardiaci, fibroblasti e cellule endoteliali in gocce sospese.
- Incorporazione di sferoidi in gel di collagene per il trattamento farmacologico.
- Misurazione della fluorescenza per valutare la vitalità cellulare e l'attività contrattile.
- Immunomarcatura per visualizzare le reti endoteliali all'interno dei sferoidi.
Risultati principali
- Formazione riuscita di sferoidi cardiaci con composizioni cellulari distinte.
- Il trattamento con doxorubicina ha determinato un'alterazione dell'attività contrattile dei sferoidi.
- Saggi di fluorescenza hanno indicato livelli variabili di vitalità cellulare dopo il trattamento.
- Le reti endoteliali sono state efficacemente visualizzate mediante tecniche di immunomarcatura.
Conclusioni
- Il modello di sferoide cardiaco sviluppato è uno strumento prezioso per lo studio della insufficienza cardiaca.
- Gli effetti cardiotoxici della doxorubicina possono essere modellati efficacemente in vitro.
- Questo approccio potrebbe contribuire alla scoperta di nuove strategie terapeutiche per l'insufficienza cardiaca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli sferoidi cardiaci forniscono un modello in vitro fisiologicamente rilevante per valutare la cardiotoxicità indotta da farmaci e i meccanismi patofisiologici nel tessuto cardiaco umano. Riproducendo la composizione multicellulare e le caratteristiche della matrice extracellulare, consentono un profilo predittivo della sicurezza e una riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci cardiovascolari. Ciò supporta decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali e riduce l'abbandono nelle fasi avanzate a causa di effetti avversi cardiaci imprevisti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche modellando la patofisiologia cardiaca umana in un contesto multicellulare.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target attraverso la valutazione dell'attività contrattile e della vitalità cellulare in condizioni rilevanti per la malattia.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella selezione delle target dimostrando risposte dose-dipendenti a cardiotoxine note come la doxorubicina.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per quantificare gli effetti dei composti sulla contrattilità sincronizzata e sulla vitalità.
- Valore operativo: Facilita la prontezza del saggio grazie alla formazione costante di sferoidi in piastre a goccia sospesa e alla compatibilità con letture fluorimetriche ed elettrofisiologiche.
- Scalabilità: Consente schermate a media capacità mediante formati a 384 pozzetti a goccia sospesa e manipolazione liquida automatizzata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica modellando il deposito di matrice extracellulare e la formazione di reti vascolari simili a quelle umane.
- De-risking meccanicistico: Permette l'indagine dei percorsi di cardiotoxicità, come l'inibizione della sintasi dell'ossido nitrico endoteliale, per chiarire il meccanismo d'azione.
- Avanzamento basato sul rischio: Consente l'identificazione precoce di composti con profili di sicurezza cardiaca favorevoli prima degli studi in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Gli sferoidi cardiaci si integrano nel flusso di lavoro di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del capostazione, fornendo un sistema rilevante per l'uomo per la valutazione della sicurezza e dell'efficacia cardiovascolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione degli obiettivi modellando il microambiente cardiaco umano e le modifiche funzionali indotte da farmaci.
- Screening: Permette una valutazione riproducibile e quantitativa degli effetti dei composti sulla contrattilità e sulla vitalità mediante fluorescenza ed elettrofisiologia.
- Analisi: Genera letture multiparametriche, inclusa l'attività contrattile, la vitalità cellulare e le reti vascolari immunomarcate, per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Modella la matrice extracellulare cardiaca umana e la vascolarizzazione, favorendo la continuità verso la validazione preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma scalabile e standardizzata applicabile a diverse indicazioni cardiovascolari e modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva modellando la fisiopatologia cardiaca umana con complessità multicellulare e contrattilità fisiologica.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie a rapporti cellulari definiti, formazione di gocce sospese e inclusione in gel di collagene.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di composti cardiotoxici, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei candidati aggiustata per il rischio sulla base di dati di sicurezza cardiaca rilevanti per l'uomo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella differenziazione delle cellule staminali, nelle tecniche di coltura 3D e nell'analisi delle reti vascolari mediante microscopia confocale.
- È dipendente da piattaforme a goccia sospesa, lettori di piastre a fluorescenza e sistemi ionici ottici per la misurazione della contrattilità.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale per l'approvvigionamento cellulare, i protocolli di differenziazione e i tempi di formazione degli sferoidi.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la variazione dei tipi cellulari, dei rapporti e dei componenti della matrice extracellulare per la modellizzazione delle malattie.
- I limiti pratici comprendono l'assenza di carico meccanico e di una maturazione completa rispetto al tessuto cardiaco umano adulto nativo.
