Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca²⁺ e corrente di calcio di tipo L

Gli esperimenti di patch clamp e imaging del calcio sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e impegnativi. Questo protocollo fornisce un metodo conveniente per isolare cardiomiociti atriali e ventricolari murini di alta qualità, adatto per esperimenti di patch clamp e imaging del calcio eseguito contemporaneamente. Il vantaggio principale di questo protocollo è che possiamo ottenere cardiomiociti atriali e ventricolari dallo stesso animale.

L'isolamento dei cardiomiociti atriali murini è particolarmente impegnativo ed è stato un fattore limitante per gli esperimenti precedenti. Iniziare pre-riempiendo l'apparato Langendorff con un tampone di perfusione e assicurandosi che sia privo di aria. Fissare una cannula aortica al microscopio di dissezione e collegarla con una siringa da un millilitro riempita con tampone di perfusione.

Dopo aver rimosso il cuore dal topo soppresso, mettere il cuore in un tampone di perfusione a temperatura ambiente e incannulare l'aorta con un ago smussato al microscopio il più rapidamente possibile. Legare saldamente il cuore all'ago con un pezzo di seta da sutura e scollegare la siringa. Dopo l'incannulamento aortico, collegare immediatamente il cuore cannulato all'apparato di Langendorff, evitando che l'aria entri nel sistema.

Perfondere il cuore con un tampone di perfusione per un minuto esattamente a 37 gradi Celsius e una velocità di perfusione di quattro millilitri al minuto. Passa dalla perfusione al tampone per la digestione e perfondi per esattamente nove minuti a una temperatura di 37 gradi Celsius e una velocità di perfusione di quattro millilitri al minuto. Al termine, trasferisci il cuore digerito in una capsula di Petri con abbastanza tampone digestivo per mantenerlo completamente coperto.

Quindi sezionare attentamente gli atri e i ventricoli al microscopio. Trasferire gli atri in una capsula di Petri con 1,5 millilitri di tampone digestivo e i ventricoli in un'altra capsula di Petri con tre millilitri di tampone digestivo. Separare con cautela ma rapidamente gli atri in piccoli pezzi usando una pinza smussata.

Sciogliere il tessuto pipettandolo accuratamente su e giù con un puntale per pipetta da 1000 microlitri precedentemente tagliato per allargare l'apertura del puntale. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto pipettando lungo il lato della provetta. Passare tutti e tre i millilitri della soluzione attraverso una rete di nylon da 200 micrometri per rimuovere i restanti pezzi di tessuto più grandi che non sono stati completamente digeriti.

Per eseguire la dissezione ventricolare, tagliare il tessuto ventricolare in piccoli pezzi usando forbici o pinze da dissezione e pipettare su e giù con un altro puntale di pipetta da 1000 microlitri per scioglierlo. Trasferire la soluzione di cellule e tessuti in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere una quantità equivalente di tampone di arresto pipettandolo con cura lungo il lato della provetta per terminare la reazione. Passare tutti e sei i millilitri di soluzione cellulare e tissutale attraverso una rete di nylon da 200 micrometri per rimuovere i pezzi più grandi che non sono stati completamente digeriti.

Lasciare le sospensioni di cellule atriali e ventricolari sul banco a temperatura ambiente per sei minuti per riposare. Quindi centrifugare le provette a 5G per due minuti. Scartare i surnatanti utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e risospendere con cura i pellet cellulari in 10 millilitri di soluzione di Tyrode priva di calcio.

Lasciare le cellule atriali e ventricolari per otto minuti per la sedimentazione. Centrifugare le cellule atriali a 5G per un minuto. Quindi scartare i surnatanti da entrambi i campioni cellulari e risospendere con cura i pellet in 10 millilitri di soluzione di Tyrode con 100 micromolari di calcio.

Lasciare le cellule per otto minuti per la sedimentazione, quindi ripetere la centrifugazione delle cellule atriali. Scartare i surnatanti e risospendere con cura i pellet cellulari in 10 millilitri di soluzione di Tyrode con 400 micromolari di calcio. Ripetere questo processo ancora una volta, risospendendo le cellule nella soluzione di Tyrode con un millimolare di calcio.

Tutte le cellule atriali sono piccole con capacità cellulari che vanno da circa 35 a 100 picofarad. Qui è mostrata una cellula tipica del miocardio funzionante atriale. I miociti ventricolari sono più a forma di bastoncino e più grandi, con capacità cellulari che vanno da 100 a circa 400 picofarad.

Esempi di misurazioni della corrente di calcio di tipo L con transitori citosolici simultanei di calcio da un miocita atriale e un miocita ventricolare sono mostrati qui. Prima di provare questa tecnica, assicurati di esercitarti con il prelievo di organi. È fondamentale che la fase venga eseguita rapidamente e che tutti i tagli di tessuto siano eseguiti nelle posizioni corrette.

Quando il prelievo di organi viene eseguito con una qualità riproducibile, prenditi un po' di tempo per perfezionare l'incannulamento. Le celle isolate con questo protocollo sono adatte per le misure di patch clamp. Inoltre, possono essere caricati con coloranti fluorescenti, consentendo un'ampia gamma di esperimenti di imaging.