Name: Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dallesposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri un modello murino per studiare le infezioni urinarie ricorrenti da Escherichia coli innescate da Gardnerella vaginalis. Questo metodo permette di analizzare i meccanismi batterici e le strategie terapeutiche.

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Gli autori ringraziano Lynne Foster per l'assistenza tecnica negli esperimenti sulle infezioni, James Fitzpatrick presso il Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) per l'accesso al SEM, Scott Hultgren per il ceppo UTI89kanR UPEC e David Hunstad per la lettura critica del manoscritto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), dal Center for Women's Infectious Disease Research presso la Washington University School of Medicine (Pilot Research Award to NMG), dall'American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) e #14POST20020011 (NMG), e dal National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) e NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, progetto II PI:ALL) e K01 DK110225-01A1 (NMG). Alcuni degli studi sugli animali sono stati condotti in una struttura supportata dalla sovvenzione NCRR C06 RR015502. Il Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; dove è stata eseguita la SEM) e MSJ sono stati supportati dalla Washington University School of Medicine, dal Children's Discovery Institute della Washington University e dal St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), dalla Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) e dal National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse relativi a questo studio.

Il primo passo critico in questo modello per identificare i topi che non hanno eliminato la batteriuria UPEC durante la fase primaria di UTI. Questi topi devono essere rimossi dall'esperimento in quanto altrimenti confonderebbero i tassi di batteriuria UPEC dopo l'esposizione a G. vaginalis. Dopo l'inoculazione iniziale di UPEC, l'urina deve essere raccolta settimanalmente per monitorare la clearance batterica. Circa il 65-80% dei topi C57BL/6 eliminerà un'infezione da UTI89kanR entro 4 settimane. Altri ceppi di topo inbred hanno diverse propensioni per la clearance UPEC42,43 e la formazione del serbatoio e quindi potrebbero non essere adatti per questo modello. Il secondo punto critico è che studi empirici hanno determinato che due inoculazioni sequenziali di G. vaginalis (a 12 ore o 1 settimana di distanza) sono necessarie per innescare una significativa emergenza del serbatoio sopra l'emergenza spontanea di fondo che si verifica nei topi di controllo esposti solo a PBS. Altre durate di tempo tra le due esposizioni sequenziali non sono state testate, ma potrebbero produrre risultati simili. È importante notare che una riduzione dei titoli della vescica UPEC è stata osservata solo nel modello in cui le esposizioni a G. vaginalis sono state somministrate 1 settimana a parte39. Mentre possono essere somministrate più di due esposizioni, l'evidenza empirica suggerisce che la cateterizzazione ripetuta da sola aumenta l'emergenza, il che può confondere l'interpretazione dei risultati o richiedere un numero maggiore di animali per distinguere le differenze tra gruppi di esposizione e controlli. Infine, il metodo di fissazione della vescica in situ ha diversi passaggi critici. È necessaria una certa abilità per garantire che il fissativo rimanga all'interno delle vesciche bloccate. Le vesciche sgonfiate saranno più difficili da visualizzare da SEM. È anche essenziale essere molto delicati quando si inocula il fissativo nella vescica, poiché raschiare l'urotelio con il catetere contenente fissativo può indurre l'esfoliazione uroteliale indipendentemente da ciò che viene innescato da G. vaginalis. Tutte le concentrazioni menzionate nel cocktail fissativo sono concentrazioni finali. Rapporti impropri di questi possono causare un fissaggio insufficiente e gonfiore o restringimento delle cellule. I fissativi devono essere riscaldati a temperature fisiologiche per evitare shock termici nelle cellule e nei tessuti. Il riscaldamento fornisce anche un leggero miglioramento del tasso di diffusione dei fissativi attraverso le membrane plasmatiche. Mentre la colorazione dell'osmio può spesso essere omessa per i campioni preparati per l'analisi SEM, è un passo essenziale in questo protocollo per stabilizzare i lipidi e prevenire la fessurazione delle membrane cellulari durante l'essiccazione del punto critico.
Questo protocollo può essere modificato per testare altri ceppi UPEC e / o G. vaginalis per la loro capacità di formare serbatoi e di innescare la loro comparsa, rispettivamente. Altri fattori sperimentali possono anche essere aggiunti, come l'esposizione ad altri batteri vaginali (ad esempio, Lactobacillus crispatus PVAS100) o G. vaginalis ucciso dal calore, nessuno dei quali dimostra patologia in questo modello39. Quando si selezionano altri ceppi batterici da testare, è importante dimostrare una crescita costante in modo tale che una concentrazione standard di inoculo possa essere utilizzata in tutti gli esperimenti. La crescita di JCP8151BSmR è stata ottimizzata in una camera anaerobica. Questo ceppo potrebbe probabilmente essere coltivato in un sistema GasPak anaerobico, ma ciò richiederebbe un'ottimizzazione per garantire una robusta crescita batterica. Infine, potrebbe essere possibile modificare la tempistica di determinati passaggi nel modello. Ad esempio, l'urina può essere raccolta in momenti precedenti durante la fase di formazione del serbatoio UPEC per monitorare le risposte CFU o dell'ospite. In questo modello non è stato osservato un effetto avverso della raccolta di campioni di urina nei primi timepoint (3, 6, 12 hpi) sulla progressione dell'infezione o sulla creazione di serbatoi. È stato segnalato che l'emergere di serbatoi UPEC si verifica dopo due dosi di JCP8151BSmR somministrate 12 ore o 1 settimana, ma altri intervalli di tempo non sono ancora stati testati. Potrebbe anche essere possibile ridurre la durata complessiva del tempo per il modello riducendo la fase di formazione del serbatoio UPEC a 2 settimane (anziché 4 settimane), poiché molti dei topi eliminano la batteriuria a questo punto. Studi precedenti che esaminavano l'emergenza UPEC in seguito all'esposizione della vescica a esfolianti chimici utilizzavano una fase di formazione del serbatoio UPEC di 1 o 2 settimane17,18. Tuttavia, la riduzione della quantità di tempo per la clearance della batteriuria UPEC può avvenire a costo di richiedere che più animali vengano abbattuti dall'esperimento. Infine, l'analisi SEM della vescica può essere eseguita in punti temporali aggiuntivi per osservare la durata dell'effetto di G. vaginalis sull'urotelio.
Per quanto riguarda la risoluzione dei problemi, ci sono alcune considerazioni importanti in particolare rispetto all'analisi SEM della vescica. A seconda dello sfondo del topo utilizzato e della quantità di infiammazione presente, alcune vesciche si presenteranno con pareti molto sottili. Queste vesciche tendono ad arricciarsi di più durante l'essiccazione del punto critico e possono provocare una forma a conchiglia di cowrie. Se ciò si verifica, il metodo migliore è tagliare la vescica a forma di guscio a metà lungo l'interfaccia arricciata e poi una seconda volta per rimuovere la maggior parte del tessuto sporgente. Il taglio funziona meglio con una lama di rasoio a doppio taglio rivestita in PTFE. Il grasso in eccesso a volte può solubilizzarsi durante le fasi di colorazione dell'osmio. Ciò può causare goccioline di grasso insolubili indesiderate che potrebbero non lavarsi via durante le fasi di risciacquo e disidratazione e che possono depositarsi sulla superficie della vescica durante la successiva asciugatura. Queste goccioline possono apparire come piccole sfere o strutture simili a dischi sparse sul campione (Figura 4D). Questo può essere mitigato assicurando che il più possibile il tessuto adiposo venga rimosso da tutto il vescica. Il platino può essere sostituito dal rivestimento in iridio, ma gli spessori devono essere ridotti al minimo per ridurre il mascheramento dei dettagli strutturali fini. L'uso di uno stadio rotante durante il rivestimento è altamente raccomandato.
Una limitazione di questo modello è che richiede un gran numero di topi. Solo il 65-80% dei topi C57BL/6 eliminerà la batteriuria UPEC e sarà adatto per la successiva inoculazione di G. vaginalis o PBS (vedere Figura 2C). Per ottenere 10-12 topi per gruppo (inoculazione G. vaginalis vs PBS), ~ 30 topi devono essere inizialmente infettati da UPEC. Inoltre, sono probabilmente necessari più esperimenti per ottenere le repliche biologiche necessarie per rilevare la significatività statistica. Quando le esposizioni sono state somministrate a 1 settimana di distanza, l'emergenza UPEC si è verificata nel 14% dei topi esposti a PBS (Figura 3B). Pertanto, rilevare un aumento significativo dell'UPEC rUTI nei topi esposti a G. vaginalis rispetto ai controlli PBS (alimentato a 0,8; alfa = 0,05 [un lato]) richiede il test di un totale cumulativo di almeno 40 topi per ciascun gruppo di esposizione. Un'ulteriore considerazione è che questi esperimenti sono costosi e laboriosi. I topi devono essere monitorati settimanalmente per la clearance UPEC e il corso del tempo sperimentale è di 4-5 settimane a seconda che G. vaginalis venga somministrato due volte in un lasso di tempo di 12 ore o due volte 1 settimana di distanza. La SEM richiede molto lavoro e può essere costosa, a seconda della disponibilità del microscopio e dei costi di servizio. Preparare l'intera vescica per SEM fornisce materiale abbondante per l'analisi, ma lo svantaggio è che l'analisi di ciascuna vescica può richiedere molto tempo. Pertanto, è probabile che solo un numero limitato di vesciche possa essere analizzato da SEM rispetto al numero di animali più elevato utilizzato per i titoli di urina e tessuti. Inoltre, ottenere immagini di alta qualità delle superfici curve delle "tazze" della vescica richiede abilità a causa delle ombre che possono impedire la visibilità. Sebbene la SEM della vescica sia uno strumento utile per visualizzare l'esfoliazione uroteliale, questo metodo è in gran parte qualitativo. Poiché il campione è fissato in una forma rotonda e a causa dell'uso di glutaraldeide nel fissativo, lo screening per i batteri che esprimono fluorescentemente tramite microscopia ottica non è possibile. L'immunocolorazione e i coloranti chimici sono incompatibili con questo processo a causa dell'uso di glutaraldeide che reticola la maggior parte degli antigeni e dell'osmio e che maschera i siti dell'antigene e scurisce il tessuto. Detto questo, la tecnica SEM è utile per parametri che possono essere valutati quantitativamente senza l'uso di sonde aggiuntive, come la dimensione della cella48,49.
Questo modello offre diversi vantaggi oltre ai metodi descritti in precedenza. Permette l'esame dei meccanismi di UPEC rUTI causati dall'emergenza dai serbatoi della vescica, al contrario della reintroduzione nella vescica da una fonte esterna. Altri modelli di rUTI dovuti all'emergenza dai serbatoi della vescica utilizzano agenti chimici (protamina solfato o chitosano) per causare l'esfoliazione uroteliale17,18, che non sarebbe innesco di rUTI nelle donne. G. vaginalis è un batterio urogenitale prevalente che è stato rilevato nelle urine raccolte direttamente dalla vescica tramite cateterizzazione o aspirazione sovrapubica in alcune donne23,26. Questo fatto, insieme alla nota associazione tra BV (in cui G. vaginalis cresce troppo nella vagina) e UTI, suggerisce che G. vaginalis è un trigger clinicamente plausibile di rUTI. Infine, il metodo di fissazione della vescica in situ preserva l'ultrastruttura della vescica e limita i danni, assicurando che gli strati della vescica non si separino l'uno dall'altro. I metodi precedenti per visualizzare l'urotelio tradizionalmente hanno l'utente che raccoglie, taglia in due, allunga e fissa la vescica su un vassoio di dissezione prima di immergere la vescica tesa in fissativo48. Questo metodo si traduce in un campione molto piatto ma non garantisce uno stiramento uniforme o naturale del tessuto e può provocare aree che sono sopra e sotto tese (con conseguente tessuto altamente rugoso) e può causare la separazione dello strato della vescica. Inoltre, queste manipolazioni fisiche della vescica per allungare e bloccare il tessuto possono causare danni, tra cui l'esfoliazione uroteliale. Un altro metodo è quello di immergere le vesciche intatte in fissativo prima di incorporarle nella paraffina e acquisire sezioni sottili con un microtomo. Le sezioni sottili sono preziose per gli esperimenti di immunoistochimica per esaminare la localizzazione dei batteri e delle proteine dell'ospite, ma una sezione sottile non consente la visualizzazione della superficie uroteliale. Questo metodo SEM consente di esaminare contemporaneamente la superficie dell'intera vescica.
Come descritto, le applicazioni future di questo modello includono il test di altri ceppi UPEC per determinare se formano serbatoi intracellulari e il test di altri ceppi di G. vaginalis per valutare se provocano l'esfoliazione e l'emergenza UPEC per causare rUTI. Altri ceppi di topo oltre ai topi C57BL / 6 possono anche essere testati, anche se i topi con un'alta propensione allo sviluppo di cistite cronica (come i topi sullo sfondo C3H) non sono raccomandati, poiché troppi topi dovrebbero essere eliminati dall'esperimento. Un ulteriore vantaggio dei topi C57BL/6 è che molti ceppi genetici knockout sono disponibili in commercio. Tali ceppi offrono l'opportunità di interrogare i fattori ospiti coinvolti nella formazione e/o nell'emergenza del serbatoio.

Le infezioni del tratto urinario (UTI) impongono un onere sanitario significativo in tutto il mondo, influenzando la qualità della vita di milioni di persone ogni anno, in particolare le donne1. L'Escherichia coli uropatogeno (UPEC) è la causa più frequente di UTI1. Molti pazienti (circa il 20-30%) che sviluppano UTI sperimenteranno una UTI ricorrente (rUTI) entro 6 mesi nonostante la clearance mediata da antibiotici dell'infezione iniziale2. Sfortunatamente, ben il 5% delle donne in premenopausa soffre di 3 o più rUTI ogni anno 3,4. Gli episodi sequenziali di rUTI possono essere causati dalla persistenza dello stesso ceppo UPEC dal caso indice 5,6,7,8. I dati provenienti da campioni umani e modelli murini suggeriscono che la rUTI dello stesso ceppo potrebbe essere causata da UPEC che risiede all'interno di serbatoi quiescenti nella vescica. Nell'uomo, UPEC è stato rilevato in cellule epiteliali e biopsie della vescica di pazienti con UTI 9,10,11,12,13. Studi su topi C57BL/6 hanno dimostrato che alcuni ceppi di UPEC possono stabilire serbatoi intracellulari quiescenti nella vescica, come rilevato dalla microscopia a fluorescenza e dall'omogeneizzazione e coltura del tessuto vescicale, che vengono mantenuti per mesi dopo la risoluzione della batteriuria 14,15,16. Il trattamento della vescica con agenti che inducono l'esfoliazione dell'epitelio vescicale (urotelio), ad esempio protamina solfato17 o chitosano18, innescano la comparsa di UPEC dai serbatoi per causare rUTI. Questi dati suggeriscono che nelle donne che ospitano serbatoi UPEC della vescica da una precedente infezione, le esposizioni della vescica che portano all'esfoliazione uroteliale possono innescare rUTI.
Ci sono prove crescenti che il microbiota vaginale contribuisce all'infezione del tratto urinario19,20. Gardnerella vaginalis è un membro frequente del microbiota vaginale e urinario 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Nella vagina, la presenza di alti livelli di G. vaginalis è associata a una disbiosi microbica nota come vaginosi batterica (BV), che colpisce ~ 30% delle donne 30,31,32. Le donne con BV sono a più alto rischio di sperimentare UTI rispetto alle donne con una comunità vaginale dominata da Lactobacillus 33,34,35,36,37. Nei modelli murini, G. vaginalis provoca esfoliazione epiteliale sia nella vagina38 che nella vescica39. Nei topi C57BL/6 che ospitano serbatoi della vescica UPEC, due esposizioni sequenziali della vescica a G. vaginalis - ma non a PBS - provocano il riemergere di UPEC dai serbatoi per causare UPEC rUTI. L'emergere è evidenziato dalla comparsa di titoli UPEC nelle urine di topi che avevano precedentemente risolto la batteriuria UPEC e una successiva diminuzione dei titoli di omogeneizzati della vescica UPEC al sacrificio rispetto agli animali di controllo esposti a PBS39. È interessante notare che non esiste una colonizzazione duratura da parte di G. vaginalis nella vescica. Nella stragrande maggioranza dei casi, due brevi esposizioni, ciascuna con meno di 12 (h) di G. vaginalis vitale nelle urine, sono sufficienti per provocare l'esfoliazione uroteliale e promuovere la rUTI.
Questo protocollo descrive un modello murino di rUTI causato da UPEC che risiede nei serbatoi della vescica intracellulare, utilizzando l'inoculazione della vescica di G. vaginalis per innescare la recidiva. Il progresso ottenuto da questo modello è che G. vaginalis è un trigger biologico clinicamente rilevante di rUTI rispetto agli agenti chimici precedentemente utilizzati. Inoltre, la sopravvivenza relativamente breve di G. vaginalis nel tratto urinario del topo consente di esaminare l'impatto delle esposizioni microbiche transitorie sull'urotelio, come potrebbe verificarsi dopo l'attività sessuale. Oltre a delineare il modello rUTI, questo protocollo descrive anche i metodi per la citologia delle urine e la fissazione della vescica in situ e l'imaging dell'urotelio mediante microscopia elettronica a scansione (SEM).
Questo protocollo di UPEC UTI ricorrente indotto da G. vaginalis utilizza il ceppo UPEC UTI89 con una cassetta di resistenza alla kanamicina (UTI89kanR)40. Non tutti i ceppi di UPEC testati sono stati in grado di formare comunità batteriche intracellulari durante la fase di infezione acuta nei topi41 e non è ancora noto se tutti i ceppi di UPEC abbiano la capacità di formare serbatoi intracellulari latenti. La formazione del serbatoio deve essere confermata prima dell'uso di altri ceppi UPEC nel modello. Questo protocollo utilizza un isolato spontaneo di G. vaginalis resistente alla streptomicina, JCP8151BSmR38. L'induzione di rUTI da parte di JCP8151BSmR richiede due inoculazioni sequenziali di G. vaginalis , date 12 ore o 7 giorni (d) a parte39. Se altri ceppi di G. vaginalis inducano o meno esfoliazione e/o UPEC rUTI rimane da determinare con questo modello. È essenziale utilizzare ceppi UPEC e G. vaginalis con resistenza agli antibiotici nota (come kanamicina o spectinomicina per UPEC e streptomicina per G. vaginalis) perché gli antibiotici possono essere aggiunti alle piastre di agar per prevenire la crescita del microbiota endogeno di topo che potrebbe altrimenti interferire con l'enumerazione delle unità formanti colonie (CFU) per monitorare l'infezione. Questo è particolarmente importante per la coltura di campioni di urina, perché l'urina di topo contiene spesso altri batteri che possono crescere troppo su piastre di coltura senza antibiotici. L'origine di questi batteri endogeni nelle urine dei topi è sconosciuta, ma probabilmente riflette i batteri periuretrali e urogenitali raccolti durante la raccolta delle urine.
G. vaginalis è un batterio anaerobico facoltativo e, pertanto, questo protocollo descrive la crescita di G. vaginalis JCP8151BSmR in una camera anaerobica. Se non è disponibile una camera anaerobica, è possibile utilizzare altri metodi per mantenere le condizioni di crescita anaerobica (come una sacca GasPak in un contenitore ermetico). In alternativa, alcuni ceppi di G. vaginalis (tra cui JCP8151BSmR) cresceranno in un incubatore standard di coltura tissutale (5% CO2). Proprio come l'uso di ceppi di G. vaginalis diversi da JCP8151BSmR richiede test per garantire che i batteri si comportino in modo simile in questo modello, il cambiamento delle condizioni di crescita richiede la determinazione empirica delle durate ideali per la coltura (su piastre e in liquido) e la densità ottica (OD) 600 equivalenti per ottenere le concentrazioni di inoculo vitali desiderate. Inoltre, non è noto se le condizioni di crescita influenzino la patobiologia di G. vaginalis.
Infine, quando si considera se utilizzare questo modello, i ricercatori dovrebbero essere consapevoli del fatto che può richiedere un numero maggiore di animali per gruppo rispetto ai tipici modelli murini UTI. Ciò è in parte dovuto al fatto che l'induzione di rUTI richiede che i topi risolvano la batteriuria UPEC causata dall'infezione iniziale della vescica. Pertanto, qualsiasi topo che non riesce a eliminare la batteriuria (un fenotipo solitamente indicativo di infezione renale in corso) non è incluso nella fase rUTI del protocollo. Il numero di topi necessari per alimentare questi studi è anche influenzato dal tasso di emergenza "spontanea" di UPEC nelle urine (12-14% in media). Infine, diversi ceppi di topo hanno diverse propensioni allo sviluppo di batteriuria cronica rispetto alla formazione di serbatoi intracellulari42,43. Se si utilizzano ceppi di topo diversi da C57BL/6 in questo modello, deve essere confermato che gli animali sviluppano serbatoi intracellulari UPEC quiescenti.

<table><tbody><tr><td>30G x 1/2 aghi</td><td>BD</td><td>305106</td><td>per cateteri</td></tr><tr><td>5 1/2" pinza diritta emostatica</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ fissazione della vescica</td></tr><tr><td>ACE 600 Sputter coater</td><td>Leica</td><td>SEM lavorazione del campione</td>alluminio <td></td></tr><tr><td>SEM tronchetto</td><td>Ted Pella</td><td>16111</td><td>Elaborazione del campione SEM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ linguetta</td></tr><tr><td>adesiva conduttiva in carbonio</td> per fissaggio della vescica&nbsp;<td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>Elaborazione di campioni SEM</td></tr><tr><td>Vernice conduttiva all'argento</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>Elaborazione di campioni SEM</td></tr><tr><td>CPD 300 Essiccatore per punti critici Essiccatore per punti critici</td><td>Leica</td><td></td><td>SEM</td></tr><tr><td>Clip metallica Cytofunnel Simport</td><td>M964B</td><td>Analisi delle urine con citofilato</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>Elaborazione di campioni SEM</td></tr><tr><td>Glucosio e nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>per NYCIII G. vaginalis terreno di crescita</td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ fissazione della vescica</td></tr><tr><td>Kit di colorazione Hema 3 Fisher</td><td></td><td>23123869</td><td>analisi delle urine con citospine</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>per NYCIII G. vaginalis terreni di crescita</td></tr><tr><td>iridio</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>Elaborazione del campione SEM</td></tr><tr><td>isofluorane</td><td></td><td></td><td>anestesia del topo</td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>aggiungere alle piastre selettive UPEC LB (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani agar</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>UPEC</td></tr><tr><td>Luria-Bertani brodo</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>terreni di crescita UPEC</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Zeiss</td><td></td><td>microscopio elettronico a scansione</td></tr><tr><td>Milli-Q Depuratore d'acqua</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>Elaborazione dei campioni SEM</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>per NYCIII G. vaginalis terreni di crescita</td></tr><tr><td>Microscopio Olympus Vanox AHBT3</td> Analisi delle urine <td>Olympus</td><td></td><td>cytospun</td></tr><tr><td>tetrossido di osmio</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>Elaborazione dei campioni SEM</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ fissazione della vescica</td></tr><tr><td>tubo in polietilene</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>per cateteri</td></tr><tr><td>Proteose Peptone #3&nbsp;</td><td>Pescatore</td><td>DF-122-17-4</td><td>per NYCIII G. vaginalis terreni</td></tr> di <tr><td>crescita Lama di rasoio a doppio taglio rivestita in PTFE</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>vesciche di taglio per SEM</td></tr><tr><td>Shandon Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>analisi delle urine con citofilato</td></tr><tr><td>Shandon filtro Shandon</td><td>M965FWDV</td><td>analisi delle urine con citofilato</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Doppio citoimbuto Simport</td><td></td><td>M964-1D</td><td>analisi delle urine con citospine</td></tr><tr><td>Shandon doppi vetrini (rivestiti)</td>Analisi <td>delle urine con citospine</td> <td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>5991055 cacodilato di sodio triidrato</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ spettrofotometro per la fissazione della vescica</td></tr><tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td> che misura la streptomicina <td>batterica OD600</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>aggiungere a G. vaginalis Piastre selettive NYCIII (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>tubercolina siringa con punta scorrevole</td><td>BD</td><td>309659</td><td>per cateteri</td></tr><tr><td>Estratto di lievito&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>per NYCIII G. vaginalis terreni di crescita</td></tr></tbody></table>

infezione ricorrente del tratto urinario da escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di gardnerella vaginalis nei topi

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Le infezioni ricorrenti del tratto urinario (rUTI) causate da Escherichia coli uropatogeno (UPEC) sono comuni e costose. Articoli precedenti che descrivono modelli di UTI in topi maschi e femmine hanno illustrato le procedure per l'inoculazione batterica e l'enumerazione nelle urine e nei tessuti. Durante un'infezione iniziale della vescica nei topi C57BL/6, l'UPEC stabilisce serbatoi latenti all'interno delle cellule epiteliali della vescica che persistono dopo la clearance della batteriuria UPEC. Questo modello si basa su questi studi per esaminare rUTI causata dall'emergere di UPEC dall'interno di serbatoi vescicali latenti. Il batterio urogenitale Gardnerella vaginalis è usato come innesco della rUTI in questo modello perché è frequentemente presente nei tratti urogenitali delle donne, specialmente nel contesto della disbiosi vaginale che è stata associata a UTI. Inoltre, viene descritto anche un metodo per la fissazione della vescica in situ seguito dall'analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) del tessuto vescicale, con potenziale applicazione ad altri studi che coinvolgono la vescica.

Dopo l'inoculazione, i titoli UPEC sono rilevabili nelle urine (Figura 2B). La mancata placcatura di campioni di urina su mezzi selettivi contenenti kanamicina comporterà probabilmente una crescita eccessiva del microbiota endogeno di topo che contamina l'urina. Il livello di batteriuria UPEC sarà probabilmente elevato il giorno 1 e potrebbe aumentare durante la prima settimana prima di diminuire in momenti successivi (Figura 2C). Circa il 65-80% dei topi non avrà UPEC rilevabile nelle urine di 28 dpi (Figura 2C, cerchio verde). Questi topi possono essere utilizzati nelle fasi successive del modello. I topi che rimangono batteriurici (Figura 2C, ellisse rossa) dovrebbero essere eliminati dall'esperimento.
Due esposizioni sequenziali a G. vaginalis somministrate a 12 ore (Figura 3A) o 1 settimana di distanza (Figura 3B) provocano l'emergere di UPEC dai serbatoi intracellulari per causare batteriuria ricorrente. Sia il livello di batteriuria UPEC (test di Mann-Whitney) che la frazione di topi che mostrano UPEC rUTI (test esatto di Fisher) sono significativamente più alti nei topi esposti a G. vaginalis rispetto al gruppo di controllo PBS. L'analisi citologica delle urine rileva PMN nelle urine di topi esposti a G. vaginalis che hanno mostrato l'emergenza UPEC (Figura 3C). Nel modello con due esposizioni date a 1 settimana di distanza, i titoli UPEC nel tessuto vescicale sono più bassi nei topi esposti a G. vaginalis rispetto a PBS (Figura 3D), presumibilmente a causa dell'emergere di UPEC dai serbatoi e della successiva clearance.
La visualizzazione del tessuto vescicale fissato in situ da parte di SEM rivela grandi cellule uroteliali superficiali ombrello che rivestono la superficie della vescica in topi di controllo esposti solo a PBS (Figura 4A). L'esfoliazione uroteliale è evidenziata da una perdita di cellule ombrello superficiali, che rivelano cellule epiteliali transizionali sottostanti più piccole nei topi esposti a G. vaginalis (Figura 4B). All'inizio dopo l'inoculazione UPEC durante la creazione di serbatoi intracellulari, gli UPEC sono visibili sull'urotelio e filamentano dalle cellule esfolianti (Figura 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figura 2. Monitoraggio dei titoli UPEC nelle urine durante la fase 1 (formazione del serbatoio). (A) Schema della placcatura delle unità formanti colonie (CFU). (B) Immagine rappresentativa dei titoli UPEC nelle urine su LB+kanamicina. I cerchi neri indicano macchie di campioni di urina che devono essere contate per calcolare CFU / mL. (C) Decorso temporale della batteriuria UPEC nei topi C57BL/6. Ogni linea rappresenta un singolo topo, tracciando i titoli delle urine UPEC nel tempo. La linea tratteggiata indica il limite di rilevazione (1000 CFU/mL). L'ellisse rossa indica quattro topi (su 20) che non sono riusciti a risolvere la batteriuria UPEC e quindi non sarebbero stati utilizzati per il modello rUTI indotto da G. vaginalis. Al contrario, il cerchio verde indica topi che hanno risolto la batteriuria UPEC e proceduto alle fasi successive. (D) Tabella dei dati utilizzati per generare il grafico nel pannello C. Giallo, CFU rilevabile; verde, senza CFU. (E) Randomizzazione dei topi in gruppi di esposizione in base al punto temporale in cui i CFU UPEC non sono più stati rilevati nelle urine ("Day resolved"). I numeri del mouse nella colonna di sinistra del pannello D sono gli stessi numeri del mouse indicati nel pannello E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figura 3. G. vaginalis innesca UPEC rUTI. Titoli UPEC nelle urine a seguito di due esposizioni sequenziali del tratto urinario a PBS (cerchi) o G. vaginalis (Gvag; quadrati) somministrati a 12 ore (A) o 1 settimana (B) di distanza. Ogni simbolo rappresenta un singolo mouse. Viene tracciato il CFU/mL UPEC più alto rilevato da ciascun topo tra 1-3 d dopo la seconda esposizione. I topi senza batteriuria rilevabile sono tracciati al limite di rilevamento (linea tratteggiata). (C) Analisi citologica delle urine che mostra cellule UPEC (punte di freccia) e polimorfonucleate (PMN) (frecce). Barra della scala = 20 μm. (D) Titoli UPEC nei tessuti della vescica raccolti 3 d a seguito di due esposizioni sequenziali del tratto urinario somministrate a 1 settimana di distanza. Ogni simbolo rappresenta un mouse diverso e gli zeri sono tracciati al limite del rilevamento (linea tratteggiata). In A, B e D, le caselle sono al primo e al terzo quartile con la mediana marcata e baffi da min a max. Test U di Mann-Whitney * P &lt; 0,05; ** P &lt; 0,01; P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figura 4. Analisi SEM di vesciche fissate in situ. Le vesciche sono state raccolte dai topi 3 ore dopo due esposizioni (a 12 ore di distanza) a PBS (A) o G. vaginalis (C). Le linee tratteggiate illustrano una singola cellula epiteliale urinaria, che è più piccola nelle vesciche esposte a G. vaginalis perché le grandi cellule superficiali hanno esfoliato rivelando l'epitelio transizionale sottostante. (B) Vescica raccolta 6 ore dopo l'inoculazione iniziale con UPEC, durante la Fase 1 del modello, mostrando esfoliazione uroteliale e UPEC extracellulare. (D) Esempio di goccioline di grasso insolubili presenti sulla superficie della vescica. Le barre della scala sono 20 μm nelle immagini principali e 2 μm nell'inserto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l'enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l'elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Le infezioni ricorrenti del tratto urinario sono un serio problema di salute. Questo protocollo ci aiuterà a capire come le esposizioni di breve durata ai batteri urogenitali provocano danni alla vescica e innescano infezioni delle vie urinarie ricorrenti di E.Coli. Un vantaggio di questo modello è che l'esfoliazione della vescica e le infezioni delle vie urinarie ricorrenti sono innescate dal batterio urogenitale Gardnerella vaginalis, che è spesso abbondante nelle donne che soffrono di infezioni delle vie urinarie ricorrenti.Inizia facendo scorrere il ceppo G.vaginalis da un congelatore a meno 80 gradi Celsius in una camera anaerobica. Strisciare i batteri su una piastra NYCIII senza antibiotici. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in modo anaerobico per 24 ore.Nella camera anaerobica, inoculare cinque millilitri di terreno anaerobico NYCIII con un loop da un microlitro pieno di cellule dalla piastra NYCIII e incubare la coltura staticamente a 37 gradi Celsius in condizioni anaerobiche per 18 ore. Non includere antibiotici nel terreno di coltura. Determinare l'OD600 della coltura utilizzando uno spettrofotometro.Quindi, centrifugarlo a 9, 600 volte G per un minuto e aspirare il fluido. Risospendere il pellet batterico in PBS alla concentrazione desiderata e diluire in serie e impiattare l'inoculo. Aggiungere 10 microlitri di urina a 90 microlitri di PBS in una cassetta citoimbuto con un filtro collegato.Posizionare le cassette nella citocentrifuga con un vetrino e farle girare a 600-800 volte G per sei minuti con alta accelerazione. Dopo aver rimosso i vetrini e averli lasciati asciugare durante la notte, colorare i vetrini con un kit di colorazione ematologica e analizzarli al microscopio ottico per la presenza di PMN e cellule epiteliali. Una volta la siringa a punta scorrevole con fissativo, fissare un catetere all'estremità, smussato rivolto di fronte ai segni della siringa.Tagliare il tubo in eccesso a uno o due millimetri dall'estremità dell'ago, facendo attenzione a non esporre la punta dell'ago. Muovi la siringa per rimuovere le bolle e spingi lo stantuffo per far uscire l'aria. Quindi riempire il catetere con il fissativo su una provetta da microcentrifuga Dopo aver anestetizzato e sacrificato il topo, una volta fissate le gambe, aprire l'area pelvica del topo con una pinza e un paio di forbici chirurgiche per esporre la vescica.Spingere con cautela da parte il grasso adiacente, ma lasciare la vescica in posizione. Tenere la siringa con la mano dominante con l'ago rivolto verso il basso. Immergere la punta del catetere in un lubrificante sterile e posizionare la punta del catetere in corrispondenza dell'apertura uretrale, tenendo il cilindro della siringa a un angolo di 30-45 gradi sopra il corpo del topo.Applicare una pressione verso il basso con un leggero movimento in senso orario e inserire delicatamente il catetere nell'uretra Quando la punta del catetere entra, incernierare la siringa verso la coda del topo continuando a far scorrere ulteriormente il catetere nell'uretra fino a quando il cilindro della siringa non è parallelo alla superficie di lavoro. L'intero stelo dell'ago del catetere deve entrare nel topo, posizionando la punta del catetere all'interno del lume della vescica. Erogare lentamente da 50 a 80 microlitri di fissativo, facendo gonfiare la vescica come un palloncino.Tenere il catetere in posizione e sollevare leggermente la siringa, inclinando la punta verso l'alto. Con l'altra mano, aprire un emostatico e far scorrere un polo sotto l'ago del catetere all'intersezione dell'uretra. Chiudere parzialmente l'emostatico fino a quando non entra in contatto con l'ago.Far scorrere delicatamente l'ago del catetere fuori dalla vescica e contemporaneamente serrare e bloccare completamente l'emostatico per evitare la perdita del fissativo. Afferrare l'emostatico in modo che sia parallelo alla superficie di lavoro con la camera d'aria appoggiata sopra. Sollevare delicatamente e tagliare con cura sotto l'emostatico per rimuovere la vescica con l'emostatico ancora attaccato.Posizionare la vescica e l'emostatico attaccato in un tubo Falcon contenente fissativo riscaldato. Assicurarsi che la camera d'aria sia completamente immersa nel fluido e non premuta contro le pareti del tubo. Per visualizzare la vescica mediante microscopia elettronica a scansione, bifilare sagittalmente con una lama di rasoio o un bisturi puliti a doppia faccia e fare un secondo taglio tangenziale all'emostatico per rilasciare la vescica.Ciò si traduce in due coppette a mezza vescica. Se sono presenti cuscinetti adiposi rimanenti all'esterno della vescica, rimuoverli delicatamente. Sciacquare le metà della vescica tre volte in tampone di cacodilato di sodio.Colorare il tessuto con tetrossido di osmio all'1% in tampone di cacodilato 0,15 molari per un'ora a temperatura ambiente. Eseguire questo passaggio con il recipiente di colorazione avvolto in un foglio per mantenere un ambiente buio. Dopo la colorazione, sciacquare tre volte le metà della vescica in acqua ultrapura.Se si nota olio osmico sulla superficie dell'acqua, aspirarlo o asportarlo per evitare contaminazioni durante le fasi di asciugatura. Dopo aver disidratato il tessuto, bisesct le metà della vescica con un rasoio pulito a doppia faccia per generare quattro pezzi totali. Dopo l'inoculazione, i titoli UPEC sono rilevabili nelle urine.Il livello di batteriuria UPEC è elevato il primo giorno e può aumentare durante la prima settimana prima di diminuire in momenti successivi. Circa il 65-80% dei topi non avrà UPEC rilevabile nelle urine entro 28 giorni dall'inoculazione. Questi mouse possono essere utilizzati nelle fasi successive del modello.I topi che rimangono batteriurici dovrebbero essere eliminati dall'esperimento. Due esposizioni sequenziali a G. vaginalis, somministrate a distanza di 12 ore o una settimana l'una dall'altra, provocano l'emergere di UPEC dai serbatoi intracellulari per causare batteriuria ricorrente. L'analisi citologica delle urine può essere utilizzata per rilevare le cellule polimorfonucleate nelle urine di topi esposti a G.Vaginalis con comparsa di UPEC.Nel modello con due esposizioni somministrate a distanza di una settimana, i titoli di UPEC nel tessuto vescicale sono più bassi nei topi esposti a G. vaginalis rispetto alla PBS, presumibilmente a causa dell'emergere di UPEC dai serbatoi e della successiva eliminazione. La visualizzazione del tessuto vescicale fisso in situ mediante SEM rivela grandi cellule uroteliali a ombrello superficiale che rivestono la superficie della vescica nei topi di controllo esposti solo alla PBS. L'esfoliazione uroteliale è evidenziata da una perdita di cellule ombrello superficiali, rivelando un epitelio di transizione sottostante più piccolo nei topi esposti a G. vaginalis.Subito dopo l'inoculazione dell'UPEC, durante la creazione di serbatoi intracellulari, le cellule batteriche sono visibili sull'urotelio e si filamentano fuori dalle cellule esfolianti. I metodi qui descritti aprono la strada a studi futuri per indagare l'effetto di ulteriori ceppi di Gardnerella o di altre specie urogenitali su E.coli rUTI.

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Questo video dimostra metodi per indurre transurethrally infezioni del tratto urinario del mouse e quantificare l'entità delle infezioni che ne derivano.

Induzione transuretrale di infezioni del tratto urinario mouse

Fonte: O'Brien, V. P., et. al., Infezione urinaria ricorrente da Escherichia coli scatenata dall'esposizione alla vescica vaginale a Gardnerella vaginalis nei topi. J. Vis. Esp. (2020)Questo video dimostra l'uso della microscopia elettronica a scansione per visualizzare la colonizzazione batterica e le interazioni ospite-patogeno nell'epitelio vescicale, in un modello murino pre-infetto.

Preparazione del tessuto della vescica del topo per la visualizzazione di infezioni batteriche

Fonte: O'Brien, V.P. et al. Infezione urinaria ricorrente da Escherichia coli scatenata dall'esposizione alla vescica a Gardnerella vaginalis nei topi. J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra la preparazione di un inoculo di Gardnerella vaginalis per stabilire un modello murino di infezione urinaria ricorrente.

Preparazione dell'inoculo di Gardnerella vaginalis per modellare infezioni urinarie ricorrenti nei topi

Fonte: Conover, M. S., et al., J. Stabilimento e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino. J. Vis. Esp. (2015)Questo video mostra la procedura per assemblare e impiantare un catetere transuretrale in una topolina, seguita da un'inoculazione batterica per stabilire infezioni urinarie associate al catetere e indagare le interazioni ospite-patogeno mediate dal biofilm.

Infezione delle vie urinarie associata al catetere in un modello murino

Fonte: Conover, M. S. et al., Stabilimento e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino. J. Vis. Esp. (2015)Questo video dimostra la rilevazione di comunità batteriche intracellulari (IBC) nel tessuto vescicale-muro infettato da Escherichia coli che esprime β-galactosidasi. Dopo fissazione tissutale, permeabilizzazione e colorazione con X-gal, gli IBC appaiono come punti blu sotto un microscopio dissezionale, confermando l'invasione batterica durante un'infezione delle vie urinarie.

Visualizzazione delle comunità batteriche intracellulari in una vescica di topo infetta

In questo video, descriviamo la tecnica per la somministrazione intravescicale di batteri uropatogeni per generare un modello di infezione del tratto urinario nei topi. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la diffusione dell'infezione batterica uropatogena all'interno del sistema urinario e i meccanismi che determinano la suscettibilità alle infezioni delle vie urinarie.

Generazione di un modello di infezione del tratto urinario: una tecnica per somministrare batteri uropatogeni nel topo per sviluppare un modello di infezione del tratto urinario

Questo video dimostra l'instaurazione di un'infezione uropatogena da Escherichia coli in una vescica di topo femmina attraverso l'instillazione di catetere transuretrale. I batteri iniettati stabiliscono con successo un'infezione del tratto urinario all'interno della vescica, fornendo una preziosa piattaforma per lo studio delle malattie associate all'assistenza sanitaria correlate al tratto urinario.

Cateterismo transuretrale e inoculazione batterica per generare un modello di infezione del tratto urinario nei topi maschi

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Il parto pretermine (parto &lt; 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

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Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dallesposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi (Video) | JoVE Journal

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

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