Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

Ciao, e benvenuti all'architettura di laboratorio e alla reattività dell'RNA presso l'Istituto di Biologia Molecolare e Cellulare di Strasburgo. Coltivare cristalli ben defrattari è un passo fondamentale in qualsiasi studio cristallografico. In questo video, dimostreremo l'uso di un nuovo strumento microfluidico per coltivare cristalli di una biomolecola e determinarne la struttura 3D mediante diffrazione dei raggi X in situ.

Il dispositivo microfluidico chiamato ChipX presenta diversi vantaggi. È progettato per miniaturizzare e facilitare le risorse di cristallizzazione con il metodo della contro-diffusione. La sua configurazione è facile ed eseguita con materiale di laboratorio standard.

È anche ottimizzato per la caratterizzazione diretta dei cristalli coltivati nel chip dalla cristallografia seriale a raggi X. ChipX elimina la movimentazione dei cristalli e le fasi di crioraffreddamento e preserva la qualità intrinseca dei cristalli che vengono analizzati in situ e a temperatura ambiente. ChipX ha il formato di uno scivolo al microscopio, 7,5 per 2,5 centimetri.

Contiene otto canali microfluidici utilizzati come camere di cristallizzazione con una sezione di 80 per 18 micrometri e una lunghezza di quattro centimetri. L'ingresso sul lato sinistro consente l'iniezione manuale della soluzione di biomolecola che riempirà gli otto canali fino ai serbatoi. Le soluzioni di cristallizzazione si depositano in questi serbatoi sul lato destro.

La cristallizzazione è innescata da un fenomeno chiamato contro diffusione. Quando l'agente cristallizzante si diffonde nella soluzione di biomolecola e crea una concentrazione e un gradiente di super saturazione. Etichette e bost lungo i canali aiutano a localizzare i cristalli più facilmente.

La configurazione di un chip richiede da cinque a sei microlitri di soluzione di biomolecola ad una concentrazione tipica da cinque a 10 milligrammi per millilitro. Un olio di paraffina in microlitri, cinque microlitri di soluzione di cristallizzazione per serbatoio e nastro adesivo. Il caricamento di ChipX viene eseguito manualmente con una micropipetta e punte standard.

In questo esempio viene utilizzata una soluzione campione blu per una migliore visualizzazione del processo di iniezione. Per evitare perdite, la punta viene inserita nell'ingresso del campione perpendicolarmente al chip. Un microlitro di olio di paraffina viene caricato dopo il campione per separare i canali l'uno dall'altro.

L'ingresso del campione viene quindi sigillato con nastro adesivo. Gli otto serbatoi vengono caricati singolarmente con cinque microlitri di soluzione di agente cristallizzante. Per fare ciò, la punta della pipetta viene posizionata vicino all'estremità del canale con un angolo di circa 45 gradi.

Ciò impedisce la formazione di una bolla d'aria tra il campione e l'agente cristallizzante. I serbatoi possono essere riempiti con cocktail contenenti vari tamponi, polimeri o sali, eccetera, per lo screening o l'ottimizzazione. I serbatoi sono sigillati con nastro adesivo.

Come dimostrato qui, la configurazione di un chip è facile e richiede solo pochi minuti. In ChipX, la cristallizzazione avviene per controdazione. Gli agenti cristallizzanti depositati nei serbatoi si diffondono nei canali contenenti la biomolecola.

Ciò crea gradienti di concentrazione e di super saturazione che attiveranno la cristallizzazione. Questi sono esempi di cristalli di un enzima ottenuti all'interno dei canali. Possono crescere per riempire i canali che hanno una sezione trasversale di 80 per 80 micrometri.

I cristalli sono facilmente rilevabili in ChipX mediante microscopia a fluorescenza utilizzando la fluorescenza naturale dei residui di triptofano sotto la luce UV, o come mostrato qui usando una proteina etichettata fluorescentmente. Questa sezione mostra un'analisi telegrafica Chris eseguita presso la sorgente luminosa svizzera nelle filaggrins Svizzera. I trucioli possono essere trasportati al sincrotrone senza alcuna attrezzatura aggiuntiva o cura speciale.

Entriamo nella sala della sorgente luminosa svizzera. Gli elettroni circolano nell'anello centrale e generano un ampio spettro di onde elettromagnetiche, compresi i raggi X sfruttati a diverse linee di fascio. Questo video è stato registrato a X06, che è una linea di fascio dedicata alla cristallografia macro-molecolare.

Il protocollo può passare da una struttura di sincrotrone all'altra, ma il principio generale rimane lo stesso. ChipX è montato su un supporto stampato in 3D. Questo supporto viene quindi attaccato al magnete di un goniometro standard.

L'analisi seriale coerente raccolta dati da una serie di cristalli coltivati nel chip. Gli elenchi di posizioni di cristallo sono stabiliti utilizzando le etichette e il bost lungo i canali del chip. I ricercatori spostano il chip per centrare i cristalli nel fascio di raggi X simboleggiato dalla finestra gialla.

Viene avviata una procedura di centramento rapido utilizzando il fascio di raggi X. L'arresto del fascio sale in posizione e il rilevatore si sposta verso il campione. Lo screening della griglia viene eseguito per garantire che il cristallo sia allineato con il fascio.

La stessa procedura viene ripetuta dopo aver ruotato il truciolo di 30 gradi. Il secondo passo è importante perché il materiale del chip crea un effetto parallasse che porta ad uno spostamento della diffrazione massima rispetto alla posizione cristallina osservata. Non appena il cristallo è centrato nel fascio inizia la raccolta dei dati.

Questa sequenza mostra la raccolta dei dati in tempo reale. Il chip ruota di 30 gradi. Nel frattempo, le corrispondenti immagini di diffrazione vengono raccolte dal rilevatore.

La caratterizzazione di questo cristallo è completa. Il chip tradotto nel cristallo successivo nel canale e l'intera procedura viene ripetuta. Si noti che questa analisi viene effettuata in situ senza manipolazione diretta del cristallo e a temperatura ambiente.

I dati raccolti su una serie di cristalli vengono quindi uniti per ottenere un set di dati di diffrazione completo che viene utilizzato per calcolare una mappa di densità elettronica, mostrata in blu, e per costruire il modello atomico. La procedura descritta in questo video è stata applicata nel fotogramma della caratterizzazione strutturale dell'enzima di modifica del tRNA. L'enzima che aggiunge cca dal batterio adattato a freddo, Planococcus halocryophilus.

ChipX è stato usato per cristallizzare l'enzima contro-diffusione in presenza di solfuro di ammonio come agente cristallizzante. Cristalli by-piramidali apparvero lungo i canali, dopo alcuni giorni di incubazione a 20 gradi Celsius. L'etichettatura fluorescente della proteina ha facilitato l'identificazione dei cristalli proteici e la loro discriminazione dai cristalli di sale.

Una serie di cristalli è stata analizzata in situ e a temperatura ambiente. I loro dati di diffrazione furono fusi e portarono alla struttura cristallina dell'enzima APOE ad una risoluzione di 2,5 angstrom. Inoltre, la diffusione dell'ambiente nei canali dei chip è stata sfruttata per fornire un substrato all'enzima che costruisce i cristalli.

Nel caso di specie, un analogo CTP è stato aggiunto alle soluzioni del serbatoio due giorni prima dell'analisi del sincrotrone. Ciò ha permesso al composto di diffondersi e raggiungere il sito catalitico dell'enzima. Come si vede nella struttura cristallina del complesso determinata ad una risoluzione di 2,3 angstrom.

Il protocollo dimostrato in questo video è generalmente applicabile ed è stato testato su una varietà di biomolecole. Per concludere ChipX è uno strumento chip Lab che integra tutte le fasi di uno studio cristallografico e permette di passare dalla soluzione biomedica alla struttura cristallina in un dispositivo microfluidico unico. Grazie per aver guardato questo video.

e speriamo di averti convinto dei vantaggi dell'utilizzo di ChipX per cristallizzare e determinare la struttura cristallina dei tuoi preferiti di Biomolecule.