Modulazione molecolare da parte di shRNA specifici forniti da lentivirus in neuroni stressati dal reticolo endoplasmatico
24 aprile 2021
Nel presente studio, l'espressione viene abbattuta di due componenti di segnalazione a valle della via PERK, la calcineurina citoprotettiva e la CHOP pro-apoptotica, utilizzando specifici shRNA. In modi opposti, questi modulano la suscettibilità dei neuroni corticali primari all'atrofia dei neuriti dopo l'induzione dello stress del reticolo endoplasmatico.
Questo approccio può essere utilizzato in modelli di sistemi cellulari di stress del reticolo endoplasmatico manipolando l'espressione molecolare dei componenti della coppia a valle. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di rimuovere l'impatto della segnalazione accoppiata mediante la visualizzazione e la misurazione dei percorsi neurali. Questo metodo può contribuire a comprendere le basi molecolari della transizione tra fasi acute e croniche dello stress ER in diversi modelli di malattie neurodegenerative oltre alla gangliosidosi GM2 Per iniziare, sezionare il tessuto sotto una lente d'ingrandimento 20X con due pinze a punta fine numero cinque, separando la corteccia frontale dalle meningi.
Trasferire la corteccia frontale in un tubo conico da 15 millilitri e incubare il tessuto con tre o quattro millilitri di tripsina EDTA per 15 minuti a 37 gradi Celsius per la digestione chimica. Successivamente, lavalo tre volte con la soluzione salina bilanciata di Hank priva di ioni di calcio e magnesio e lo 0,1% di glucosio. Dissociare meccanicamente il tessuto 10 volte pipettando su e giù utilizzando una punta da 1.000 microlitri in DMEM più il 10% di FCS.
Centrifugare l'omogenato a 100 G per un minuto, raccogliere il surnatante e completare il volume rimanente in 1.000 microlitri. Placcare la sospensione cellulare su piastre di coltura cellulare ad una densità di 520 cellule per millimetro quadrato con due millilitri di DMEM contenente 10% FCS, 1% penicillina streptomicina e 1% di un additivo aminoacido essenziale. Incubare a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato con il 5% di anidride carbonica per due ore.
Per consentire la differenziazione delle cellule neurali, cambiare il mezzo per un mezzo neurobasale privo di siero con il supplemento senza siero. Mantenere le colture a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino al trattamento. Per la ricottura, mescolare due oligonucleotidi a singolo filamento con sequenze complementari in quantità molari uguali.
Riscaldare a 95 gradi Celsius per due minuti. Trasferire i campioni dal blocco termico e diluire il prodotto risultante a una concentrazione finale di 0,5 micromolari. Per clonare lo shRNA inserire nel vettore lentivirale pLKO.
3G, digerire un microgrammo del vettore con enzimi di restrizione EcoR1 e PAC1. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio e incubare la reazione per tre o quattro ore a 37 gradi Celsius. Per la legatura, mescolare il vettore digerito e inserirlo in un rapporto molare di 3:1.
Incubarlo con la ligasi T4 e tampone ligasi durante la notte a 16 gradi Celsius. Quindi, mescolare il componente E.coli con il volume totale della reazione di legatura e raffreddarlo sul ghiaccio per 15 minuti. Mettilo in un bagno a 42 gradi Celsius per due minuti e poi raffreddalo di nuovo sul ghiaccio per 15 minuti.
Trasferire il volume totale sottoposto a shock termico in un tubo da 15 millilitri e completare il volume a 1.000 microlitri con Luria-Bertani o mezzo liquido L-B. Agitare i batteri per 90 minuti di 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a circa 330 RPM. Centrifuga che ha incontrato 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare 900 microlitri di surnatante e utilizzare il surnatante rimanente per risospendere il pellet. Distribuire uniformemente la sospensione batterica su una piastra L-B di ampicillina solida e incubare per 37 gradi Celsius durante la notte. Scegli una singola colonia da trasferire in un tubo da 15 millilitri con 10 millilitri di L-B liquido medio e ampicillina.
Agitare i batteri a 37 gradi Celsius a circa 330 RPM e centrifugare la coltura per pellettare i batteri a 5.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, conservare il pellet batterico a meno 20 gradi Celsius. 24 ore prima della trasfezione, seminare da 1 a 5 milioni di cellule HEK-293 in piatti di coltura da 100 millimetri.
Mescolare 14 microgrammi di pKLO. Vettore 3G con un inserto specifico, 10,5 microgrammi di plasmide psPAX e 3,5 microgrammi di plasmide dell'involucro pMD2. G.Diluire 45 microlitri di reagente plasmidico di trasfezione in 700 microlitri di terreno a siero ridotto e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi combinare la miscela di DNA con il reagente di trasfezione plasmidica diluito, mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Cambiare il mezzo del piatto di coltura delle cellule HEK-293 con un mezzo fresco dopo la trasfezione e aggiungere l'intero volume della soluzione di DNA goccia a goccia. Scuotere delicatamente il piatto e incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48-72 ore per consentire agli shRNA di raggiungere la loro trasduzione ottimale.
Raccogliere il terreno con lentivirus e conservare a quattro gradi Celsius. Filtrare il surnatante virale con una membrana di nylon da 0,45 micrometri e aliquote di un millimetro del flusso attraverso. Centrifugare a 17.000 g per quattro ore.
Scartare il surnatante e conservare il pellet. Lasciare asciugare il pellet invisibile e, una volta asciugato, conservare a meno 80 gradi Celsius. Infettare le colture primarie di neuroni corticali con specifici oligonucleotidi shRNA, prendendo di mira le UTR a tre primi di calcineurina A-alfa o CHOP e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un giorno.
Successivamente, aggiungere la soluzione madre GM2 al terreno di coltura a una concentrazione finale di due micromolari e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 16, 24 e 48 ore. Fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide e 120 millimolari di saccarosio in PBS per 20 minuti a 37 gradi Celsius e quindi lavarle con PBS. Aggiungere la soluzione di permeabilizzazione per cinque minuti e lavare con PBS.
Utilizzare 5% BSA diluito in PBS per 45 minuti per consentire il blocco. Quindi, incubare con l'anticorpo anti-MAP2 a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato le cellule due volte con PBS alla fine del tempo di incubazione, incubare con un anticorpo secondario per un'ora.
Montare gli occhiali dopo aver lavato le celle con PBS. Dopo aver ottenuto le immagini con un microscopio invertito ad epifluorescenza caricare l'immagine per ottenere ImageJ e sottrarre lo sfondo cliccando su Process seguito da Subtract Background. Fare clic su Immagine, Regola, Soglia per regolare i valori minimi, consentendo di distinguere il percorso e alcuni tracciati.
Eliminare i soma utilizzando la selezione a mano libera. Selezionare Tracce e fare clic su Modifica, Selezione, Crea selezione. Ottieni il ROI facendo clic sui tasti Ctrl e T della selezione e conservalo.
Apri l'immagine originale. Fai clic sul pannello ROI Manager e seleziona il ROI iniziale. Quindi fare clic sull'immagine originale.
Una volta tracciato il ROI sull'immagine, premere i tasti Ctrl e M per elaborare l'analisi statistica. È stato fatto un tentativo qui per verificare se il silenziamento dei componenti a valle di 2pERK influisce sulla fase di transizione della risposta proteica dispiegata nel modello di cellule di stress ER. Il gene della calcineurina A-alfa e il gene CHOP sono stati silenziati da due specifiche sequenze di shRNA in una coltura cellulare di neuroni primari per un giorno.
L'espressione viene analizzata mediante Western blotting. Si osserva una chiara inibizione della calcineurina A-alfa mediata dallo stress ER e dell'aumento del livello di CHOP nelle cellule knockdown. Il possibile legame dello stress ER indotto dall'accumulo di GM2 con la degenerazione neuronale è stato esaminato eseguendo l'immunocolorazione MAP2 di colture neuronali primarie.
L'atrofia dei neuriti aumenta significativamente dopo aver indotto lo stress ER mediante incubazione di GM2 da 16 a 48 ore. Il silenziamento dell'espressione della calcineurina A-alfa aumenta significativamente l'atrofia dei neuriti, in particolare a 16 ore di accumulo di GM2 rispetto ai gruppi GM2 non trattati. Pertanto, il knockdown della calcineurina A-alfa ha accelerato il processo di degenerazione nei neuroni, corroborando l'effetto pro-sopravvivenza della calcineurina durante la fase iniziale della risposta proteica dispiegata.
Al contrario, il knockdown CHOP ha comportato una significativa diminuzione dell'atrofia dei neuriti rispetto ai controlli precisamente a 16-24 ore. il protocollo cellulare con la corretta coltura cellulare primaria e ottenendo una percentuale pari o superiore di cellule infette con il rispettivo lentivirus. Poiché la perdita dell'assone terminale neurale è il primo passo che delineiamo nel nostro processo, è anche possibile valutarlo eseguendo un test.
Questa tecnica permette al nostro gruppo e ad altri di valutare alcune molecole come potenziali strumenti terapeutici.
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Panoramica
Questo studio analizza gli effetti dell'abbattimento mediato da shRNA di due componenti della segnalazione, calcineurina e CHOP, all'interno del percorso PERK su neuroni corticali primari. La ricerca ha lo scopo di chiarire come questi componenti influenzino l'atrofia dei neuriti in seguito allo stress del reticolo endoplasmatico, fornendo informazioni sulla suscettibilità neuronale e sui meccanismi protettivi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Segnalazione molecolare
Sfondo
- Lo stress del reticolo endoplasmatico è associato a malattie neurodegenerative.
- I componenti della via PERK svolgono ruoli nelle risposte cellulari allo stress.
- La calcineurina ha un ruolo citoprotettivo, mentre CHOP è pro-apoptotico.
- Comprendere questi processi è fondamentale per intervenire sulla neurodegenerazione.
Scopo dello studio
- Esaminare i ruoli distinti della calcineurina e di CHOP nella risposta neuronale allo stress.
- Determinare come la manipolazione di questi componenti modifichi la salute neuronale.
- Indagare le interazioni molecolari nel contesto dello stress del reticolo endoplasmatico.
Metodi Utilizzati
- Sono state utilizzate tecniche di coltura cellulare per far crescere neuroni corticali primari.
- Sono stati clonati shRNA specifici e introdotti per bersagliare la calcineurina A-alfa o CHOP.
- Valutazione della risposta neuronale allo stress del reticolo endoplasmatico mediante trattamento con GM2.
- Sono state utilizzate microscopia fluorescente e ImageJ per l'acquisizione delle immagini e l'analisi.
Risultati principali
- L'abbattimento della calcineurina e di CHOP ha determinato profili di suscettibilità diversi nei neuroni corticali in condizioni di stress.
- Le informazioni meccanicistiche rivelano percorsi protettivi e apoptotici distinti modulati da queste proteine.
- I risultati sottolineano la complessità delle risposte allo stress, fondamentali nelle condizioni neurodegenerative.
Conclusioni
- Lo studio evidenzia i ruoli fondamentali della calcineurina e di CHOP nella salute neuronale durante lo stress del reticolo endoplasmatico.
- Questi risultati hanno implicazioni per la comprensione dei meccanismi neuronali nei modelli di malattia.
- L'indirizzare questi percorsi di segnalazione potrebbe offrire spunti terapeutici nella neurodegenerazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la riduzione dei rischi meccanicistici dei componenti della via PERK nei modelli di malattie neurodegenerative modulando l'espressione della calcineurina e di CHOP mediante somministrazione di shRNA lentivirale. Fornisce misurazioni quantitative della crescita dei neuriti per valutare la vulnerabilità neuronale in condizioni di stress del reticolo endoplasmatico, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e la previsione affidabile nelle fasi iniziali della scoperta. L'approccio facilita la verifica di ipotesi riguardo al segnale citoprotettivo rispetto a quello pro-apoptotico in sistemi neuronali rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche attraverso l'abbassamento dell'espressione di calcineurina (citoprotettiva) e CHOP (pro-apoptotica), chiarificando i loro ruoli opposti nell'atrofia dei neuriti mediata dallo stress del reticolo endoplasmatico.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale degli obiettivi mediante silenziamento lentivirale in neuroni corticali primari, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella segnalazione di PERK.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio dimostrando come la modulazione dei componenti downstream di PERK acceleri o ritardi i fenotipi di neurodegenerazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del Saggio: Genera colture neuronali standardizzate con allungamento assonale quantificabile mediante immunomarcatura per MAP2 e analisi con ImageJ, utili per schermature di composti o di geni.
- Riproducibilità: Stabilisce un modello consistente di stress del reticolo endoplasmatico mediante trattamento con GM2, in grado di indurre una risposta prolungata all'accumulo di proteine mal ripiegate nei neuroni.
- Scalabilità: La consegna di shRNA mediante lentivirale consente una modulazione scalabile dei geni bersaglio in diverse condizioni sperimentali e punti temporali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella l'atrofia dei neuriti indotta dallo stress del reticolo endoplasmatico, una caratteristica chiave delle condizioni neurodegenerative associate a una risposta inadeguata alle proteine mal ripiegate.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte alla validazione preclinica valutando il passaggio dello stato di salute neuronale da segnalazioni citoprotettive a segnalazioni apoptotiche.
- Decisioni basate sul rischio: Guida le decisioni di sviluppo identificando modificatori molecolari che alterano l'equilibrio tra vie di sopravvivenza e degenerazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo informazioni meccanicistiche sulla dinamica della segnalazione di PERK in modelli di malattie neurodegenerative.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui componenti della via PERK nello stress del reticolo endoplasmatico, chiarificando gli eventi molecolari che definiscono la transizione da citoprotettiva ad apoptotica.
- Screening: Fornisce sistemi neuronali pronti per saggi con letture quantitative della morfologia dei neuriti per valutare modulatori genetici o farmacologici.
- Analisi: Genera dati statistici sulla crescita dei neuriti tramite ImageJ per confrontare condizioni e valutare cambiamenti significativi nell'integrità neuronale.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici a rilevanze precliniche modellando le vie dello stress del reticolo endoplasmatico coinvolte nella neurodegenerazione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile di shRNA lentivirale per modulare bersagli rilevanti per la malattia in diversi modelli neuronali e andamenti temporali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi distinguendo i contributi citoprotettivi da quelli pro-apoptotici nella neurodegenerazione.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione attraverso la somministrazione lentivirale, protocolli di imaging fissi e tracciamento automatizzato dei neuriti per ottenere risultati riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti riducendo i rischi legati alle assunzioni meccanicistiche sul segnale PERK nella sopravvivenza neuronale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione corretta in base al rischio, selezionando obiettivi in base alla loro capacità di modificare i fenotipi di atrofia dei neuriti in modelli pertinenti alla malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura primaria di neuroni, nella produzione di lentivirus e nella progettazione di shRNA per un efficace silenziamento genico.
- Si basa su microscopia a fluorescenza e infrastrutture per l'analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) per la misurazione quantitativa della crescita dei neuriti.
- Necessita di standardizzazione nella preparazione delle cellule, nell'efficienza di trasduzione virale e nei tempi di induzione dello stress del reticolo endoplasmatico per garantire confrontabilità tra studi.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora il modello venga esteso ad altri tipi neuronali o ad induttori di stress del reticolo endoplasmatico diversi dal GM2.
- I limiti pratici includono la variabilità dell'efficienza di trasfezione e la necessità di validare l'efficienza del silenziamento mediante Western blotting o qPCR.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:50
Primary Rat Cortical Neuron Cultures
2:25
Lentivirus Production
4:41
Lentivirus Infection
6:23
Primary Neuron Cultures Stressed with Ganglioside GM2 Accumulation and Immunocytochemistry
7:43
Neurite Atrophy Analysis
8:38
Results: GM2 Accumulation-Induced Neuritic Atrophy Modulated by CN-Aα and CHOP Knock-Down in an Opposite Manner
10:07
Conclusion
