Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra
30 giugno 2021
Qui presentiamo il protocollo per la coltura tissutale 3D dell'asse del corpo posteriore zebrafish, consentendo lo studio vivo della segmentazione dei vertebrati. Questo modello di espianto fornisce il controllo sull'allungamento dell'asse, l'alterazione delle sorgenti di morfogeno e l'imaging vivo a livello di tessuto a risoluzione subcellulare.
Le esti piante di coda di zebrafish 3D sfruttano la trasparenza degli embrioni di zebrafish nella sua piena misura durante lo sviluppo di somite e la segmentazione dei vertebrati. Riempire un serbatoio di accoppiamento vuoto con acqua del sistema di pesci. Pulire il filtro con acqua di sistema.
Innalza le barriere tra le coppie di accoppiamento. Spostare selettivamente la coppia di pesci nel serbatoio dell'acqua dolce. Raccogliere embrioni nel colino attraverso trasferimenti d'acqua con un serbatoio vuoto.
Risciacquare gli embrioni raccolti con acqua del sistema ittico e capovolgere una piastra di Petri. Strumenti di dissezione etanolo-smalto. Creare due livelli di nastri sulle diapositive.
Tagliare i lati orizzontali delle camere profonde. Tagli completi della camera con lati verticali. Rimuovere il nastro dalla superficie della camera.
Versare i mezzi di coltura cellulare in un tubo. Mescolare cloruro di calcio 2,8 millimolare concentrazione finale. Aggiungere una soluzione antibiotica.
Mezzi di dissezione aliquota in un tubo separato. Completare il siero bovino fetale per rendere il mezzo di coltura tissutale. De-corrinare embrioni con aghi.
Risciacquare gli embrioni in un piatto d'acqua dolce e raccoglierli per l'espianto. Stabilizzare l'embrione con l'ago e iniziare a snodiare. Taglia i tessuti rimanenti.
Trasferire gli espianto sul coverslip. Appiattire il tessuto e succhiare i mezzi in eccesso con pipetta. Mettere il coverslip sul mezzo di crescita contenente la camera scorrevole.
Metti il tessuto explant su una salvietta tissutale. Applicare l'olio ad immersione all'obiettivo. Montare la camera scorrevole al microscopio.
Regolare i canali laser per l'acquisizione delle immagini. Controllare i limiti del livello Z del campione. Impostare i livelli di time-imaging e z-
Il sistema di espianto della coda 3D mantiene intatta l'integrazione cellulare al bocciolo di coda e l'allungamento in eccesso come interi embrioni. È anche possibile fermare l'allungamento in eccesso attivando chimicamente la superficie con collagene di tipo uno. Il sistema di espianto della coda di zebrafish 3D ci consente di sfruttare la trasparenza degli embrioni di zebrafish permettendoci di scattare immagini di microscopia ad alta risoluzione e quasi oggettive.
Oltre a ciò, ci consente di disaccoppiare l'eccesso di allungamento dalla segnalazione del morfogeno e anche di controllare le sorgenti di segnalazione del morfogeno con semplici metodi di dissezione.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la coltura tessutale tridimensionale dell'asse corporeo posteriore del pesce zebra, che consente l'osservazione in tempo reale della segmentazione nei vertebrati. Il modello di espianto permette di manipolare l'allungamento dell'asse e le sorgenti di morfogeni, insieme a un'immagine tissutale ad alta risoluzione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Immagini in tempo reale
Sfondo
- Gli embrioni di pesce zebra sono trasparenti, consentendo un'osservazione dettagliata durante lo sviluppo.
- Lo sviluppo dei somiti è fondamentale per comprendere la segmentazione nei vertebrati.
- Le tecniche di coltura 3-D migliorano lo studio della dinamica dei tessuti.
- L'immagine in tempo reale fornisce informazioni sui processi cellulari in tempo reale.
Scopo dello studio
- Stabilire un protocollo affidabile per la coltura tessutale tridimensionale del pesce zebra.
- Permettere l'acquisizione di immagini in tempo reale della segmentazione nei vertebrati.
- Manipolare le sorgenti di morfogeni per un controllo sperimentale.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di embrioni di pesce zebra in un ambiente controllato.
- Utilizzo di un acquario vuoto per l'accoppiamento al fine della raccolta di embrioni.
- Applicazione di tecniche di coltura tissutale per espianti 3-D.
- Acquisizione di immagini in tempo reale per osservare i processi di segmentazione.
Risultati principali
- Stabilimento con successo di un modello di coltura tissutale 3-D.
- Dimostrazione delle capacità di imaging in tempo reale durante la segmentazione.
- Controllo sulle sorgenti di morfogeni che influenzano l'allungamento dell'asse.
- Approfondimenti sulle dinamiche dello sviluppo dei vertebrati.
Conclusioni
- Il modello di espianto della coda di zebrafish in 3-D è efficace per lo studio della segmentazione.
- L'immagine in tempo reale fornisce dati preziosi sui processi di sviluppo.
- Questo approccio può essere applicato a ulteriori ricerche in biologia dei vertebrati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Questo metodo affronta un collo di bottiglia fondamentale nella biologia dello sviluppo dei vertebrati, consentendo un'analisi in vivo ad alta risoluzione della somitogenesi nel pesce zebra, superando i vincoli geometrici imposti dall'incapsulamento del tuorlo. Separando l'allungamento assiale dagli input di segnalazione dei morfogeni, il saggio fornisce un sistema controllato per indagare la base meccanicistica della dinamica dell'orologio di segmentazione e del fronte di onda. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta, stabilendo un sistema rilevante per lo studio dei processi conservati di patterning nei vertebrati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai meccanismi di patterning dell'asse e al clock di segmentazione nei vertebrati.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di coltura 3-D appiattito che mantiene una formazione proporzionale dei somiti e una cinetica di allungamento dell'asse paragonabili a quelle degli embrioni integri.
- Valore predittivo: Permette la separazione dei gradienti di segnalazione chimica dagli input meccanici di allungamento, migliorando la certezza nell'assegnazione del meccanismo bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output quantificabili, inclusi la lunghezza dei somiti, l'accorciamento rostrocaudale e la velocità di allungamento dell'asse, per lo screening di composti.
- Riproducibilità: Permette una preparazione standardizzata degli espianti e condizioni di acquisizione immagini, garantendo coerenza tra esperimenti e tra laboratori diversi.
- Scalabilità: Compatibile con l'integrazione in sistemi microfluidici per perturbazioni farmacologiche controllate nel tempo, senza limitazioni legate alla penetrazione del farmaco.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella processi conservati di segmentazione nei vertebrati, utili per comprendere la scoliosi congenita e i disturbi di segmentazione.
- Continuità traslazionale: Collega le scoperte nel pesce zebra ai modelli nei mammiferi attraverso meccanismi condivisi di formazione dei somiti.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi del contributo dei percorsi (ad esempio, Wnt, FGF, Notch) alla segmentazione, indipendentemente da fattori di confondimento legati alla crescita dei tessuti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema di espianto si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del bersaglio e consentendo letture pronte per saggi finalizzati all'identificazione di composti promettenti, con un focus sui percorsi di sviluppo.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi consentendo la manipolazione indipendente delle sorgenti di morfogeni e della meccanica dell'allungamento assiale.
- Screening: Fornisce immagini quantitative ad alta risoluzione adatte all'analisi automatizzata della dinamica della formazione dei somiti.
- Analisi: Permette la misurazione della periodicità della segmentazione, della scala delle dimensioni dei somiti e della velocità di allungamento come biomarcatori farmacodinamici.
- Ricerca traslazionale: Mantiene proprietà del sistema rilevanti per le malattie attraverso la scala proporzionale della somitogenesi rispetto al ritmo dello sviluppo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per studi longitudinali della segmentazione in condizioni di perturbazione genetica o farmacologica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla segmentazione separando la crescita dagli input di segnalazione.
- Valore operativo: Migliora l'accessibilità e la risoluzione dell'immagine appiattendo il tessuto ed eliminando le distorsioni ottiche indotte dal tuorlo.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o abbandono durante la validazione precoce delle target, isolando i contributi specifici dei percorsi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio di target coinvolti nel patterning vertebrale e nello sviluppo del sistema muscolo-scheletrico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'embriologia del pesce zebra, nella microchirurgia e nelle tecniche di coltura dei tessuti.
- È dipendente da microscopia invertita con obiettivi ad alta apertura numerica e controllo ambientale per l'immagine in tempo reale.
- Necessita della standardizzazione dello stadio degli espianti e della composizione del mezzo tra diversi utilizzatori.
- L'adattamento ad altri modelli vertebrati potrebbe richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di dissezione e di coltura.
- Limite pratico: la vitalità degli espianti e la fedeltà della segmentazione diminuiscono oltre le 12-16 ore successive all'isolamento.
