Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa

Caratterizzare una struttura proteica è essenziale per comprenderne la funzione. La spettrometria di massa è emersa come un potente strumento a questo scopo, specialmente per i sistemi proteici che sono difficili da studiare con i metodi tradizionali. Per studiare una struttura proteica per specifiche di massa, vengono eseguite reazioni chimiche specifiche in soluzione che codificano le informazioni strutturali di una proteina nella sua massa.

Un approccio particolarmente efficace è quello di utilizzare reagenti che modificano covalentemente risolvendo catene laterali di amminoacidi accessibili. Queste reazioni portano ad aumenti di massa che possono essere localizzati con risoluzione del livello di residui se combinati con digestione proteolitica e spettrometria di massa tandem. Qui, abbiamo descritto i protocolli associati all'uso di dietil pirocarbonato o DEPC come un reagente di etichettatura covalente insieme al rilevamento di specifiche di massa.

Il DEPC è una molecola altamente elettrofila in grado di etichettare fino al 30% dei residui nella proteina media, fornendo così un'eccellente risoluzione strutturale. Il DEPC è stato utilizzato con successo insieme alle specifiche di massa per ottenere informazioni strutturali per molte proteine diverse. Inizia preparando una soluzione tamponata della tua proteina di interesse a una concentrazione nell'intervallo di decine di micromolari.

Comunemente usiamo un tampone MOPS da 10 millimolare pH 7.4. In alternativa, una soluzione proteica esistente può essere lo scambio tampone in MOPS o in un altro buffer se il campione originale contiene un tampone che ha gruppi funzionali nucleofili. È necessario che il buffer non abbia gruppi funzionali nucleofili perché interferiranno con la reazione proteica del DEPC.

In un microtubo diverso, preparare una soluzione stock di 100 millimolare DEPC in acetonitrile secco. Preparare la soluzione di stock in acetonitrile secco è necessario per prevenire l'idrolisi del DEPC. In un nuovo microtubo, preparare la soluzione di un imidazolo molare in acqua di grado HPLC.

In un nuovo microtubo, mescolare il buffer MOPS e la soluzione di proteine. Alla proteina e al tampone aggiungere un'aliquota della soluzione stock DEPC assicurandosi che la mescoli correttamente prima di posizionare la miscela di reazione in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un minuto. Il volume della soluzione stock DEPC utilizzata deve essere scelto in base al rapporto di concentrazione finale delle proteine DEPC desiderato.

Non esiste un solo insieme di concentrazioni di DEPC e proteine che funzionino con ogni proteina, anche se la concentrazione ottimale di DEPC può essere stimata in base al numero di residui di istidina e lisina accessibili al solvente presenti nella proteina. Va notato che il volume di acetonitrile aggiunto, che è effettivamente il volume della soluzione DEPC aggiunta non deve superare l'1% del volume totale di reazione in modo da evitare perturbazioni della struttura proteica durante la reazione. Il tempo di reazione dipende in ultima analisi dall'utente, anche se una reazione di un minuto nella condizione di esempio riduce al minimo l'etichettatura eccessiva della proteina e l'idrolisi del DEPC.

Dopo un minuto, disseta la reazione aggiungendo l'imidazolo per scavenge il rimanente sul DEPC reagito. Assicurarsi che la concentrazione finale di imidazolo sia 50 volte la concentrazione di DEPC. Per identificare i residui modificati dal DEPC, la proteina deve essere digerita proteoliticamente in frammenti peptidici.

Per la digestione, scegliere condizioni suscettibili alle proteine di interesse. I passaggi comuni descritti qui prevedono lo spiegamento di proteine e quindi la riduzione e l'alchilating dei legami disolfuro in modo che l'efficienza della digestione possa essere migliorata. Nella nostra esperienza, lo sviluppo della proteina con un denaturante e calore prima della digestione migliora l'efficienza della digestione.

Mentre le proteine si stanno svolgendo, confrontare le soluzioni di TCEP e iodoacetamide in un appropriato tampone di digestione. Il TCEP deve essere usato come agente riducente al posto del ditiothreitol o del DTT perché il DTT può reagire con residui modificati depc. L'alchilazione dei file risultanti dopo la riduzione è essenziale per evitare il rimescolamento dell'etichetta in cui i file liberi e la proteina reagiscono con amminoacidi modificati.

Una volta terminato il passaggio di dispiegamento, ridurre i legami disolfuro aggiungendo TCEP alla miscela di reazione e lasciarlo reagire per tre minuti a temperatura ambiente. Dopo la riduzione, aggiungere iodoacetamide alla miscela di reazione, lasciarla reagire per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Ottenuto qui posizionando la miscela di reazione in una scatola.

La concentrazione finale di iodoacetamide deve essere il doppio della concentrazione utilizzata per il TCEP o 80 volte la concentrazione proteica o il legame disolfuro. Preparare l'enzima di interesse, di solito tripina o chimotripsina secondo le specifiche del produttore. Dopo aver preparato l'enzima di scelta, iniziare la digestione e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius.

Un rapporto proteina-enzima 10:1 con una digestione di tre ore utilizzando enzimi immobilizzati è tipicamente una buona scelta per le proteine etichettate DEPC. Dopo la digestione, il campione deve essere immediatamente analizzato da LC-MS/MS o congelato con azoto liquido per ridurre al minimo la degradazione del campione e la perdita di etichette. I parametri standard LC-MS/MS per la proteomica dal basso verso l'alto possono essere utilizzati per identificare siti etichettati sui frammenti peptidici proteolitici.

La fase inversa C18 fase stazionaria dovrebbe essere utilizzata per ottenere la migliore separazione dei peptidi. Nella nostra esperienza, l'LC capillare fornisce informazioni quantitative più affidabili sui livelli di modifica rispetto al nano LC a causa delle maggiori quantità di campioni utilizzate. Una tipica fase mobile LC che viene utilizzata per separare i peptidi etichettati DEPC è composta da due solventi.

Il solvente A è acqua con acido formico dello 0,1% e il solvente B è un acetonitrile con acido formico dello 0,1%. Viene utilizzata un'eluizione del gradiente e il tempo di separazione può essere ottimizzato in base alla complessità del campione. Uno spettrometro di massa in grado di eseguire online LC-MS e MS/MS è necessario per identificare i siti di modifica DEPC sui peptidi.

Nei nostri esperimenti, abbiamo utilizzato con successo diversi tipi di spettrometri di massa. Abbiamo scoperto che una fusione Thermo Orbitrap fornisce risultati eccellenti, anche se qualsiasi spettrometro di massa in grado di eseguire automaticamente MS / MS di molti peptidi durante un'analisi LC-MS dovrebbe essere adatto. Le condizioni HPLC e i parametri spettrometrici di massa devono essere impostati correttamente prima della misurazione.

Se il campione è stato congelato, deve essere scongelato subito prima dell'analisi. Fare del tuo meglio per ridurre al minimo il tempo tra la preparazione del campione e l'iniezione HPLC. Caricare e iniettare il campione di proteine etichettate digerite nel sistema LC e avviare l'acquisizione LC-MS/MS o l'identificazione del sito dell'etichetta DEPC e la quantificazione dell'area di picco, esistono più metodi.

Sugli strumenti Thermo Fisher, excalibur o proteome discoverer forse usato. Impostare parametri appropriati per l'identificazione peptidica in un programma. L'addizione di DEPC e la carbamidometilazione sono incluse come modifiche variabili che aiutano i residui o allocate.

Le aree di picco cromatografiche delle versioni modificate e non modificate dei peptidi vengono utilizzate per determinare le percentuali di modifica del livello dei residui. L'etichettatura DEPC con rilevamento MS è anche uno strumento prezioso per caratterizzare cambiamenti strutturali di ordine superiore alle proteine. Dal nostro studio, l'etichettatura covalente DEPC può identificare specifiche regioni proteiche che subiscono cambiamenti strutturali sullo stress termico e ossidativo.

Nella figura, variazioni significative delle percentuali di modifica sono mostrate in blu per la diminuzione dell'etichettatura e in rosso per l'aumento dell'etichettatura, mentre i residui senza modifiche significative dell'etichettatura sono mostrati in verde pallido. Ad esempio, dopo che la microglobulina beta-2 è esposta allo stress termico, molti residui che subiscono significative diminuzioni nelle estensioni di etichettatura, N-terminale, serina 28, istidina 31, serina 33, serina 55, serina 57 e lisina 58 sono più vicini di un lato della proteina suggerendo che questa regione della proteina subisce un cambiamento confermazionale o possibilmente media l'aggregazione. Dopo che la proteina è stata esposta a stress ossidativo, diversi residui con una diminuzione dell'etichettatura, serina 11, istidina 13, lisina 19, lisina 41 e lisina 94 da un ammasso su un'altra fase della proteina che indica che il cambiamento di conferma indotto dall'ossidazione si verifica altrove.

Questo studio ha importanti implicazioni per le terapie proteiche, che sono attualmente il segmento in più rapida crescita del mercato farmaceutico. Altri lavori del nostro gruppo hanno anche dimostrato che le specifiche di massa covalenti dePC possono rilevare e identificare i siti di cambiamenti confermazionali nelle terapie antia anticorpali monoclonali stressate. Come potete vedere, l'etichettatura covalente con DEPC è semplice da implementare sperimentalmente, ma può fornire preziose informazioni strutturali per le proteine.

La risoluzione strutturale fornita dalle specifiche di massa di etichettatura DEPC è modesta rispetto alle tecniche come la cristallografia a raggi X e la NMR, ma è suscettibile a quasi tutte le proteine indipendentemente dalle sue dimensioni o capacità di cristallizzarsi. Le specifiche di massa covalenti DEPC funzionano anche con miscele proteiche e possono funzionare con tipi di campioni molto complicati, come il llysato cellulare e le cellule haCat. Dopo aver visto questo video, siamo sicuri che troverai DEPC che etichetta uno strumento utile per caratterizzare la struttura proteica.