Name: Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri la riprogrammazione diretta dei fibroblasti cutanei in mioblasti e miotubi per studiare i disturbi neuromuscolari. Questo metodo rapido utilizza vettori virali per testare terapie personalizzate su cellule derivate da pazienti.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Vincent Mouly per aver condiviso le sue conoscenze in passato riguardo al modello. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.)), il National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. ha ricevuto il sostegno di borse di studio dall'Ohio State University / Nationwide Children's Hospital Muscle Group e dalla Philippe Foundation. Questo lavoro è stato sostenuto anche da fondi discrezionali interni e parte del lavoro di salto di exon 2 è stato sostenuto anche da CureDuchenne (K.M.F.) e Association Francaise Contre Les Myopathies. Numero IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

Nationwide Children's Hospital ha concesso in licenza il programma di salto exon 2 descritto nel presente documento ad Audentes Therapeutics. K.M.F. e N.W. hanno ricevuto pagamenti di royalty a seguito di questa licenza.

Per ottenere linee cellulari FM di buona qualità, alcuni passaggi sono fondamentali. Prima viene elaborata la biopsia cutanea, maggiori sono le probabilità di ottenere fibroblasti sani. Anche il numero di passaggi delle colture di fibroblasti è importante. Le cellule primarie hanno una capacità proliferativa limitata e dopo molti passaggi, entrano in senescenza replicativa. Pertanto, è meglio avere uno stock di fibroblasti a un basso numero di passaggi e trasformare le cellule al primo passaggio possibile. 
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I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D'altra parte, la coltura e il mantenimento dei mioblasti primari sono impegnativi, a causa del loro limitato tasso di proliferazione e della senescenza replicativa in vitro1. Un'alternativa a queste limitazioni è immortalare i mioblasti conl'inserimentodella telomerasi umana (hTERT) e/o della chinasi ciclina-dipendente 4 (CDK4)geni 2,3 , con conservazione delle caratteristiche muscolari scheletriche4. Tuttavia, l'obtenzione dei mioblasti primari dipende ancora dalla biopsia muscolare, una procedura chirurgica con svantaggi per i pazienti, che, in molti casi, hanno i loro muscoli nella degenerazione avanzata. Pertanto, il muscolo di questi pazienti è composto da una proporzione significativa di tessuto fibrotico e / o adiposo e produce meno cellule muscolari, richiedendo la purificazione delle cellule in precedenza per l'immortalizzazione.
A differenza delle biopsie muscolari, le biopsie cutanee sono più accessibili e sono meno dannose per i pazienti. I fibroblasti primari possono essere derivati da frammenti cutanei in vitro. Sebbene i fibroblasti non siano principalmente influenzati da mutazioni che causano disturbi neuromuscolari, possono essere trasifferenti in mioblasti. Questo può essere ottenuto con l'inserimento del gene Myod, un fattore di trascrizione regolatore miogenico5. In questo manoscritto descriviamo il protocollo per ottenere mioblasti transdifferenziati, dalla creazione di colture di fibroblasti all'obtenzione di miotubi differenziati (un riassunto rappresentativo del metodo è raffigurato nella figura 1).
Il test preclinale delle strategie terapeutiche dipende da modelli cellulari e animali che portano mutazioni simili alle mutazioni riscontrate nei pazienti umani. Sebbene lo sviluppo di modelli animali sia diventato più fattibile con il progresso di tecnologie di editing genico come CRISPR/Cas96, è ancora impegnativo e costoso. Pertanto, le linee cellulari derivate dal paziente sono un'opzione accessibile per avere modelli, coprendo l'ampio spettro di mutazioni di malattie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). L'obtenzione e la creazione di modelli cellulari sono cruciali per lo sviluppo di terapie personalizzate per tali patologie.
Tra le terapie personalizzate che sono state studiate, le strategie di salto dell'esone è una delle promettenti per diverse distrofiemuscolari 7,8. Questa strategia consiste nel produrre una proteina più corta ma funzionale. Questo viene eseguito nascondendo la definizione di esone allo spliceosoma, escludendo quindi l'esone mutato dal messaggero finale. Questa è una tecnologia molto promettente che è stata approvata dalla FDA per dmd. Pertanto, descriviamo anche in questo protocollo, metodi per trasfetto i mioblasti con due diverse tecnologie correlate che saltano l'esone: oligonucleotidi antisense (AON) e virus associato all'U7snRNA-adeno (AAV). La trasfezione AON è un buon strumento per lo screening iniziale di diverse sequenze progettate per promuovere l'esonesaltando 9. Tuttavia, l'attività degli AON è transitoria. Per ottenere un'espressione sostenuta delle sequenze di antisense, abbiamo anche esplorato piccoli RNA nucleari (snRNA) combinati con AAV, consentendo la localizzazione nucleare e l'inclusione nei macchinari di giunzione10. U7 è uno snRNA coinvolto nell'elaborazione dell'mRNA istono che può essere progettato per legare le proteine che lo reindirizzeranno allo spliceosoma e forniranno sequenze di antisense11. L'uso di U7 snRNA modificati in combinazione con vettori AAV supera i limiti delle AON con conseguente continua espressione delle AON e migliore trasduzione dei tessuti di interesse12. Usiamo cellule derivate da pazienti affetti da DMD per questo protocollo per illustrare la strategia di esone-salto.

<table><tbody><tr><td>Piatto da 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA, rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X Tampone di trasferimento</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X Tris-acetato SDS tampone di corsa</td><td>Thermo Fisher</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>gel di acetato di tris 3-8%</td><td>Thermo Fisher</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>pallone da 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-miosina catena pesante, anticorpo sarcomero</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridome Bank</td><td>MF20 surnatante</td><td>Diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Antiossidante</td><td>Thermo Fisher</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3571</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I set (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina cloridrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 primer umani</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'Distrofina</td><td></td></tr> <tr><td>anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>Diluizione 1:1000</td></tr><tr><td>Halt Cocktail di inibitori della proteasi 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B</td><td>Thermo Fisher</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>Diluizione 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 sistema di vetrini a camera</td><td>Thermo Fisher</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR matrice di membrana</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore di congelamento Mr. Frosty</td><td>Thermo Fisher</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa 0,45 e micro; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Controllo del siero normale di capra</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Tampone bloccante per Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero ridotto Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della fosfatasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio</td><td>Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Colorazione proteica totale per la normalizzazione Western Blot</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentratore-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di differenziazione delle cellule muscolari scheletriche</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule muscolari scheletriche</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>reagente</td> <td>TRIzolThermo Fisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore a bassissima temperatura</td><td>Thermo Scientific</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni presenti nell'uomo. L'immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un'alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l'aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.

Questo protocollo mostra come stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana e convertirle in mioblasti e quindi in miotubi differenziati. Questo tipo di linea cellulare è estremamente utile per lo studio dei disturbi neuromuscolari e il test in vitro di potenziali terapie.
Una rappresentazione schematica della conversione dei fibroblasti è illustrata nella figura 1. La figura 2A mostra un frammento di pelle e i ...

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

Ciao a tutti. Mi chiamo Nicolas Wein. Sono uno dei principali investigatori del Nationwide Children's Hospital di Columbus, Ohio.E oggi vi mostreremo un video su come prendere una biopsia cutanea e convertirla in mioblasti e miotubi. Questo è uno strumento molto utile per studiare il disturbo neuromuscolare. Inoltre, è una tecnologia molto più veloce rispetto all'IPSC perché stiamo usando due diversi tipi di virus per combattere direttamente questo tipo di cellule.Questo video dimostra il protocollo per stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana, la conversione in mioblasti e quindi miotubi differenziati. Una biopsia cutanea viene trasferita alla coltura cellulare per derivare fibroblasti dermici. I lentivirus che trasportano geni hTERT e MYOD vengono utilizzati per trasdurre questi fibroblasti.Dopo l'aggiunta del mezzo di crescita del mioblasto integrato con doxiciclina, viene espresso il gene MYOD, inducendo la conversione dei fibroblasti in mioblasti. Successivamente, il mezzo viene passato a un mezzo di differenziazione, integrato anche con doxiciclina. Quindi i mioblasti si fondono tra loro, formando miotubi multinucleati.Aspirare il supporto dal tubo e risciacquare la biopsia con 10 millilitri, uno x PBS a temperatura ambiente, tre volte. Dopo il terzo lavaggio, lasciare il PBS nel tubo. Versare il PBS e la biopsia cutanea su un piatto quadrato di 10 centimetri.Usando bisturi sterili, tagliare la biopsia in pezzi il più piccoli possibile. Utilizzando una pipetta, trasferire un singolo pezzo di pelle su un piatto quadrato sterile di 10 centimetri. Aspirare l'eccesso di PBS da ogni pezzo.Fare attenzione a non aspirare il pezzo stesso. Coprire parzialmente i piatti con il coperchio e lasciare asciugare i pezzi di biopsia della pelle per cinque o 20 minuti. Non lasciare asciugare i pezzi troppo a lungo.Una volta che i pezzi sono asciutti, inclinare il piatto con un angolo di 45 gradi e aggiungere lentamente 12 millilitri di mezzo fibroblasto all'angolo del piatto. Abbassare il piatto, distribuendo attentamente i supporti in modo che i pezzi non siano sollevati dal supporto. Posizionare i piatti nell'incubatrice.Sostituire il supporto in cinque o sette giorni e una volta alla settimana dopo. Seme fibroblasti primari al 30% di confluenza e due pozzi di una piastra di 12 pozza, circa 20.000 cellule per pozzo, al fine di avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo. Per la trasduzione lentivirale, aggiungere da due a 5 miliardi di genomi virali di hTERP Puromicina Lentivirus e 400 microlitri di mezzo fibroblasto.Aggiungere il mix di lentivirus a un bene. Al secondo pozzo, aggiungere solo 400 microlitri di mezzo fibroblasto. Il giorno seguente, aggiungere un millilitro di media.Uno o due giorni dopo, trasferire le cellule in una piastra di sei pozzi e farle crescere fino a raggiungere il 60-70% di confluenza. Integrare il mezzo fibroblasto con un microgrammo per millilitro di Puromicina e aggiungere due millilitri ad ogni pozzo. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte per almeno 12 giorni, cambiando il supporto ogni due o tre giorni.Grafico seed H che esprime fibroblasti al 30% di confluenza in tre pozzi della piastra dei 12 pozzi per avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo. Per la trasduzione lentivirale, mescolare da due a cinque miliardi di genomi virali di MYOD Hygromycin B lentivirus e 400 microlitri di mezzo fibroblasto e aggiungere a due pozzi. Aggiungere un millilitro di mezzo il giorno successivo.Uno o due giorni dopo trasferiscono le cellule in una piastra di sei pozzi e crescono fino al 60-70% confluenti. Integrare i mezzi di crescita con 400 microgrammi per millilitro di Hygromicina B.Aggiungere due millilitri a ciascun pozzo. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle nei pozzi di controllo non sono morte, in genere impiegando almeno 12 giorni, cambiando il supporto ogni due o tre giorni.Per l'induzione dei mioblasti, far crescere i fibroblasti fino a quando non sono confluenti al 70%. Aggiungere otto microgrammi per millilitro di doxiciclina al mezzo di crescita del mioblasto. Utilizzare sempre aliquote fresche di doxiciclina e media.Il mezzo dovrebbe essere preparato proprio prima che qualsiasi cambiamento dei media. Inoltre, la doxiciclina non deve essere rifozenata. Aspirare il mezzo fibroblasto e sciacquare le cellule con PBS.Aggiungere 10 millilitri di mezzi di mioblasto integrati. Due o tre giorni dopo, le cellule sono dal 90 al 95% confluenti e la loro morfologia sarà cambiata. Aspirare il supporto di crescita del mioblasto e sciacquare la superficie cellulare con PBS.Aggiungere 10 millilitri di mezzi di differenziazione che sono stati integrati con otto microgrammi per millilitro di doxiciclina fresca. Continuare a cambiare i media ogni due o tre giorni fino a formare miotubi. Da sette a 10 giorni dopo l'inizio della differenziazione del miotubo, le cellule dovrebbero essere completamente differenziate, ma questo varia da una linea cellulare all'altra.I primi fibroblasti possono emergere cinque giorni dopo che i pezzi della pelle sono stati in coltura. Nella foto B, i fibroblasti sono confluenti e pronti per essere trasferiti a mastri quadrati di 75 centimetri per un'ulteriore proliferazione. È importante congelare diverse fiale di fibroblasti a basso numero di passaggi quando le cellule primarie entrano nella senescenza replicativa.Una volta stabilite le linee cellulari FM per la conversione dei fibroblasti in miotubi, i fibroblasti devono proliferare fino al 70% confluente come mostrato nell'immagine A.È importante non superare l'80% di confluenza, poiché un'alta densità può compromettere la differenziazione. Dopo l'aggiunta di doxiciclina al mezzo, entro due o quattro giorni le cellule diventano mioblasti, caratterizzati da una morfologia allungata e orientamento parallelo come si vede nella foto B.I miotubi differenziati sono mostrati nella figura C.Il tempo per la fusione e la differenziazione dei miotubi può variare da sette a 21 giorni a seconda del genotipo cellulare. Le cellule devono essere raccolte o fissate prima di staccarsi.L'inizio del distacco può essere osservato dal colore e dalla luminosità dei bordi del miotubo, come sottolineato dalle frecce in questa immagine. Per immunofluorescenza, l'espressione di proteine specifiche del muscolo maturo conferma la riuscita conversione dei fibroblasti in miotubi. In queste immagini vengono visualizzate tre celle diverse.Il grado di differenziazione varia da cellula a cellula, e può essere o meno effettuata dalla mutazione primaria in quanto è il caso delle cellule nelle figure B e C.Un'ulteriore convalida del modello è stata confermata da RNAseq. Come mostrato in questa trama ci sono più di 12.000 geni espressi in modo differenziato rilevati nei miotubi FM rispetto a quello del muscolo scheletrico. La correlazione significativa tra entrambi i trascrizioni supporta che le cellule FM hanno un profilo di espressione specifico del muscolo che dimostra che sono un surrogato utile e affidabile per le linee cellulari derivate dai muscoli.Per illustrare l'utilità di questo modello in vitro, abbiamo usato una delle duplicazioni esoniche più comuni nel gene DMD. La duplicazione di Exon due porta all'interruzione del frame di lettura DMD e il suo salto può portare al ripristino di quel frame di lettura o all'utilizzo del sito di ingresso ribosoma interno. Questa terapia è già stata convalidata con studi in vivo Figura A, abbiamo dimostrato la prova del concetto con l'analisi RTPCR di questa particolare linea cellulare mutata, con e senza trattamento saltando l'esone.La macchia occidentale nella figura B dimostra che la proteina distrofina funzionale è espressa nelle cellule trattate. Quando si confronta l'efficienza di questa terapia con modelli in vivo, i risultati supportano l'affidabilità della tecnica di differenziazione cellulare e ne supportano l'uso per testare varie terapie geniche specifiche per mutazioni. Prima degli studi clinici necessari per testare l'efficacia del supporto terapeutico ufficiale sui disturbi neuromuscolari, a seconda della capacità dei modelli animali e cellulari.Lo sviluppo di modelli animali, sebbene sia più facile al giorno d'oggi, non è un'opzione fattibile per ogni mutazione specifica. La generazione di mioblasti attraverso cellule IPS derivate da fibroblasti dermici è un'alternativa, ma è una tecnica che richiede molto tempo. Pertanto, questa procedura è una semplice alternativa alla generazione IPS che consente la conversione diretta dei fibroblasti in mioblasti.Facilita l'accesso ai modelli cellulari umani evitando l'applicazione più invasiva delle biopsie muscolari In conclusione, questa conversione diretta dei fibroblasti in mioblasti è un potente strumento per testare terapie per disturbi neuro muscolari in un contesto specifico di limitazione.

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