Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Questo è un protocollo dettagliato per assemblare plasmidi multi-genico utilizzando il kit Yeast MoClo. Questo metodo consente la comoda clonazione di una varietà di compagni di classe multi-gene. È ideale per generare una grande libreria di parti correlate.

Inizia impostando il mix di reazione del Golden Gate. Aggiungere 20 femtomoli di ogni prodotto PCR e il vettore di ingresso, un microlitro di tampone Ligasi 10X T4, 0,5 microlitri di Esp3I e 0,5 microlitri di T4 ligasi. Aggiungere acqua a doppia distillazione per portare il volume totale a 10 microlitri.

Quindi, esegui la reazione di clonazione. Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo alfa DH5 o nelle cellule equivalenti di Escherichia coli chimicamente competenti mediante shock termico. Stendere le cellule su una piastra lb con 35 microgrammi per millilitro cloramfenicolo.

Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatrice e lasciarlo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per lasciare che la proteina fluorescente verde supercartella o sfGFP si sviluppi per un colore verde più intenso. Per schermare la piastra, posizionarla su un transilluminatore a luce ultravioletta o blu.

La sfGFP contenente colonie si fluoresce sotto la luce UV. Le colonie verdi sono negative perché contengono la parte non tagliata plasmide. Le colonie bianche sono probabilmente positive.

La clonazione ha esito positivo se ci sono colonie bianche dal 30 al 100%. Assemblare un vettore intermedio con il connettore sinistro, l'abbandono sfGFP, il connettore destro, un marcatore di selezione del lievito, un'origine di replicazione del lievito e il plasmide della parte con un mRFP1, un'origine E.coli e il gene resistente all'ampicillina. Eseguire la reazione di clonazione come descritto nel manoscritto testuale.

Trasformare l'intero mix di reazione nel ceppo alfa DH5, quindi stendere le cellule su una piastra lb con 50 microgrammi per millilitro carbenicillina o ampicillina. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estrae il piatto dall'incubatrice.

Il piatto conterrà colonie sia di colore rosso pallido che verde pallido. Mantienilo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per far maturare mRFP1 e sfGFP. Utilizzare un transilluminatore a luce UV o blu per identificare le colonie verdi che contengono il vettore intermedio potenzialmente corretto.

Striati le colonie verdi su una piastra di carbenicillina lb e incuba a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, strisciarli di nuovo su una piastra di cloramfenicolo e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Le colonie che crescono su placche di cloramfenicolo contengono plasmidi malassemblati.

Una volta che il vettore intermedio è stato assemblato con successo, procedere con l'assemblaggio delle unità di trascrizione. Questo assieme di quattro pezzi contiene il vettore intermedio, un promotore, un CDS e un determinatore. Purificare i plasmidi, registrare le loro concentrazioni e diluire ogni plasmide a 20 femtomoli di DNA per microlitro.

Dopo aver eseguito la reazione di clonazione, trasformare l'intero mix di reazione di clonazione nelle cellule competenti DH5 alpha o E.coli equivalenti e placcarle sulla carbenicillina LBN. Quindi incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo 16-18 ore, estraere il piatto dall'incubatore e tenerlo a quattro gradi Celsius per circa cinque ore per far maturare la sfGFP.

Utilizzare un uv o un transilluminatore a luce blu per identificare le colonie bianche non fluorescenti che contengono le unità di trascrizione potenzialmente corrette. Assemblare un vettore intermedio per i plasmidi multi-genico come descritto nel manoscritto testuale. Quindi trasformare l'intero mix di reazione di clonazione in cellule alfa DH5 e placcarle su lb con 50 microgrammi per millilitro kanamicina.

Incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Eseguire lo screening a base di colore rosso e verde, quindi striare e far crescere le colonie verdi su una piastra di kanamicina lb per lo schermo per gli scompirti come precedentemente dimostrato. Successivamente, assemblare il plasmide multi-gene impostando una reazione di clonazione come descritto nel manoscritto testuale.

Trasforma l'intero mix di reazione di clonazione in cellule alfa DH5 e placcale sulla kanamicina lb. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius durante la notte. Quindi eseguire lo screening verde e bianco come descritto in precedenza.

Questo protocollo è stato utilizzato per costruire un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2. Sono stati assemblati quattro plasmidi replicativi e uno integrativo multi-gene. Il rapporto tra colonie potenzialmente corrette per la clonazione vettoriale intermedia era dell'1,83%Una volta clonato il plasmide intermedio, il tasso di successo nell'assemblaggio di plasmidi multi-genici dall'intermedio era del 93,77%Il numero trascurabile di colonie bianche positive dimostra un assemblaggio non ottimale di plasmidi multi-genici.

Dopo essersi trasformato in lievito, le colonie che producono beta-carotene e licopene sono cresciute il terzo giorno. Quattro colonie da ogni piatto sono state striate su piatti freschi e coltivate per altri due giorni. I carotenoidi sono stati estratti e quantificati dalla spettrofotometria UV-Vis.

BTS1/ERG20 porta a una produzione di beta-carotene 35 volte superiore rispetto al ceppo con erg20 da solo. Allo stesso modo, la produzione di licopene è circa 16,5 volte superiore nella tensione con BTS1/ERG20 rispetto alla sola ERG20. Il plasmide integrativo multi-gene è stato utilizzato per l'interruzione del locus ADE2, sia con un gRNA che senza DNA di supporto o con gRNA e un plasmide integrativo multi-gene come DNA aiutante.

Dopo tre o quattro giorni, le colonie rosse furono osservate sulla piastra YPD con Nourseothricin, indicando che l'ADE2 era stato interrotto con successo. Durante il tentativo di questo metodo, la cosa più importante da ricordare è misurare accuratamente le concentrazioni di DNA e pipettare con attenzione durante l'impostazione di questo mix di reazioni. Questa tecnica consente ai ricercatori nel campo dell'ingegneria metabolica del lievito di rilevamento di un gran numero di geni e promotori per massimizzare la resa del prodotto.