Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

Il metodo di fissazione del gradiente, in cui viene eseguita una centrifugazione in gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, aiuta a identificare le interazioni tra proteine che si legano transitoriamente a complessi multi-subunità. L'uso di reagenti di fissazione nel gradiente di glicerolo stabilizza il legame di fattori sciolti, senza la formazione di precipitati, consentendo l'identificazione delle interazioni di specifiche proteine con semi complessi spliced. La dimostrazione del protocollo finale aiuta gli utenti alle prime armi ad apprendere informazioni che potrebbero essere difficili da comprendere dal solo testo scritto.

Per la preparazione dell'estratto totale di lievito, far crescere le cellule di lievito che esprimono uno dei fattori di splicing fusi al tag tap e un litro di terreno glucosio Y e B integrato con gli amminoacidi o le basi nucleiche appropriati. Quando la coltura raggiunge una densità ottica a 600 nanometri di uno, raccogliere le cellule di lievito mediante centrifugazione in tre flaconi da centrifuga da 500 millilitri e lavare le cellule due volte in 10 millilitri di acqua sterile fredda per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in un decimo del volume cellulare del tampone freddo A e congelare 50 microlitri di sospensione cellulare di lievito in azoto liquido.

Dopo il congelamento, macinare i pellet di celle congelate attraverso sei cicli a 20 hertz per tre minuti in un mulino a palle, immergendo il contenitore delle celle congelate in azoto liquido alla fine di ogni ciclo. Dopo l'ultimo ciclo, immergere i tubi contenenti gli estratti in acqua a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto. Una volta sciolto, centrifugare per raccogliere gli estratti.

E quantificare la proteina che i surnatanti eliminati con il metodo BCA. Quindi congelare rapidamente le aliquote degli estratti in azoto liquido per una conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per preparare un gradiente di glicerolo, aggiungere una concentrazione finale dello 0,1% dell'agente reticolante glutaraldeide a una soluzione di glicerolo al 30% e tampone A e mescolare per omogeneizzare.

Aggiungere sei millilitri di soluzione fredda di glicerolo al 10% e tamponare A a una provetta da centrifuga da 12 millilitri e utilizzare una siringa master a gradiente dotata di un ago lungo per stratificare la soluzione di glicerolo glutaraldeide al 30% sul fondo della provetta. Utilizzare un dispositivo master del gradiente per creare un gradiente lineare di glicerolo secondo le specifiche del produttore. Stratificare con cura 200 microlitri di glicerolo al 7% e tamponare un cuscino sulla parte superiore del gradiente prima di aggiungere circa due milligrammi di estratto cellulare sulla parte superiore della provetta.

Dopo la generazione del gradiente di glicerolo, posizionare il campione in un rotore a secchiello oscillante pre-raffreddato e raccogliere l'estratto mediante centrifugazione. Aliquotare il campione da ciascuna provetta da 12 millilitri in frazioni di 24.500 microlitri e utilizzare una pompa peristaltica per spingere una soluzione di glicerolo al 40% attraverso il gradiente dal 10 al 30% dalla provetta alla raccolta delle frazioni. Quindi caricare 50 microlitri di ciascuna frazione direttamente sulle membrane di nitrocellulosa su un dot blot, seguito dall'aggiunta di tampone bloccante, e utilizzare un anticorpo primario contro il CBP per rilevare la proteina sull'immuno blot e un anticorpo secondario appropriato, se necessario.

In assenza di reticolante, CWC 24 è concentrata tra le frazioni cinque e 13, corrispondenti a complessi di circa 80-200 megadalton. In presenza del reticolante, tuttavia, la posizione di CWC 24 sul gradiente viene spostata a frazioni alla base del gradiente corrispondenti a complessi più grandi. Confrontando la sedimentazione di CWC 24 con quella della subunità U5 snRNP, Prp8, e della subunità NTC, Prp19 rivela che CWC 24 è concentrata nelle stesse frazioni.

Ma, poiché si associa transitoriamente con lo spliceosoma, è presente anche nelle frazioni più leggere. È interessante notare che le frazioni 11 e 12 sono quelle in cui Prp8 e 19 iniziano a concentrarsi, suggerendo che questa è la porzione del gradiente in cui il complesso B Act inizia a sedimentare. L'analisi Western blot delle frazioni 11 e 12 rivela i segnali Prp8 e 19 come strisci che entrano a malapena in un gel di acrilammide all'8%, dimostrando che fanno effettivamente parte di grandi complessi.

CWC 24 è presente anche nella frazione 12, ma in una concentrazione molto più bassa, coerente con il suo legame transitorio al complesso B Act. Nel loro insieme, questi risultati mostrano che la glutaraldeide può essere utilizzata come reticolante per stabilizzare il legame di fattori transitori ai sottocomplessi di splicing. Questo metodo può essere applicato allo studio di qualsiasi complesso di subunità motorie dinamiche che si associa transitoriamente con alcuni dei loro componenti, come lo spliceosoma.