Name: Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri l'uso di cellule staminali embrionali aploidi partenogenetiche del topo come sostituto dello sperma per creare embrioni semiclonati. Questo metodo facilita lo studio dell'imprinting genomico.

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Ringraziamo il Dott. Giulio Di Minin per la derivazione delle linee phaESC e il Dott. Remo Freimann per il funzionamento della citometria a flusso. Riconosciamo anche la signora Michèle Schaffner e il signor Thomas M. Hennek per il supporto tecnico con il trasferimento di embrioni. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza (grant 31003A_152814/1).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La clonazione dei mammiferi mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) è stata introdotta negli anni'90 19,20,21. Questi sviluppi hanno fatto seguito a studi di clonazione condotti 30 anni prima inanfibi 22. Il notevole ritardo riflette la difficoltà dell'embriologia e dell'imprinting genomico nei mammiferi. Lo sviluppo di SCNT di mammiferi è la base per l'applicazione dell'haESC per sostituire lo sperma, che è dettagliato in questo protocollo.
La sincronizzazione del ciclo cellulare è un fattore importante per il successo di SCNT23. Questo vale anche per l'iniezione di haESC in questo protocollo. L'introduzione di un genoma donatore in un ricevente richiede che le fasi del ciclo cellulare siano abbinate per evitare rotture cromosomiche o aneuploidie che abrogano lo sviluppo dell'embrione. La semiclonazione ha l'ulteriore complessità che due genomi e un citoplasto devono essere compatibili. Una precedente relazione ha dimostrato che l'iniezione di ESESC androgenetici arrestati in fase di m ha prodotto tassi di sviluppo migliori di embrioni semi-clonati rispetto all'iniezione di ESESC in fase G1 negli ovociti7. Questo rapporto suggerisce la fase M come punto di sincronizzazione adatto per la semiclonazione. Di conseguenza, i faESC sono stati arrestati mitoticamente in metafase con demecolicina e iniettati nell'ooplasma degli ovociti MII, che sono stati naturalmente arrestati nella metafase II di meiosi. È importante sottolineare che l'arresto in fase M può essere raggiunto negli ESC dei topi con alta efficienza, fornendo un'eccellente sincronizzazione tra i cicli cellulari del donatore e del ricevente.
Durante la mitosi, la membrana nucleare si rompe e si forma un mandrino a cui si attaccano i cromosomi replicati. Dopo l'iniezione di DKO-fasi M, i cromatidi sorelle vengono segregati in un corpo pseudo polare e nello zigote7 (Figura 3E). Di conseguenza, un singolo insieme di cromosomi di un DKO-phaESC contribuisce all'embrione semi-clonato. È fondamentale che le cromatidi sorelle dei cromosomi DKO-phaESC possano essere correttamente segregate dopo l'iniezione. La membrana plasmatica di un DKO-phaESC intatto previene la segregazione in un corpo pseudo polare. Abbiamo infatti osservato rari casi in cui la membrana plasmatica dei DKO-faSE non è stata interrotta e gli embrioni hanno mostrato DKO-faESC intatti nell'ooplasma dopo l'iniezione (Figura 3D). Pertanto, è necessario fare attenzione a rimuovere la membrana plasmatica dei DKO-faSCI mediante pipettazione. Durante l'iniezione, è altrettanto importante evitare l'interruzione del mandrino meiotico dell'ovocita, che potrebbe portare a difetti di segregazione cromosomici e indurre anche l'aneuploidia.
Nei mammiferi, l'imprinting genomico limita l'applicazione dei fasesci come sostituzione dello sperma. Gli haESC partenogenetici possiedono una configurazione materna delle impronte genomiche, mentre gli spermatozoi possiedono una configurazione paterna. Pertanto, la generazione di cuccioli a tempo pieno non si è verificata dopo l'iniezione di faESC di tipo selvatico come sostituzione dello sperma. Per superare questa limitazione, le eliminazioni dei DLF IG- e H19- sono progettate in fasi. La modifica dell'espressione impressa nei loci materni Igf2-H19 e Gtl2-Dlk1 è sufficiente per cambiare la configurazione delle impronte genomiche per consentire la generazione di topi semi-clonati con una frequenza superiore al 5,1%, basata su embrioni trasferiti a 2 cellule. Queste osservazioni suggeriscono che il targeting di due geni impressi commuta il genoma dei faESC in una configurazione paterna funzionale in grado di sostituire lo sperma nei topi. Tuttavia, per questa strategia è necessaria una modificazione genetica permanente dei FASC. Come strategia alternativa, si può prendere in considerazione l'haESC androgenetico. Gli haESC androgenetici derivano dal genoma dello sperma e possiedono impronte patene. Ci sono stati rapporti che gli haESC androgenetici di tipo selvatico hanno contribuito come sostituto dello sperma a generare cuccioli a lungo termine a una frequenza compresa tra l'1,3% e l'1,9%degli embrioni trasferiti 4,7,24. I cuccioli a tempo pieno sono stati ottenuti anche iniettando haESC androgenetici con deprezzazioni dei DR IG- e H19- ad una frequenza del 20,2% degli embrioni a 2 celluletrasferiti 24. L'aumento dell'efficienza della semiclonazione mediante haESC androgenetici modificati è probabilmente dovuto al fatto che le impronte possono diventare instabili nella cultura. I difetti di imprinting sono corretti dalle deiezioni genetiche dei D DMR critici.
Considerando la difficoltà di introdurre modifiche genetiche direttamente nei genomi degli ovocati o degli spermatozoi, gli ESES sono uno strumento prezioso per manipolare separatamente i genomi parentali. L'uso degli haESC come sostituto dello sperma offre un notevole vantaggio per l'editing del genoma nella linea germinale del topo. Un recente studio ha combinato l'editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 con l'applicazione di haESC per la caratterizzazione delle regioni di imprinting che sono fondamentali per lo sviluppo embrionale12. Questo studio ha analizzato il ruolo del Rasgrf1-DMR in combinazione con i DMC H19e IGnello sviluppo di topi bimaternali e la funzione di 7 diversi DMC nello sviluppo di topi bipaternali. Il metodo per sostituire gli ESESC con lo sperma ha costituito la base per approcci di screening genetico per identificare gli amminoacidi chiave all'interno della proteina DND1 nello sviluppo primordiale delle cellule germinali e per identificare i geni nellosviluppo osseo 24,25,26. Studi sull'imprinting genomico e sullo screening genetico per identificare i fattori chiave nello sviluppo embrionale sono approcci considerevoli per l'applicazione degli eSESC come genomi gametici.

Nei mammiferi, i gameti sono le uniche cellule che trasmettono informazioni genetiche alla prossima generazione. La fusione di un ovocita e di uno spermatozoo forma uno zigote diploide che si sviluppa in un animale adulto. Le mutazioni nei genomi gametici sono quindi ereditate dalla prole e guidano la variazione genetica nellaspecie 1. L'introduzione di mutazioni nella linea germinale è stata applicata per produrre animali geneticamente modificati per diversi studi biologici, tra cui la caratterizzazione della funzione genica e la modellazione delle malattie. Sia gli ovociti che gli spermatozoi sono cellule terminali differenziate e altamente specializzate che hanno cessato la proliferazione. Pertanto, la modifica diretta dei gameti è tecnicamente difficile e sono stati sviluppati approcci specializzati. Le modifiche genetiche possono essere introdotte nella linea germinale del topo mediante iniezione di ESC geneticamente modificati nelle blastocsti, dove si integrano nell'embrione in via di sviluppo e colonizzano la linea germinale. Inoltre, la modificazione genetica degli zigoti utilizzando approcci di editing del genoma, incluso il sistema CRISPR/Cas9, è diventata ampiamenteadottata 2.
Recentemente è stato segnalato un approccio eccezionale, che applica gli haESC come sostituto di un genoma gametico3,4,5,6,7,8. Gli HaESC sono linee cellulari derivate dalla massa cellulare interna delle blastoc aploidi partenogenetiche o androgenetiche e possiedono un singolo insieme di cromosomi4,7,9,10. È stato dimostrato che sia gli haESC partenogenetici che androgenetici possono contribuire al genoma dei topi semi-clonati dopo l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. A differenza di altri approcci, i genomi degli haESC possono essere modificati direttamente in coltura grazie alla loro capacità di autori ricambio. L'introduzione di modifiche genetiche nella linea germinale sostituendo lo sperma con gli eSCS è un metodo importante per gli studi biologici. Prevede la possibilità di coltura separata e manipolare il genoma materno o paterno, che derivano rispettivamente da haESC partenogenetici o androgenetici. Gli HaESC possono quindi essere usati come sostituzione del genoma gametico, il che è particolarmente vantaggioso per gli studi sull'imprinting genomico, sull'espressione specifica dell'allele e sui processi specifici dei genitori.
Nei topi, sono necessarie informazioni genomiche materne e paterna per il normale sviluppodell'embrione 11. Pertanto, i cuccioli a tempo pieno non hanno potuto essere ottenuti quando gli haESC partenogenetici di tipo selvatico (faESC) sono stati iniettati per sostituire il genoma dello sperma5,8. Per superare il blocco dello sviluppo, l'imprinting genomico del genoma materno degli haESC partenogenetici deve essere corretto in una configurazione paterna. Ciò può essere ottenuto manipolazione delle regioni metilate differenzialmente (DR). Ad oggi, sono state studiate decezioni mirate di H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR per reprimere i geni espressi maternamente nelle fasi3,5,8,12. Questi studi hanno dimostrato che le decezioni sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR sono sufficienti per convertire una materna in una configurazione di impronta paterna che può sostituire i cromosomi spermatici. L'iniezione intracitoplasmatica di faESC che trasportano le due deprezzazioni DMR in ovociti ha prodotto cuccioli semi-clonati con una frequenza compresa tra il 5,1% e il 15,5% degli embrioni a 2 cellule trasferiti.
Questo protocollo si basa sull'applicazione di faESC con soppressioni sia di H19-DMR che di IG-DMR, che noi terminiamo faESC a doppio knockout (DKO-faSEC). Forniamo istruzioni dettagliate per la modifica dell'imprinting genomico nei faESC per stabilire linee DKO-phaESC, per l'iniezione di DKO-faESC negli ovociti come sostituto di un genoma spermatico, per la coltura di embrioni semi-clonati a blastocsti e per ottenere topi semi-clonati. Questo protocollo è un riferimento per i ricercatori che richiedono una manipolazione precisa e diretta del genoma paterno e la generazione di embrioni e topi semi-clonati.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haColtura ESC</td></tr><tr><td>Tubo da 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Coltura ESC</td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>Coltura haESC</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Coltura ESC</td></tr> a <tr><td>6 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>Coltura ESC</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>Coltura ESC</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>Coltura CES</td></tr><tr><td>Frazione BSA</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>Coltura</td></tr><tr><td>ICC CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>Coltura ESC</td></tr><tr><td>Soluzione Demecolcina</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>Coltura CES</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>DR4 topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>Hepes soluzione</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>MEF irradiato</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>LIF (Fattore inibitorio della leucemia)</td> <td>(Fatto in casa)</td><td>-</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>Reagente per lipofezione</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>Pen Streptococco</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>piggyBac plasmide portatore di un transgene CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>piggyBac trasposizione plasmide</td><td>Sistema Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC coltura</td></tr><tr><td>pX330 plasmide</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haColtura ESC</td></tr><tr><td>pX458 plasmide</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haColtura ESC</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haColtura ESC</td></tr><tr><td>DNA polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>dell'acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotipizzazione</td>dell'isopropanolo</tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>della proteinasi K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotipizzazione</td></tr> del <tr><td>cloruro di sodio</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotipizzazione</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Provetta</td></tr> da <tr><td>5 mL Falcon</td><td></td><td>352063</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Provetta da 5 mL con tappo del filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>30 gauge 1/2 inch ago</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>B6D2F1 topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD salute animale</td><td>49451</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 UI</td><td>Superovulazione</td></tr><tr><td>Piastra da 10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>Piastra a 4 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>Tubo da 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>Piastra da 6 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Manipolazione</td></tr> <tr>di embrioni<td>Piatto a pozzetto centrale</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>Rocker digitale</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Manipolazione di embrioni</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Cloruro di stronzio</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Manipolazione embrionale</td></tr><tr><td>Siringa da 5 ml</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Capsula in vetro borosilicato</td><td>Prodotto scientifico</td><td>GB100T-8P</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>CellTram 4r Olio</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Holding pipetta</td><td>Strumenti biomedici-Microiniezione</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Pipetta per microiniezione</td><td>BioMedical</td><td></td> <td>Instruments-Microiniezione</td></tr><tr><td>Punte Microlaoder</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>Bracci per micromanipoli</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Estrattore</td></tr><tr><td>per micropipette per microiniezione</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microiniezione</td></tr><tr><td>PVP (Polivinilpirrolidina)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td> per microiniezione <td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microiniezione</td></tr></tbody></table>

applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Negli organismi con riproduzione sessuale, le cellule germinali sono la fonte di cellule totipotenti che si sviluppano in nuovi individui. Nei topi, la fecondazione di un ovocita da parte di uno spermatozoo crea uno zigote totipotente. Recentemente, diverse pubblicazioni hanno riferito che le cellule staminali embrionali aploidi (ESES) possono sostituire i genomi gametici e contribuire agli embrioni, che si sviluppano in topi. Qui, presentiamo un protocollo per applicare gli esHC partenogenetici come sostituto dello sperma per costruire embrioni mediante iniezione intracitoplasmatica negli ovociti. Questo protocollo consiste in fasi per preparare gli ESCS come sostituzione dello sperma, per l'iniezione di cromosomi haESC negli ovociti e per la coltura di embrioni semi-clonati. Gli embrioni possono produrre fertili topi semi-clonati dopo il trasferimento dell'embrione. L'uso degli haESC come sostituzione dello sperma facilita l'editing del genoma nella linea germinale, studi sullo sviluppo embrionale e indagini sull'imprinting genomico.

Lo scopo di questo protocollo è quello di applicare i SEBC come sostituti dello sperma per ottenere embrioni e topi semi-clonati. A tal fine, è stata generata e utilizzata una linea DKO-phaESC che trasportava il transgene CAG-EGFP per l'iniezione intracitoplasmatica negli ovociti MII. Per ottenere una linea phaESC adatta con una configurazione di impronta paterna, abbiamo eseguito ingegneria genetica utilizzando nucleasi Cas9. Una linea ESC aploide contiene cellule aploidi e diploidi che sorgono a causa di una tendenza intrinseca degli ESC aploidi per la diploidizzazione10. Un set cromosomico aploide è un prerequisito per una sostituzione riuscita del genoma dello sperma. L'analisi del contenuto di DNA mediante citometria del flusso mostra la distribuzione di cellule aploidi e diploidi nelle fasi G0/G1, S-e G2/M (Figura 2A).
Per stabilire le linee DKO-phaESC, le linee phaESC di tipo selvatico sono state trasfette con costrutti di transposon piggyBac per l'espressione transgenica stabile di EGFP e con plasmidi CRISPR / Cas9 per ottenere eliminazioni degli H19- e IG-DMR. Per escludere gli ESC diploidi e isolare solo gli ESC aploidi che esprimono EGFP, è stato definito un ordinamento specifico (Figura 2A). Le singole cellule aploidi EGFP-positive sono state quindi placcate in singoli pozzi di piastre da 96 pozzi per ottenere sub-cloni. Gli alimentatori MEF sono stati utilizzati per aumentare l'efficienza di placcatura e la sopravvivenza dei FESC trasfetati. Dopo l'espansione delle culture, un primo ciclo di genotipizzazione è stato effettuato da PCR per identificare i sotto-cloni che trasportano eliminazioni di entrambi i D DMR. Dopo che gli alimentatori MEF sono stati rimossi dalle colture, è stato eseguito un secondo genotipizzazione per confermare l'assenza di alleli di tipo selvatico all'H19- e agli IG-DMR (Figura 2B). Su un totale di 135 sotto-cloni, abbiamo ottenuto 5 linee Aploidi DKO-phESC che trasportavano gli alleli cancellati ed erano privi di alleli wildtype sia dell'H19-DMR che dell'IG-DMR.
Un transgene CAG-EGFP è stato introdotto nei DKO-feSC per studiare il loro contributo agli embrioni semi-clonati mediante visualizzazione della fluorescenza verde al microscopio (Figura 3A). Per l'iniezione intracitoplasmatica, i DKO-fasi sono stati trattati con demecolicina per arrestarli in fase M. Pertanto, il ciclo cellulare dei DKO-faESC è stato sincronizzato con quello degli ovociti MII. L'analisi della citometria del flusso ha mostrato 2 popolazioni corrispondenti all'aploide arrestato in fase G2/M (2n) e alle cellule diploidi (4n) dopo il trattamento con demecolcina(figura 3B). L'assenza del picco aploide di 1n indicava che l'arresto del ciclo cellulare era in gran parte completo. Gli ESC aploidi di fase M sono stati quindi ordinati e iniettati in ovociti. Per questo, un singolo DKO-phaESC è stato caricato nella pipetta di microiniezione e iniettato nel citoplasma di un ovocita MII (Figura 3C). La membrana plasmatica del DKO-phaESC è stata interrotta tubazione nella punta della pipetta di microiniezione.
Dopo l'iniezione, l'espressione EGFP è stata raramente rilevata negli embrioni semi-clonati costruiti poiché il citoplasma dei DKO-feSC si era disperso nel grande citoplasma dell'ovocito (Figura 3D). In rari casi, una macchia rotonda di intensa espressione EGFP potrebbe essere osservata all'interno dell'ooplasma. Questa osservazione è stata probabilmente causata dall'iniezione involontaria di DKO-faSC intatti. La mancata rottura della membrana cellulare DKO-phaESC probabilmente non è compatibile con l'ulteriore sviluppo dell'embrione e dovrebbe essere evitata. Un'ora dopo l'iniezione, gli embrioni sono stati attivati mediante trattamento con cloruro distronzio 18. Sei ore dopo l'inizio dell'attivazione, al microscopio sono stati osservati fino a 3 corpi polari(figura 3E). Questi corpi polari corrispondono al primo e al secondo corpo polare dell'ovocita e a uno pseudo corpo polare del DKO-phaESC7. Inoltre, due pronuclei sono stati osservati sotto un microscopio a contrasto di interferenza differenziale, che assomigliava allo stadio pronucleare degli zigoti dopo la normale fecondazione con lo sperma.
Per dimostrare la competenza allo sviluppo, gli embrioni semi-clonati sono stati coltivati allo stadio della blastocista(figura 5A). Inoltre, un topo a tempo pieno è stato ottenuto dopo aver trasferito embrioni semi-clonati a 2 cellule negli ovidotti di una femmina ricevente (Figura 5B). Come previsto, il topo derivato da un embrione semi-clonato era una femmina in quanto né gli ovociti né i faESC derivati dagli ovociti trasportano un cromosoma Y. Il topo semi-clonato era evidentemente normale e produceva prole sana se accoppiato con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Fino ad ora, il topo semi-clonato è vivo da oltre 600 giorni senza apparenti problemi di salute.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figura 1: Panoramica dell'applicazione dei DKO-fasi come sostituzione degli spermatozoi. (A) Un lasso di tempo delle procedure del protocollo. (B) Lo schema mostra i passaggi per stabilire le linee DKO-phaESC (passaggi da 1 a 6). (C) Lo schema mostra le misure per costruire embrioni semi-clonati mediante iniezione intracitoplasmatica di un DKO-phaESC in un ovocita MII (fasi 7-14). Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; FACS = smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza; MEF = fibroblasto embrionale del topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figura 2: Definizione di linee DKO-phaESC mediante eliminazioni mediate da CRISPR/Cas9 di DLF H19e IG. (A) Analisi citometrica del flusso dei feSC dopo la trasfezione con plasmidi piggyBac per l'espressione stabile di EGFP e con 4 plasmidi CRISPR/Cas9. Le fasi non trasfette vengono visualizzate come controllo. Il profilo del DNA (in alto) mostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule aploidi e diploidi. Le cellule aploidi della fase G1/S che esprimono EGFP sono indicate dal cancello verde (in basso, a destra). (B) Genotipizzazione dei sotto cloni phaESC coltivati su MEF (primo genotipizzazione) e dopo la rimozione dei MEF (secondo genotipizzazione). Le righe phaESC sotto-clonate 1, 2, 3 e 4 rappresentano cellule di tipo jolly, celle con eliminazione H19-DMR, con eliminazione IG-DMR e con eliminazioni combinate H19- e IG-DMR, rispettivamente. Le linee DKO-phaESC 5-8 possiedono sia eliminazioni H19-DMR che IG-DMR e sono libere da alleli wildtype. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; DMR = regione metilata differenziale; MEF = fibroblasto embrionale del topo; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; WT = tipo jolly. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figura 3: Iniezione di DKO-faESC arrestati mitoticamente negli ovociti MII. (A) Morfologia di una coltura DKO-phaESC che trasporta un transgene CAG-EGFP e cancellazioni dei DLF H19 e IG;; barra di scala = 50 μm. (B) L'analisi rappresentativa della citometria del flusso dei DKO-faSES dopo l'arresto con demecolicina per 8 h. DKO-fasi senza trattamento con demecolcina è indicata come controllo. (C) Morfologia dei DKO-faESC nella pipetta di microiniezione. Viene mostrato un singolo DKO-phaESC intatto prima (a sinistra) e dopo (a destra) rupturing della membrana plasma mediante pipettazione; barra di scala = 20 μm. (D) Embrioni costruiti a 1 h dopo l'iniezione di DKO-fasci negli ovociti MII. Viene mostrata un'immagine unita di fluorescenza EGFP e campo luminoso. Le punte di freccia nere indicano punti rotondi di intensa espressione EGFP dopo l'iniezione di DKO-feCS intatti, che dovrebbero essere evitati; barra di scala = 50 μm. (E) Viene mostrata un'immagine di contrasto di interferenza differenziale di embrioni semi-clonati 6 ore dopo l'inizio dell'attivazione con cloruro di stronzio. Le punte di freccia bianche indicano embrioni con 3 corpi polari tra cui uno pseudo corpo polare dal DKO-phaESC iniettato; barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica; EGFP = proteina fluorescente verde migliorata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figura 4: Schema dell'installazione per l'iniezione intracitoplasmatica di DKO-fasi in ovociti. (A) Viene mostrata la disposizione di una pipetta di iniezione, di una pipetta di tenuta e di un ovocita nella camera di iniezione. α, angolo di piegatura della pipetta di microiniezione. (B) Disposizione delle gocce nella parabola di micromanipolazione per iniezione intracitoplasmatica. Abbreviazioni: DKO = doppio knockout; phaESC = cellula staminale embrionale aploide partogenetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figura 5: Sviluppo di embrioni semi-clonati. (A) Sviluppo preimpianto di embrioni semi-clonati in vitro. L'espressione EGFP è inizialmente osservata negli embrioni a quattro cellule al secondo giorno dopo l'iniezione intracitoplasmatica. Al giorno 4, l'intensa espressione EGFP può essere osservata nelle blastocsti; barra di scala = 100 μm. ( B )Untopo semi-clonato ottenuto dopo il trasferimento di embrioni a 2 cellule a una femmina ricevente. A 74 dpp, il topo semi-clonato (punta di freccia) ha consegnato i suoi primi cuccioli (asterisco) per nascita naturale dopo l'accoppiamento con un maschio webster svizzero di tipo selvatico. Gli embrioni semi-clonati e il topo semi-clonato mostrato in questa figura sono identici a quelli riportati in Aizawa etal. Abbreviazioni: EGFP = proteina fluorescente verde migliorata; .dpp, giorni dopo il parto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Soluzione di gelatina</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>gelatina</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo aploide a cellule staminali embrionali (HaESC)</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 UI/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 UI/mL</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di manutenzione HaESC</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo HaESC</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Soluzione HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampone di lavaggio</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Frazione BSA</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mef medium</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-mercaptoetanolo</td>
			<td>14,3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Buffer di Lysis</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Acqua</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Soluzione SDS</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinasi K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di attivazione</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Cloruro di stronzio</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PVP</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Soluzione PMSG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">soluzione hCG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HCG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Mezzo di ialuronidasi</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentrazione di scorte</td>
			<td>Volume/peso</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>Mezzo M2</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>ialuronidasi</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abbreviazioni: LIF = fattore inibitorio della leucemia; MEF = fibroblasto embrionale del topo;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = siero bovino fetale; DMEM = Mezzo aquila modificato di Dulbecco; BSA = albumina di siero bovino;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = acido etilendiamminatetraacetico; SDS = dodecilsolfuro di sodio; EGTA = acido tetraacetico etilene-bis(ossienenitrilo);;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = salina tamponata da fosfati; PVP = polivinilpirrolidone; hCG = gonadotropina corionica umana;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = gonadotropina siere della cavalla incinta.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Ricetta di mezzo, tampone e soluzione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td colspan="2">Sequenza (da 5' a 3')</td>
			<td>applicazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotipizzazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Elenco degli oligonucleotidi.

Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Questo protocollo data erroneamente la modifica dell'imprinting genomico nelle cellule staminali embrionali di topo aploide, come quella del nostro soggetto dovuta a falsi spermatozoi, consentendo la generazione di embrioni cresciuti in casa nei topi. La modificazione genetica di un gamete richiede generalmente tecniche difficili. Utilizzando questa metodologia, i gameti parentali possono essere manipolati in cellule staminali embrionali ibride per la successiva introduzione nei topi come opzione di sostituzione dello sperma.Poiché questo metodo consente la nostra modifica artificiale specifica di un gamete paterno negli embrioni, è particolarmente applicabile allo studio dell'imprinting genomico e della cauterizzazione. A dimostrare questa procedura sarà Charles Etienne Dumeau, un embriologo di topi del mio laboratorio. Per preparare le pipette di tenuta e di microiniezione per l'esperimento, in primo luogo, utilizzare un estrattore per micropipette per estrarre capillari in vetro borosilicato con una forma allungata e una rastremazione graduale.Per preparare le pipette di contenimento, posizionare un capillare estratto con un diametro esterno compreso tra 60 e 100 micrometri in una microforgia sopra la perla di vetro sul filamento. Accendere il filamento e abbassare il capillare fino a quando non tocca il cordone. Quando il capillare si è attaccato al cordone, spegnere il filamento e ritrarre il capillare, provocando la rottura del capillare con un'estremità diritta.Quindi, posizionare la punta del capillare rotta orizzontalmente accanto alla perla di vetro sul filamento e riscaldare il filamento per sciogliere l'estremità fino a quando il diametro interno della punta del capillare raggiunge da 10 a 20 micrometri di diametro. Quindi posizionare il capillare sopra la perla di vetro a circa un millimetro dalla punta e riscaldare il filamento per consentire al capillare di essere piegato a un angolo di 20 gradi. Per preparare una pipetta per microiniezione, posizionare un capillare tirato con un diametro esterno di circa sei micrometri sopra la perla di vetro sul filamento riscaldato e abbassare il capillare fino a quando non tocca la perla.Una volta che il capillare si è attaccato, spegnere il filamento e ritrarre il capillare. Il capillare si romperà con un'estremità diritta. Quindi spostare il capillare sulla perla di vetro a circa un millimetro dalla punta del capillare e riscaldare il filamento per consentire al capillare di essere piegato a un angolo di 20 gradi.Per eseguire un'iniezione intracitoplasmatica, posizionare cinque gocce da microlitro di soluzione PVP e 20 gocce da microlitro di terreno M2 sul coperchio capovolto di un piatto da 10 centimetri e coprire le gocce con olio minerale. Posizionare il piatto sul tavolino e installare una pipetta di tenuta sul micromanipolatore. Utilizzare una punta di microcaricamento per riempire la pipetta per microiniezione con olio fluorocarbonico e montare la pipetta sull'attuatore piezoelettrico.Osservando al microscopio, immergere la pipetta per microiniezione in una goccia di soluzione PVP. Quando la pipetta è immersa, pipettare su e giù più volte per rivestire il vetro con il PVP. Caricare un piccolo volume di soluzione PVP nella pipetta per microiniezione.Immergere la microiniezione e le pipette di tenuta nel terreno M2 e concentrarsi sulla pipetta sul fondo della goccia. Trasferire circa due microlitri della sospensione di cellule ES partogeniche a doppio knockout nella goccia di terreno M2 e utilizzare una pipetta orale per trasferire 10 ovociti M2 nella stessa goccia. Ruotare un ovocita e applicare una pressione negativa attraverso la pipetta di supporto per trattenere l'ovocita in modo che lo spazio perivitellino sia rivolto verso la pipetta per microiniezione, facendo attenzione che la piastra di metafase due non sia posizionata nel percorso della pipetta per microiniezione.Aspirare una cellula ES partogenica a doppio knockout nella punta della pipetta per microiniezione e confermare la rottura della membrana cellulare. Applicare una leggera pressione negativa alla pipetta per microiniezione ed erogare quattro impulsi piezoelettrici spingendo la punta della pipetta per microiniezione verso lo spazio perivitellino per sfondare la zona pellucida. Penetrare l'ovocita con una pipetta per microiniezione in modo che l'oolemma si allunghi verso il lato opposto e applicare un impulso piezoelettrico per perforare l'oolemma, assicurandosi che l'oolemma si rilassi lungo l'asta della pipetta per microiniezione.Iniettare la cellula ES partogenica a doppio knockout con un volume minimo di terreno nell'ooplasma ed estrarre la pipetta per microiniezione senza problemi dall'ovocita. Rilasciare l'ovocita iniettato dalla pipetta di contenimento e spostarlo sul lato della micro goccia per un successivo prelievo. Quando tutti gli ovociti sono stati iniettati, trasferire gli ovociti in una capsula preriscaldata contenente terreno KSOM e incubare la capsula a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora prima dell'attivazione.L'analisi del contenuto di DNA di questa linea cellulare rappresentativa di ES parthogenica a doppio knockout, che trasporta il transgene CAG/EGFP mediante citometria a flusso, illustra la distribuzione delle cellule aploidi e diploidi nelle fasi G0, G1, S e G2 M. La genotipizzazione può essere eseguita per confermare l'assenza di alleli wild type nelle regioni H19 e metilate differenzialmente intergeniche. Un transgene CAG/EGFP può essere introdotto in cellule ES patogene a doppio knockout per studiare il loro contributo agli embrioni semi-clonati mediante la visualizzazione della fluorescenza verde al microscopio.L'analisi della citometria a flusso mostra due popolazioni corrispondenti alle cellule aploidi e diploidi arrestate nella fase G2 M dopo il trattamento con demuculcene. L'assenza di un picco aploide 1N indica che il ciclo di riposo della cellula era in gran parte completo. Dopo l'iniezione, l'espressione di EGFP è raramente rilevata negli embrioni semi-clonati costruiti.poiché il citoplasma delle cellule ES partogeniche a doppio knockout si disperde nel grande citoplasma dell'ovocita. Sei ore dopo l'attivazione è possibile osservare al microscopio fino a tre globuli polari. Il primo e il secondo globulo polare dell'ovocita e un corpo pseudopolare dell'aploide ESC.Per dimostrare la loro competenza nello sviluppo, gli embrioni semi-clonati possono essere coltivati fino allo stadio di blastociti. Inoltre, i topi femmina a termine possono essere ottenuti da embrioni semi-clonati a due stadi cellulari trasferiti negli ovidotti delle femmine riceventi. Durante la microiniezione è importante rompere la membrana plasmatica delle cellule staminali embrionali aploidi in quanto figura per prevenire la segregazione cromosomica quando l'ovocita viene attivato.Al posto delle cellule ES aploidi partenogenetiche, possono essere utilizzate anche le cellule ES aploidi androgene, consentendo di selezionare il gamete materno o paterno come sostituto dello sperma a seconda dello scopo dello studio.

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