Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Questo protocollo data erroneamente la modifica dell'imprinting genomico nelle cellule staminali embrionali di topo aploide, come quella del nostro soggetto dovuta a falsi spermatozoi, consentendo la generazione di embrioni cresciuti in casa nei topi. La modificazione genetica di un gamete richiede generalmente tecniche difficili. Utilizzando questa metodologia, i gameti parentali possono essere manipolati in cellule staminali embrionali ibride per la successiva introduzione nei topi come opzione di sostituzione dello sperma.

Poiché questo metodo consente la nostra modifica artificiale specifica di un gamete paterno negli embrioni, è particolarmente applicabile allo studio dell'imprinting genomico e della cauterizzazione. A dimostrare questa procedura sarà Charles Etienne Dumeau, un embriologo di topi del mio laboratorio. Per preparare le pipette di tenuta e di microiniezione per l'esperimento, in primo luogo, utilizzare un estrattore per micropipette per estrarre capillari in vetro borosilicato con una forma allungata e una rastremazione graduale.

Per preparare le pipette di contenimento, posizionare un capillare estratto con un diametro esterno compreso tra 60 e 100 micrometri in una microforgia sopra la perla di vetro sul filamento. Accendere il filamento e abbassare il capillare fino a quando non tocca il cordone. Quando il capillare si è attaccato al cordone, spegnere il filamento e ritrarre il capillare, provocando la rottura del capillare con un'estremità diritta.

Quindi, posizionare la punta del capillare rotta orizzontalmente accanto alla perla di vetro sul filamento e riscaldare il filamento per sciogliere l'estremità fino a quando il diametro interno della punta del capillare raggiunge da 10 a 20 micrometri di diametro. Quindi posizionare il capillare sopra la perla di vetro a circa un millimetro dalla punta e riscaldare il filamento per consentire al capillare di essere piegato a un angolo di 20 gradi. Per preparare una pipetta per microiniezione, posizionare un capillare tirato con un diametro esterno di circa sei micrometri sopra la perla di vetro sul filamento riscaldato e abbassare il capillare fino a quando non tocca la perla.

Una volta che il capillare si è attaccato, spegnere il filamento e ritrarre il capillare. Il capillare si romperà con un'estremità diritta. Quindi spostare il capillare sulla perla di vetro a circa un millimetro dalla punta del capillare e riscaldare il filamento per consentire al capillare di essere piegato a un angolo di 20 gradi.

Per eseguire un'iniezione intracitoplasmatica, posizionare cinque gocce da microlitro di soluzione PVP e 20 gocce da microlitro di terreno M2 sul coperchio capovolto di un piatto da 10 centimetri e coprire le gocce con olio minerale. Posizionare il piatto sul tavolino e installare una pipetta di tenuta sul micromanipolatore. Utilizzare una punta di microcaricamento per riempire la pipetta per microiniezione con olio fluorocarbonico e montare la pipetta sull'attuatore piezoelettrico.

Osservando al microscopio, immergere la pipetta per microiniezione in una goccia di soluzione PVP. Quando la pipetta è immersa, pipettare su e giù più volte per rivestire il vetro con il PVP. Caricare un piccolo volume di soluzione PVP nella pipetta per microiniezione.

Immergere la microiniezione e le pipette di tenuta nel terreno M2 e concentrarsi sulla pipetta sul fondo della goccia. Trasferire circa due microlitri della sospensione di cellule ES partogeniche a doppio knockout nella goccia di terreno M2 e utilizzare una pipetta orale per trasferire 10 ovociti M2 nella stessa goccia. Ruotare un ovocita e applicare una pressione negativa attraverso la pipetta di supporto per trattenere l'ovocita in modo che lo spazio perivitellino sia rivolto verso la pipetta per microiniezione, facendo attenzione che la piastra di metafase due non sia posizionata nel percorso della pipetta per microiniezione.

Aspirare una cellula ES partogenica a doppio knockout nella punta della pipetta per microiniezione e confermare la rottura della membrana cellulare. Applicare una leggera pressione negativa alla pipetta per microiniezione ed erogare quattro impulsi piezoelettrici spingendo la punta della pipetta per microiniezione verso lo spazio perivitellino per sfondare la zona pellucida. Penetrare l'ovocita con una pipetta per microiniezione in modo che l'oolemma si allunghi verso il lato opposto e applicare un impulso piezoelettrico per perforare l'oolemma, assicurandosi che l'oolemma si rilassi lungo l'asta della pipetta per microiniezione.

Iniettare la cellula ES partogenica a doppio knockout con un volume minimo di terreno nell'ooplasma ed estrarre la pipetta per microiniezione senza problemi dall'ovocita. Rilasciare l'ovocita iniettato dalla pipetta di contenimento e spostarlo sul lato della micro goccia per un successivo prelievo. Quando tutti gli ovociti sono stati iniettati, trasferire gli ovociti in una capsula preriscaldata contenente terreno KSOM e incubare la capsula a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ora prima dell'attivazione.

L'analisi del contenuto di DNA di questa linea cellulare rappresentativa di ES parthogenica a doppio knockout, che trasporta il transgene CAG/EGFP mediante citometria a flusso, illustra la distribuzione delle cellule aploidi e diploidi nelle fasi G0, G1, S e G2 M. La genotipizzazione può essere eseguita per confermare l'assenza di alleli wild type nelle regioni H19 e metilate differenzialmente intergeniche. Un transgene CAG/EGFP può essere introdotto in cellule ES patogene a doppio knockout per studiare il loro contributo agli embrioni semi-clonati mediante la visualizzazione della fluorescenza verde al microscopio.

L'analisi della citometria a flusso mostra due popolazioni corrispondenti alle cellule aploidi e diploidi arrestate nella fase G2 M dopo il trattamento con demuculcene. L'assenza di un picco aploide 1N indica che il ciclo di riposo della cellula era in gran parte completo. Dopo l'iniezione, l'espressione di EGFP è raramente rilevata negli embrioni semi-clonati costruiti.

poiché il citoplasma delle cellule ES partogeniche a doppio knockout si disperde nel grande citoplasma dell'ovocita. Sei ore dopo l'attivazione è possibile osservare al microscopio fino a tre globuli polari. Il primo e il secondo globulo polare dell'ovocita e un corpo pseudopolare dell'aploide ESC.

Per dimostrare la loro competenza nello sviluppo, gli embrioni semi-clonati possono essere coltivati fino allo stadio di blastociti. Inoltre, i topi femmina a termine possono essere ottenuti da embrioni semi-clonati a due stadi cellulari trasferiti negli ovidotti delle femmine riceventi. Durante la microiniezione è importante rompere la membrana plasmatica delle cellule staminali embrionali aploidi in quanto figura per prevenire la segregazione cromosomica quando l'ovocita viene attivato.

Al posto delle cellule ES aploidi partenogenetiche, possono essere utilizzate anche le cellule ES aploidi androgene, consentendo di selezionare il gamete materno o paterno come sostituto dello sperma a seconda dello scopo dello studio.