Modello microfluidico per imitare l'evento iniziale di neovascolarizzazione
10 aprile 2021
Qui forniamo un chip microfluidico e un sistema microfluidico di circolazione automaticamente controllato e altamente efficiente che ricapitola il microambiente iniziale della neovascolarizzazione, consentendo alle cellule endoteliali (EC) di essere stimolate da elevate sollecitazioni di taglio luminali, livello fisiologico di flusso transendoteliale e distribuzione simultanea di vari fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF).
Neovascolarizzazione, la generazione di nuovi vasi sanguigni è un processo altamente regolamentato sia in eventi normali che patologici. Per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo in microambiente cellulare naturale in vitro. Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un controllo automatico.
Circolazioni altamente efficienti vengono fatte per formare micro-tubi perfusione e simulare di utilizzare la proteina per ricapitolare all'evento iniziale di nuova vascolarizzazione. Il chip di germinazione microfluidico era costituito da tre canali. Un canale di coltura cellulare endoteliale e un canale liquido erano separati da un ampio canale centrale di idrogel.
Il sistema di controllo microfluidico era costituito da una pompa a microsiringa e da una valvola di pizzico elettromagnetica. Un chip a trappola a bolle, un chip di germinazione microfluidico, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio di mezzo di coltura. Con un sistema microfluidico, le cellule endoteliali potrebbero essere stimolate da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni vascolari del fattore di crescita endoteliale contemporaneamente.
Pipetta 20 microliter di 125 microgrammi per millilitro di fibronectina in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Tagliare una punta di pipetta per adattarsi alla porta del canale di coltura cellulare con le forbici. Inserire la punta della pipetta nell'altra porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare.
Quindi, pipettare l'aria dal canale di coltura cellulare per riempirla di fibronectina. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per un'ora. Prima della semina cellulare, pipettare 20 microliter di mezzo cellulare endoteliale in ogni porta di iniezione del mezzo e incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, pipettare tutti i supporti in tutte le porte di iniezione dei supporti. Successivamente, pipettare cinque microliter di sospensione cellulare in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Quindi, le cellule endoteliali si diffondono rapidamente su tutto il canale sotto pressione idrostatica differenziale.
Aggiungere circa quattro o sei microlitri di supporti ECM all'altra porta per regolare la pressione idrostatica e fermare lo spostamento della cella. Remote i trucioli all'incubatore di celle. Quindi, girare i trucioli ogni 30 minuti fino a quando le cellule endoteliali non si rovano intorno alla superficie interna del canale di coltura cellulare, due ore dopo.
Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere le celle attaccate nelle porte di iniezione con molta attenzione. Quindi, inserire quattro adattatori Luer femmina spinati nelle porte di iniezione dei supporti e riempire con supporti ECM. Rimuovere i chip nell'incubatore di celle, cambiare i supporti ECM e gli adattatori Luer ogni 12 ore.
Per assemblare il sistema di controllo microfluidico, preparare due tubi in politetrafluoroetilene, due tubi corti in silicone, tre lunghi tubi in silicone, un adattatore Luer femmina spinato, un connettore di tipo Y e quindi tre connettori di tipo L. Riempire la siringa con 10 millilitri di mezzo ECM preriscaldato. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene alla siringa da un adattatore Luer femmina spinato.
Quindi, collegare l'altra estremità del tubo di politetrafluoroetilene a un connettore di tipo Y. Successivamente, collegare due lunghi tubi in silicone alle altre due estremità del connettore di tipo Y. Usiamo un tubo per connetterci al serbatoio e all'altro tubo per connetterci al chip trappola a bolle.
Collegare un altro lungo tubo di silicone al serbatoio. Successivamente, utilizzare due tubi brevi in silicone per collegare tutti i fori di ingresso e uscita sullo strato superiore del chip a trappola a bolle. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene al back-end del chip.
Quindi, fissare una siringa sulla pompa a microsiringa. Agganciare due lunghi tubi in silicone alla valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita. Quindi, cambiare la valvola di avvicinamento elettromagnetica per aprire la tubazione tra la siringa e il serbatoio.
Iniettare mezzi al serbatoio utilizzando la pompa microsiringa per esaurire l'aria nel tubo. Quindi, cambiare di nuovo la valvola per aprire la tubazione tra la siringa e il chip trappola per bolle. Iniettare i supporti per riempire la camera liquida e il tubo di back-end del chip bubble trap.
Estraere i trucioli endoteliali dall'incubatrice cellulare, quindi rimuovere gli adattatori Luer sul lato della coltura cellulare. Inserire due tappi di tubo nelle porte di iniezione dell'idrogel del chip di germinazione microfluidico. Collegare il tubo back-end del chip bubble trap a una porta del canale di coltura cellulare.
Inserire un connettore di tipo T all'altra porta e collegarlo a un lungo tubo di silicio collegato al serbatoio. Agganciare il lungo tubo di silicone alla pompa micro peristaltica. Quindi, inserire un filtro dell'aria nel serbatoio.
Quindi, assemblare il chip di germinazione microfluidico nell'incubatore superiore del palco. Quindi, collegare la pompa del vuoto ai fori nello strato inferiore del chip a bolle da un tubo TPU. Impostare il volume di circolazione opposto e una portata nel programma personalizzato che controlla contemporaneamente la pompa a microsiringa e la valvola di avvicinamento delle dita elettromagnetica.
Impostare quindi la portata della pompa micro peristaltica. Accendere la pompa a microsiringa. Quindi, viene stabilito il sistema di controllo della circolazione.
Testiamo la funzione barriera di alcuni micro-vasi nel nostro modello misurando il coefficiente di permeabilità diffusionale di 40 kDa F-I-T-C destrina. Come mostrato nella figura, il coefficiente di permeabilità diffusione del chip di coltura statica con rivestimento cellulare è 0,1 più o meno 0,3 micrometri al secondo. E il coefficiente di permeabilità alla diffusione del canale vuoto senza rivestimento cellulare è di 5,4 più o meno 0,7 micrometri al secondo.
Il saggio di germinazione endoteliale ha mostrato che le cellule endoteliali germogliate nell'idrogel centrale in gran parte dopo 24 ore di lavorazione statica, mentre il grado di germogliatura è diminuito significativamente con l'aumento della sollecitazione di taglio luminare. Quantitativamente, la sollecitazione di taglio luminare ha diminuito significativamente la germinazione endoteliale in termini di area di germogliatura, lunghezza media di germogliatura e lunghezza del germoglio più lunga. Con il nostro sistema, lo stress da taglio sulle cellule endoteliali potrebbe essere facoltativamente cambiato in qualsiasi momento durante l'esperimento mentre il flusso transendoteliale è rimasto a livello fisiologico.
Questo modello biomimetico 3D in vitro può essere applicato direttamente allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene la potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening farmacologico e le applicazioni tossicologiche.
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Panoramica
Questo articolo presenta lo sviluppo di un modello microfluidico 3D in vitro che riproduce le fasi iniziali della neoangiogenesi in condizioni fisiologiche. Il modello, denominato MIEN, integra un chip microfluidico per la formazione di sprouting e un sistema di circolazione automatizzato per simulare il microambiente biomeccanico e biochimico delle cellule endoteliali (ECs) durante la neoangiogenesi precoce. Questa piattaforma consente un controllo preciso dello stress meccanico tangenziale luminale, del flusso transendoteliale e dei gradienti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fornendo uno strumento prezioso per studi meccanicistici e per lo screening di farmaci.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Biologia vascolare
- Ingegneria tissutale
- Microfluidica
Sfondo
- La neoangiogenesi è la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire dalla vascolarizzazione preesistente, un processo cruciale in contesti sia fisiologici che patologici.
- Il microambiente iniziale cui sono esposte le cellule endoteliali (ECs) durante la neoangiogenesi differisce in modo significativo rispetto alle fasi successive.
- I modelli esistenti spesso non riescono a riprodurre con precisione le condizioni biomeccaniche e biochimiche iniziali della neoangiogenesi.
- È necessario sviluppare sistemi in vitro in grado di riprodurre questi eventi iniziali per la ricerca meccanicistica e traslazionale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un modello in vitro tridimensionale che simuli il processo iniziale di neoangiogenesi in condizioni fisiologiche del microambiente.
- Permettere l'applicazione controllata di stress di taglio, flusso transendoteliale e gradienti di VEGF alle cellule endoteliali (EC).
- Fornire una piattaforma adatta per studi meccanicistici e per lo screening di farmaci o tossicologico.
Metodi Utilizzati
- Fabbricazione di un chip microfluidico per la formazione di nuovi vasi con tre canali: un canale per la coltura di cellule endoteliali, un canale centrale per l'idrogel e un canale liquido.
- Rivestimento dei canali con fibronectina e semina di cellule endoteliali per formare un endotelio confluito.
- Assemblaggio di un sistema microfluidico automatizzato di controllo comprendente siringhe e pompe peristaltiche, trappola per bolle e controllo programmabile del flusso.
- Applicazione di stress di taglio luminale controllato, flusso transendoteliale fisiologico e gradienti di VEGF.
- Valutazione della funzione di barriera del vaso mediante saggi di permeabilità con dextrano-FITC.
- Quantificazione della formazione di nuovi vasi endoteliali in condizioni variabili di stress di taglio.
Risultati principali
- Il modello ha formato con successo microcanali perfusibili ed endotelializzati, che mimano la fase iniziale di neoangiogenesi.
- La funzione di barriera è stata dimostrata da bassi coefficienti di permeabilità nei canali rivestiti di cellule rispetto ai canali vuoti.
- È stata osservata la formazione di nuovi prolungamenti endoteliali all'interno dell'idrogel dopo 24 ore di coltura statica.
- Un aumento dello stress di taglio luminale ha ridotto in modo significativo l'estensione e la lunghezza dei prolungamenti endoteliali.
- Il sistema ha permesso una modulazione dinamica dello stress di taglio mantenendo al contempo un flusso transendoteliale fisiologico.
Conclusioni
- Il modello MIEN riproduce efficacemente l'ambiente microscopico iniziale della neoangiogenesi in vitro.
- Lo stress meccanico è un regolatore chiave della formazione di nuovi vasi endoteliali in questo contesto.
- Questa piattaforma si rivela promettente per studi meccanicistici sulla neoangiogenesi e come strumento a basso costo per lo screening farmacologico e la tossicologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La modellizzazione della neovascolarizzazione in fase iniziale è fondamentale per ridurre i rischi associati alle ipotesi sui bersagli vascolari e ottimizzare l'affidabilità predittiva nei processi di scoperta di farmaci. La piattaforma microfluidica MIEN consente una simulazione precisa del microambiente vascolare iniziale, supportando l'analisi meccanicistica e la valutazione quantitativa delle risposte endoteliali. Questa capacità migliora la continuità traslazionale e orienta la selezione del portafoglio per terapie mirate ai vasi sanguigni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico dei bersagli vascolari replicando lo stress fisiologico di taglio e i gradienti di VEGF.
- Consente la validazione funzionale del comportamento delle cellule endoteliali in condizioni microambientali controllate.
- Facilita una previsione affidabile nelle ipotesi iniziali di biologia vascolare.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata e riproducibile per saggi 3D finalizzata alla valutazione degli effetti dei composti sulla formazione di nuovi vasi endoteliali.
- Genera output quantitativi come coefficienti di permeabilità e parametri morfometrici della sprouting per confronti affidabili.
- Consente lo screening su larga scala di candidati farmacologici e di profili tossicologici in un contesto fisiologicamente rilevante.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati ottenuti in vitro con meccanismi vascolari rilevanti per la malattia, migliorando le strategie traslazionali per i biomarcatori.
- Permette una continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, modellando eventi precoci di neoangiogenesi.
- Riduce l'ambiguità biologica nelle decisioni relative all'avanzamento preclinico di programmi mirati ai vasi sanguigni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello MIEN si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo la verifica di ipotesi, lo screening quantitativo e la validazione meccanicistica di bersagli vascolari.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico attraverso la manipolazione controllata del microambiente.
- Screening: Fornisce metriche quantitative e riproducibili per la valutazione dei composti e la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Offre letture sulla permeabilità e sulla formazione di nuovi vasi per confrontare condizioni sperimentali e supportare i processi decisionali.
- Ricerca traslazionale: Collega le informazioni meccanicistiche ottenute in vitro con modelli vascolari preclinici quando correlate al contesto della malattia.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per diverse applicazioni nella biologia vascolare e nello screening farmacologico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli vascolari.
- Valore operativo: Standardizza i saggi endoteliali e favorisce la riproducibilità tra diversi team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e migliora l'efficienza nell'uso del capitale riducendo i rischi nei programmi vascolari precoci.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento adeguati al rischio delle risorse mirate ai bersagli vascolari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microfluidica, coltura di cellule endoteliali e analisi quantitativa di saggi.
- Necessita dell'accesso a pompe programmabili, chip microfluidici e infrastrutture per l'analisi mediante imaging.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nella configurazione dei saggi e nell'interpretazione dei dati.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse fonti di cellule endoteliali o modelli di malattia.
- I limiti includono vincoli nella capacità di elaborazione e la necessità di una formazione tecnica specializzata.
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