Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Questo protocollo fornisce una semplice strategia per generare modelli culturali cellulari di adipociti bianchi e marroni che ricapitolano fedelmente in vitro, la fisiologia del tessuto adiposo che abbiamo in vivo. Questo protocollo consente l'isolamento simultaneo di preadipociti bianchi e marroni da topi appena nati e le cellule che isoliamo utilizzando questo metodo valutano un'elevata capacità proliferativa e potenziale di differenziazione. Le cellule isolate utilizzando questo approccio riflettono la complessità del tessuto adiposo meglio di altri modelli di coltura.

E può essere usato per studiare più accuratamente la funzione adipocite nell'obesità e nel diabete. Ci concentriamo principalmente sulla comprensione della disfunzione del tessuto adiposo nell'obesità. Tuttavia, le cellule preparate con questo metodo possono anche essere utilizzate per studiare domande di base sulle cellule nella biologia dello sviluppo.

La chiave per un esperimento riuscito è determinare come identificare i depositi di adiposi bianchi come questi depositi, che sono piccoli, ma molto ricchi e proliferano preadipociti possono essere difficili da distinguere nei cuccioli. La dimostrazione visiva illustra quanto sia semplice questo protocollo e consente di fornire suggerimenti per localizzare e sezionare i depositi adiposi bianchi e marroni. Vedere l'isolamento del deposito è molto utile.

Per raccogliere il tessuto adiposo bianco sottocutaneo, tagliare la pelle intorno all'addome di un cucciolo appena nato eutanasiato e tirare delicatamente la pelle sotto le gambe. Senza raccogliere alcun tessuto cutaneo, raccogliere con cura il deposito di grasso, che apparirà come un tessuto allungato chiaro o bianco e sottile attaccato all'interno della pelle o sopra il quadricipite. Risciacquare il deposito raccolto in PBS e posizionare il tessuto adiposo in un tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS e 200 microlitri di tampone di isolamento 2X sul ghiaccio.

Per raccogliere il tessuto adiposo marrone interscapulare, estrarre la pelle dalle scapole sopra la testa e sollevare il tessuto adiposo marrone intenso situato tra le scapole. Fare con cura incisioni intorno all'adiposo per staccarlo dal corpo e controllare il tessuto per coerenza e colore. Dopo il risciacquo, posizionare il tessuto in un secondo tubo da 1,5 millilitri contenente 250 microlitri di PBS e 200 microlitri di tampone di isolamento 2X sul ghiaccio.

Una volta raccolti tutti i depositi, utilizzare le forbici per tritare delicatamente ogni deposito da quattro a sei volte direttamente all'interno dei tubi e aggiungere 50 microlitri di collagenasi 10X in tampone di isolamento 2X a ciascun tubo. Quindi invertire rapidamente i tubi per mescolare e posizionare i tessuti in un miscelatore a temperatura controllata per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 1400 giri al minuto. Alla fine della digestione, riposizionare i tubi sul ghiaccio e filtrare i tessuti digestivi attraverso filtri cellulari da 100 micron in nuovi tubi da 50 millilitri.

Per massimizzare la resa cellulare, sciacquare ogni tubo con un millilitro di mezzo di isolamento e filtrare questo lavaggio attraverso il filtro. Diluire le soluzioni di tessuto adiposo marrone e bianco a due millilitri di sospensione tissutale per pozzo per deposito in mezzo di isolamento fresco. Quindi placcare due millilitri di sospensione del tessuto adiposo bianco a ciascuno dei quattro o sei pozzi e due millilitri di sospensione del tessuto adiposo marrone a ciascuno dei due o tre pozzali di una piastra a sei pozza attraverso un filtro da 100 micron per pozzo.

Quando tutte le cellule sono state placcate, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per 60-90 minuti. Alla fine dell'incubazione, lavare ogni bene con due millilitri di mezzo privo di siero e agitare delicatamente la piastra per staccare eventuali cellule del sangue dal fondo dei pozzi. Dopo tre lavaggi, aggiungere due millilitri di mezzo di isolamento fresco ai pozzi e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.

Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, rivestire nuove piastre di destinazione con gelatina sterile dello 0,1% in acqua distillata a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Mentre le piastre sono in incubazione, lavare le cellule con PBS prima di trattare con tripina per tre minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le celle si sono staccate, pipettare più volte la sospensione cellulare per massimizzare il recupero cellulare e trasferire le celle in un nuovo tubo.

Una volta raccolte tutte le cellule, lavare bene ogni bene con un millilitro di mezzo di isolamento e tirare i lavaggi con la sospensione cellulare. Raccogliere le cellule per centrifugazione e rimorsi il pellet in tre o cinque millilitri di mezzo di isolamento per il conteggio. Diluire le cellule alla concentrazione appropriata per la placcatura in mezzo di isolamento fresco e lavare le piastre rivestite di gelatina con PBS per rimuovere l'eccesso di gelatina.

Quindi seminare le cellule sulle piastre rivestite di gelatina e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule raggiungono la confluenza, sostituire il mezzo di isolamento con il mezzo di differenziazione. Se differenziando i preadipociti del tessuto adiposo marrone, aggiungere anche una triiodotironina nanomolare.

Dopo 48 ore, aggiornare il mezzo con il volume appropriato di mezzo di manutenzione per coltura. In questo momento, l'accumulo di piccole goccioline liquide all'interno delle cellule dovrebbe diventare visibile sotto microscopia a campo luminoso. Anche dopo il filtraggio, alcuni detriti cellulari e cellule del sangue rimangono all'interno della sospensione cellulare.

I lavaggi delicati un'ora dopo la placcatura rimuoveranno le cellule non rilevanti poiché i preadipociti si attaccano rapidamente al fondo del pozzo. Sebbene sia i preadipociti bianchi che marroni isolati dai cuccioli appena nati abbiano un'elevata capacità proliferativa, la resa dei preadipociti bianchi è generalmente il doppio di quella dei preadipociti marroni su base per deposito. Pertanto, se si desidera sincronizzare le impostazioni cultura, questa densità iniziale dei preadipociti bianchi deve essere calcolata di conseguenza.

Alla fine della differenziazione, le cellule appariranno caricate con goccioline lipidiche ed esprimeranno rispettivamente marcatori classici di adipociti bianchi e marroni. In questa analisi comparativa del consumo di ossigeno in una prova di stress mitocondriale di adipociti primari bianchi e marroni in condizioni basali, così come in risposta a stimolatori noti della funzione mitocondriale, si possono osservare queste specifiche capacità bioenergetiche di ogni tipo di cellula. Ricordate che stiamo isolando le cellule vive e che vogliamo culturerle per diversi giorni.

Quindi assicurati di mantenere condizioni sterili durante l'isolamento per evitare la contaminazione, che può compromettere la cultura successiva. Questo metodo genera adipociti completamente maturi che possono essere utilizzati per diverse applicazioni, tra cui saggi funzionali, schermi genetici o chimici o profilazione omica per studiare meccanismi autonomi delle cellule che hanno un impatto sulla funzione adipocita.