Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)
11 dicembre 2020
L'articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.
Questo metodo aiuterà a rispondere a domande chiave riguardanti la funzione fisiologica delle gonadi, incluso il ruolo degli steroidi sessuali nella plasticità del sistema neuroendocrino e nella regolazione nei teleostei e, in misura maggiore, nei vertebrati. Questo protocollo consente di eseguire la gonadectomia con un alto tasso di successo in teleostei di piccolo modello medeka, ampiamente utilizzato nella comunità di ricerca. Per avere successo e raggiungere un alto tasso di sopravvivenza, questa tecnica richiede un addestramento adeguato, in particolare nella valutazione delle gonadi e nella sutura dei pesci.
Inizia estraendo il pesce dalla soluzione anestetica e posizionandolo orizzontalmente su un lato sotto un microscopio da dissezione. Per eseguire l'ovariectomia nelle femmine, raschiare le squame nell'area dell'incisione. Praticare delicatamente un'incisione da due a 2,5 millimetri tra le costole e le pinne pelviche e anali usando una lama di rasoio.
Pizzicare delicatamente l'addome del pesce mentre si estraggono le ovaie usando una pinza fine con una punta larga. È importante evitare di rompere le costole, che possono causare la morte. Tagliare l'estremità delle ovaie con la pinza fine e metterle da parte.
Per eseguire l'orchiectomia nei maschi, praticare un'incisione tra le costole sopra l'ano e aprire lentamente l'incisione usando una pinza fine. Afferra delicatamente i testicoli con la pinza ed estraili lentamente. Quindi tagliare l'estremità dei testicoli per rimuoverli completamente.
Dopo aver eseguito la procedura, suturare l'incisione in modo simile per maschi e femmine. Posiziona il filo di nylon accanto all'area dell'incisione e pugnala la pelle dal lato destro dell'incisione attraverso la cavità interna del corpo, usando una pinza ultrasottile per prendere il filo. Quindi, perforare la pelle dal lato sinistro dell'incisione attraverso la cavità esterna del corpo per estrarre il filo.
Chiudere l'apertura dell'incisione, fare due nodi e tagliare il filo in eccesso. Metti i pesci nell'acqua di recupero isotonica e lasciali lì per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. Assemblare il cassetto del sangue attaccando un ago di vetro al capillare in silicone.
Rompere la punta dell'ago con una pinza a punta larga e rivestire l'interno dell'ago con una soluzione anticoagulante aspirando e soffiando. Dirigere l'ago verso l'area del peduncolo del pesce, mirando alla vena del peduncolo caudale, e prelevare il sangue usando la bocca fino a riempire almeno 1/4 del volume totale dell'ago. Rilascia l'ago e metti un pezzo di nastro adesivo vicino al lato affilato.
Posizionare un coperchio con un foro su una provetta di raccolta e inserire l'ago all'interno della provetta attraverso il foro con la punta dell'ago all'esterno. Metti i pesci nell'acqua di recupero e lasciali lì per almeno 24 ore prima di trasferirli nel sistema dell'acquario. Centrifugare il sangue per uno o due secondi a 1.000 volte G per raccogliere il sangue nella provetta.
Il tasso di sopravvivenza dopo ovariectomia, o OVX, nelle femmine è stato del 100% e del 94% nei maschi dopo orchiectomia. Tutti i pesci sono sopravvissuti alla procedura di prelievo del sangue. Le femmine operate con Sham hanno mostrato la posizione OV.
Tutti gli ovuli sono stati fecondati e hanno proceduto allo sviluppo embrionale. Quando la procedura di gonadectomia è stata eseguita correttamente, la forma del corpo del pesce è leggermente cambiata e non sono rimasti pezzi di gonade. L'incisione e la sutura sono completamente scomparse quattro settimane dopo la gonadectomia.
Dopo quattro mesi, tutti i pesci mostravano ancora un fenotipo sano e non è stato trovato alcun tessuto gonadico. L'analisi del sangue nelle femmine ha rivelato che il livello di E2 nei pesci OVX era significativamente più basso rispetto ai pesci operati con sham 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Dopo quattro mesi, il livello di E2 nei pesci OVX era ancora significativamente inferiore rispetto ai pesci operati con sham.
I pesci parzialmente OVX, in cui è stato rimosso solo da 1/3 a 1/2 della gonade, hanno mostrato livelli di E2 significativamente più bassi rispetto ai pesci operati con sham e livelli di E2 significativamente più alti rispetto ai pesci completamente OVX. La concentrazione di 11-KT nei maschi orchidectomizzati era significativamente inferiore rispetto ai pesci operati con sham 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Dopo quattro mesi, il livello di 11-KT era ancora inferiore a quello dei pesci operati con sham.
I pesci parzialmente orchidectomizzati hanno mostrato livelli più bassi di 11-KT rispetto ai pesci operati con sham e livelli più elevati rispetto ai pesci completamente orchidectomizzati. Per garantire il successo della procedura, è essenziale rimuovere la gonade nel modo più accurato e completo possibile, senza danneggiare altri organi all'interno del pesce. Poiché è noto che gli steroidi sessuali svolgono un ruolo importante nella plasticità del cervello e delle cellule pituitarie, questa tecnica fornisce un potente strumento per studiare i meccanismi sottostanti in piccoli modelli di teleostei.
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Panoramica
L'articolo presenta un protocollo rapido per la gonadectomia del medaka giapponese (Oryzias latipes) e il prelievo di sangue, al fine di esplorare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale. Questo metodo consente ai ricercatori di studiare efficacemente le funzioni fisiologiche delle gonadi e il loro rapporto con la plasticità neuroendocrina nei teleostei e nei vertebrati.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Tecniche di gonadectomia nei pesci teleostei
- Indagine sui ruoli fisiologici degli steroidi sessuali
- Plasticità del sistema neuroendocrino
Sfondo
- Il medaka giapponese è un modello ampiamente utilizzato nella ricerca
- Comprendere le funzioni delle gonadi è fondamentale per lo studio della fisiologia dei vertebrati
- Le tecniche precedenti presentavano tassi di sopravvivenza insufficienti
Metodi Utilizzati
- Protocolli per ovariectomia e orchidectomia
- Medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello biologico
- Tecniche di prelievo del sangue e analisi ormonale
Risultati principali
- Tasso di sopravvivenza del 100% nelle femmine e del 94% nei maschi dopo l'intervento chirurgico
- Livelli significativamente più bassi di estrogeni (E2) nei pesci ovariectomizzati rispetto ai pesci sottoposti a intervento fittizio
- Ridotti livelli di 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi orchidectomizzati
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo efficace per la gonadectomia con implicazioni per la ricerca sugli ormoni
- I risultati evidenziano il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia dei piccoli modelli teleostei
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La gonadectomia e il prelievo di sangue nel medaka giapponese consentono una riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi degli steroidi sessuali nella ricerca neuroendocrina. Questo piccolo modello teleosteo supporta la validazione degli obiettivi fornendo un'eliminazione riproducibile degli ormoni e una stabilità fenotipica. L'approccio migliora la previsione nei primi stadi della scoperta, collegando la rimozione delle gonadi a output endocrini misurabili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di retroazione ormonale derivati dalle gonadi nella regolazione neuroendocrina dei vertebrati.
- Valore operativo: Consente elevati tassi di sopravvivenza (100% femmine, 94% maschi) e l'asportazione completa delle gonadi senza tessuto residuo.
- Valore strategico: Favorisce la verifica di ipotesi sui ruoli degli steroidi sessuali nella plasticità cerebrale e pituitaria ai fini della riduzione del rischio degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce un sistema biologico validato con deplezione quantificabile di steroidi (E2 e 11-KT) per la calibrazione del saggio.
- Valore operativo: Il prelievo standardizzato di sangue dalla vena del peduncolo caudale consente misurazioni ormonali costanti tra diversi gruppi.
- Valore strategico: Permette lo screening su larga scala di composti mirati alla sintesi o alle vie di segnalazione degli steroidi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra una modellizzazione del disturbo endocrino rilevante per le malattie, con stabilità del fenotipo a lungo termine (4 mesi dopo l'intervento chirurgico).
- Valore operativo: Procedure chirurgiche e di campionamento riproducibili supportano la standardizzazione tra laboratori nei flussi di lavoro preclinici.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento con rischio calibrato, confermando l'interazione con il bersaglio attraverso variazioni dei livelli ormonali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nella biologia della scoperta per la validazione degli obiettivi guidata da ipotesi, contribuendo allo sviluppo di saggi per lo screening di modulatori endocrini.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica dei percorsi dipendenti dalle gonadi attraverso l'ablazione quantificabile degli ormoni.
- Screening: Permette la preparazione del saggio mediante prelievo standardizzato di sangue e quantificazione degli ormoni (E2, 11-KT) dopo gonadectomia.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (concentrazioni di steroidi) per confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso la soppressione sostenuta degli ormoni e il monitoraggio fenotipico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica e di campionamento riutilizzabile per studi neuroendocrini longitudinali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile della validazione del bersaglio grazie alla riduzione significativa degli ormoni (E2, 11-KT) dopo la gonadectomia.
- Valore operativo: Protocolli standardizzati di gonadectomia e prelievo ematico garantiscono riproducibilità e sopravvivenza.
- Valore strategico: Riduce l'incertezza biologica nella selezione dei bersagli neuroendocrini mediante un approccio meccanicistico di riduzione del rischio.
- Impatto sul portafoglio: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto confermando la capacità di modulazione del bersaglio in un sistema rilevante per la malattia.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze in microchirurgia e nell'identificazione delle gonadi al microscopio stereoscopico.
- È dipendente da pinzette fini, lame di rasoio, suture in nylon e aghi di vetro rivestiti con anticoagulante.
- Necessita di una standardizzazione tra i membri del team riguardo alle dimensioni dell'incisione, alla tecnica di sutura e al volume di prelievo ematico.
- L'adattamento tra specie di teleostei richiede aggiustamenti in base alle dimensioni delle gonadi e alla loro posizione anatomica.
- È limitato dalle dimensioni del pesce; non adatto per modelli che richiedono grandi volumi di sangue.
