Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

L'ulcerazione cutanea con una guarigione inadeguata delle ferite è una delle principali cause di amputazione nei pazienti umani. Un'adeguata guarigione delle ferite richiede livelli più elevati di profusione arteriosa necessari per mantenere intatta la pelle, che è compromessa nei pazienti con malattia arteriosa periferica. Molte altre condizioni reumatologiche e diabete possono anche portare a microcircolo cutaneo disturbato e inadeguato per guarire le ferite.

Molti pazienti diabetici hanno una concomitante malattia arteriosa periferica, mettendoli a rischio particolarmente elevato di amputazione. L'imaging perfusione Laser Doppler o LDPI viene utilizzato in situazioni cliniche per valutare il microcircolo cutaneo e in situazioni di ricerca per valutare il flusso sanguigno e il recupero del flusso sanguigno dopo ischemia hindlimb sperimentale, riperfusione di ischemia e lembi microchirurgici. Il sistema LDPI proietta un raggio laser a bassa potenza che viene deviato da uno specchio di scansione per muoversi su una regione di interesse.

Questo differisce dalla fluidmetria Doppler laser, che fornisce una misurazione perfusione per la piccola area del tessuto a diretto contatto con la sonda di flussometria. Quando il raggio laser interagisce con il sangue in movimento nella microvascolarizzazione, subisce uno spostamento di frequenza Doppler che viene fotodetratto dallo scanner e convertito in unità di perfusione arbitrarie. Poiché l'LDPI è una tecnica basata sulla luce, è limitata in termini di profondità di penetrazione a 0,3-1 millimetro, il che significa che per la maggior parte viene valutata la perfusione dermica.

Il flusso dermico può essere alterato dalla temperatura della pelle e dal sistema nervoso simpatico, che può essere influenzato da vari agenti anestetici. Le misurazioni del laser ottico sono influenzate anche dalle condizioni di illuminazione ambientale, dalla pigmentazione della pelle e possono essere bloccate sovrascriendo pellicce o capelli. LDPI è la tecnica di ricerca più comunemente utilizzata per monitorare il recupero delle profusione dopo l'ischemia perché non invasiva, non richiede la somministrazione del contrasto e ha tempi di scansione rapidi che consentono la raccolta dei dati su più animali.

Questo lo rende ideale per aiutare a determinare se i trattamenti mirati all'arteriogenesi terapeutica o all'angiogenesi sono efficaci nei piccoli modelli animali. Il recupero del flusso sanguigno dopo l'ischemia dell'arto posteriore misurato dall'LDPI è ben correlato con lo sviluppo collaterale dell'arteria se valutato con altri mezzi come la fusione di microcompimento o la microTC. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare la valutazione della perfusione dell'ostacolo utilizzando l'LDPI. Regolare l'altezza dello scanner in modo che la distanza dal soggetto della scansione sia di circa 30 centimetri.

Accendere l'imager e avviare il software associato. Aprire il programma di misurazione. Se il software comunica correttamente con lo scanner, verrà visualizzato l'avviso di accendersi del laser a infrarossi.

Regolare le impostazioni dello scanner in modo che siano appropriate per il materiale di sfondo e la configurazione dell'illuminazione nella stanza. Impostate la soglia di sfondo puntando il raggio laser sul materiale di sfondo nero e premete Auto BK Set. Impostare la camera di induzione dell'isoflurane con un'adeguata scavenging dei gas di scarico.

Posizionare la camera di induzione su un tampone riscaldante aiuterà a prevenire la perdita di temperatura del topo durante l'induzione dell'anestesia. Accendere la coperta omeotermica, che viene posizionata nell'area di scansione sotto una superficie non riflettente. In questo caso, un tessuto in neoprene nero.

La coperta omeotermica è impostata per mantenere una temperatura corporea di 37 gradi Celsius. Posizionare la sonda di temperatura e i lubrificanti in modo che siano pronti per l'inserimento. Posizionare anche la maschera facciale per anestesia e il sistema di scavenging nell'area di scansione.

Anestetizzare il mouse con un vaporizzatore di isoflurane. La velocità dell'ossigeno è impostata su un litro al minuto di flusso. E l'isoflurana viene regolata al 4% per l'induzione dell'anestesia.

Il flusso viene acceso alla camera di induzione dell'anestesia e la frequenza di respirazione del topo rallenterà. Un'anestesia adeguata si ottiene quando il topo perde il riflesso di destro. Trasferire il mouse in un cono nasale della maschera anestetica con spazzino di gas di scarico collegato e regolare l'isoflurane all'1,5%Questo livello di anestesia è generalmente adeguato per mantenere il topo relativamente fermo durante la scansione, ma non è destinato a fornire livelli chirurgici di anestesia.

Quindi la profondità dell'anestesia non viene controllata. La modifica del livello di isoflurane causa cambiamenti nella frequenza cardiaca, nella respirazione e nella profusione dermica. Quindi una percentuale costante dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi esperimento di corso di tempo e per tutte le materie sperimentali.

Possono essere utilizzate anche tecniche anestetiche alternative, come l'iniezione IP di chetamina xiazina, ma la stessa tecnica anestetica dovrebbe essere utilizzata durante qualsiasi studio del corso in qualsiasi momento poiché diversi anestetici influenzano la profusione dermica in modo diverso. Se la regione di interesse del piano da scansionare è coperta da pelliccia, utilizzare un piccolo trimmer elettrico e / o crema depilatoria per rimuovere i capelli dalla regione di interesse. Le creme depilatorie devono essere completamente rimosse e la pelle del mouse asciugata prima della scansione poiché la pelle bagnata può causare riflessi dal laser Inserire la sonda di temperatura rettale lubrificata associata alla coperta omeotermica nel retto del mouse.

Equilibrare la temperatura del mouse per desiderare la temperatura di scansione, 37 gradi Celsius. Questo può richiedere fino a cinque-10 minuti. Selezionare Configurazione scanner a cui è possibile accedere dal menu in alto o dall'icona Configurazione scanner.

L'area di scansione deve essere regolata modificando le coordinate X, Y per adattarsi alla regione di interesse. La velocità di scansione dipenderà dalla risoluzione della scansione. Una risoluzione più elevata comporterà tempi di scansione più lunghi.

Per la scansione ripetuta, concentrandosi sulla profusione globale, anziché su una maggiore risoluzione incentrata sulla perfusione anatomica, la velocità di scansione più elevata di quattro millisecondi per pixel è adeguata. Se si eseguono scansioni ripetute, selezionare la scheda Ripeti e Scansione linea. Il numero di scansioni può essere modificato.

In questo caso, tre scansioni e l'intervallo di ripetizione. Il tempo minimo per l'intervallo di ripetizione sarebbero i tempi di scansione stimati visualizzati nell'area disattivata a destra della casella, determinati dall'area di scansione e dalla risoluzione della scansione. L'aggiunta di alcuni secondi consente all'utente di mettere in pausa e potenzialmente riposizionare il mouse, se necessario, tra le scansioni.

Il tempo totale di scansione in questo caso è di tre minuti e 21 secondi. Selezionare la scheda Analisi immagine e selezionare il pulsante Segna. Ciò farà sì che il laser condisca l'area di scansione.

Regolare la posizione del mouse in modo che la destinazione da scansionare si trova all'interno dell'area contrassegnata. Iniziare la misurazione ripetuta selezionando l'icona Ripeti scansione e premendo il pulsante Riproduci per avviare la scansione. Verrà visualizzata una finestra popup che conferma la distanza di scansione.

Fare clic su OK per avviare la scansione. La scansione iniziale di un topo prima dell'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore è mostrata in tempo reale. La seconda e la terza scansione ripetuta sono accelerate a una velocità di 16x.

La finestra principale mostra i risultati della scansione man mano che viene generata dal software. L'inserto in basso a destra mostra il laser che scansiona i footpad del mouse. Per la scansione del pedante o del piede e del polpaccio dorsale, il posizionamento incline con gli arti posteriori estesi verso la coda fornisce una regione di interesse più coerente nel posizionamento supino.

L'arteria femorale, l'arteria safene e i collaterali sono molto vicini alla superficie ventrale della coscia e del polpaccio. Quindi il posizionamento supina è preferito se si utilizzano queste regioni di interesse. Monitorare il mouse durante la scansione per il movimento del mouse.

Se il mouse si muove a sufficienza in modo che i footpad non si trovano più nell'area di scansione nel mezzo di una scansione, riavviare la scansione. Piccole variazioni nella posizione del footpad del mouse possono essere ospitate per il software di analisi. Inoltre, monitorare la temperatura del mouse durante il processo di scansione in quanto può fluttuare anche con l'uso della coperta omeotermica.

Se c'è troppa variazione nella temperatura del mouse, ciò potrebbe comportare variazioni significative tra le scansioni. Generalmente, un intervallo di temperatura da 36,8 a 37,2 si tradurrà in dati accettabili. Salvare l'analisi acquisita nella finestra Salva con nome con un nome di file che include l'identificatore del mouse e il punto di tempo per un'analisi dei dati più semplice.

Immettere i dettagli del mouse e del punto di ora, se lo si desidera, nella finestra Dettagli oggetto. La scansione ventrale dell'arto posteriore con il mouse in posizione supina viene mostrata qui dopo aver regolato l'area di scansione. Si noti che la proposta con la supina del mouse comporta la scansione di una parte variabile del lato del piede.

Rimuovere la sonda di temperatura rettale e disinfettarla con il 70% di etanolo in modo che sia pronta per il mouse successivo. Ridurre l'isoflurane allo 0%Il mouse si riprenderà più velocemente se continua a ricevere ossigeno, ma può anche essere recuperato senza ossigeno supplementare. Lasciare che il mouse si riprenda dall'anestesia al punto in cui mostra un riflesso di destro lanciandosi dalla posizione supina alla posizione prona prima di restituirlo alla gabbia.

Il recupero può essere effettuato su una coperta riscaldante per isoflurane, poiché il recupero è molto rapido o in una gabbia di recupero calda per la xirazina ketamina. Aprire il programma software di revisione dell'imaging. Si aprirà una nuova finestra per esaminare le scansioni.

Passare al menu File, Aprire e individuare il file salvato. Selezionare l'icona ROI dalla barra degli strumenti. Selezionare l'icona Aggiungi poligono.

Tracciare un'area intorno all'area di interesse utilizzando il mouse. Al termine, tornare alla barra degli strumenti e selezionare l'icona Statistiche. Verrà visualizzata una finestra che mostra le statistiche della regione di interesse.

Durante la revisione dei dati, i valori medi dell'unità di profusione, o PU, non variano da 100 a 150 PC rispetto alle scansioni ripetute per ogni pedino. Questa è una scansione accettabile e indica che il mouse è stato ben equilibrato durante la scansione. Valori medi di PU con variazione maggiore di 100-150 PU, che corrisponde a più del 10% della perfusione media per un pedante del mouse non azionato sulle scansioni ripetute, indicherebbero che il mouse non era ben equilibrato e si suggerisce vivamente una scansione ripetuta.

L'esecuzione di un'analisi rapida immediatamente dopo il completamento della scansione consente di eseguire una scansione ripetuta mentre il mouse è ancora anestetizzato ed evitare di perdere un punto dati che potrebbe verificarsi se le scansioni vengono analizzate in un secondo momento e una scansione è ritenuta inaccettabile a causa di una variazione significativa tra le scansioni ripetute. I risultati sono espressi come un rapporto tra la profusione chirurgica dell'arto posteriore sulla perfusione dell'arto posteriore di controllo poiché i topi inizialmente vasodilati e quindi sviluppano i loro collaterali intrinseci, il recupero del flusso sanguigno da parte dell'LDPI dovrebbe essere visto durante un corso di tempo post-operatorio. Il grado di recupero dipende dallo sforzo del mouse e dalla gravità del modello di ischemia dell'arto posteriore.

Questa figura mostra un esperimento del corso di tempo completato per 28 giorni in cui l'LDPI è stato utilizzato per misurare il recupero del flusso sanguigno del piede nel tempo dopo la legatura dell'arteria femorale e i topi knockout P27 e selvatici di tipo C57Bl / 6. Entrambi i knockout P27 nei topi di tipo selvatico avevano alterato il recupero del flusso sanguigno quando trattati con doxiciclina orale, un inibitore della metalloproteinasi a matrice generalizzata, suggerendo che l'attività MMP facilita l'arteriogenesi. La configurazione del guadagno e la soglia di sfondo devono essere mantenute costanti per l'intero esperimento del corso di tempo.

Se la soglia di sfondo è impostata su un valore troppo basso, la scansione del materiale di sfondo comporterà bassi valori di profusione. Ciò comporterà una media dei valori di profusione in background nella regione di interesse durante la selezione del poligono. Per eliminare questo problema, la soglia di sfondo può essere regolata nella finestra Configurazione scanner nella scheda Generale.

In questo caso, l'aumento della soglia di fondo a 118 unità di profusione comporta lo sfondo grigio che non sarà incluso in alcuna analisi. La tavolozza o la scala dei colori per l'immagine di flusso può essere regolata sia nel software di misurazione che nel software di revisione dell'immagine. Tutti i valori di profusione maggiori del valore massimo sulla scala verranno visualizzati come il colore di profusione più alto.

In questo caso, rosso. L'aumento dell'intervallo dinamico, ad esempio, la modifica della scala da zero a 1500 renderà la variazione di scansione ripetuta più ovvia per l'occhio poiché le aree che misurano tra 1000 e 1500 unità di profusione verranno ora visualizzate utilizzando il gradiente di colore anziché essere tutte visualizzate come rosse. La scansione qui mostrata è stata ottenuta in un mouse la cui temperatura corporea interna era inizialmente inferiore a 36,8 all'inizio della scansione ripetuta e poi aumentata durante le scansioni ripetute.

Si noti che la profusione media del footpad di controllo è stata più effettuata dalla temperatura corporea interna più fredda rispetto al pedante ischemico. Una singola scansione della temperatura corporea più fredda avrebbe comportato la registrazione di un rapporto di profusione più elevato per questo punto dati. La variazione della pigmentazione della pelle del topo, come si può vedere con i topi C57Bl/6, può comportare che l'area di scansione sia al di sotto del valore soglia di fondo, il che renderà difficile l'analisi delle regioni di interesse contenenti aree pigmentate.

I pedpad del mouse in generale non hanno iperpigmentazione, rendendo questa l'area più conveniente da scansionare per questo affaticamento del mouse. Se il ricercatore desidera studiare l'arto posteriore ventrale, è necessario selezionare un ceppo di topo bianco. LDPI è un metodo efficace, facilmente eseguibile e ripetibile per misurare la profusione dermica posteriore come riflesso della perfusione arteriosa complessiva.

È necessaria una tecnica coerente quando si utilizza LDPI per ottenere dati affidabili.