Fabbricazione di piattaforme magnetiche per l'organizzazione su scala micron di neuroni interconnessi

Il nostro approccio consente di controllare la formazione di reti neurali utilizzando manipolazioni magnetiche. Si tratta di uno strumento efficace per gli studi in vitro sulle reti e offre una nuova direzione terapeutica per i dispositivi di biointerfazione. Con questa tecnica possiamo controllare sia la posizione della cellula che la crescita su scala micron, consentendo un design flessibile del modello magnetico e quindi dell'organizzazione di rete.

Uno sterilottico a nanoparticella magnetica efficiente e atossico è fondamentale. Per avere successo, sono necessarie adeguate nanoparticelle magnetiche. Le caratteristiche importanti sono le dimensioni, il rivestimento e il valore di magnetizzazione della situazione.

A dimostrare le procedure saranno Reut Plen e Dafna Levenberg, studenti magi- master per il mio laboratorio. Per iniziare, tagliare le diapositive di vetro in pezzi di due per due centimetri usando una penna scriber. Pulire i vetrini in acetone e quindi isopropanolo per cinque minuti ciascuno in un bagno ad ultrasuoni.

Quindi asciugarli con azoto ad altissima purezza. Rivestire il vetro con fotoresist utilizzando il rivestimento a rotazione a 6.000 giri/min per 60 secondi per raggiungere uno spessore di 1,5 micrometri e cuocere 100 gradi Celsius per 60 secondi. Esporre il campione a una sorgente luminosa utilizzando una fotomaschera o una litografia senza maschera per ottenere il modello desiderato.

Sviluppare il campione per 40 secondi in uno sviluppatore diluito in acqua distillata secondo le istruzioni del produttore. Quindi lavarlo in acqua per 45 secondi e asciugarlo con gas azoto UHP. Ispezionare il modello al microscopio ottico.

Inserire il campione nella camera di blocco del carico del sistema di deposizione e attendere la pressione di base. Trasferire il campione nella camera principale e impostare il campione all'altezza appropriata per la deposizione. Aumentare la potenza su ogni bersaglio fino a raggiungere la velocità desiderata.

Attivare la rotazione, quindi depositare il multistrato ferromagnetico, alternando i bersagli di cobalto, ferro e palladio aprendo e chiudendo rispettivamente le persiane bersaglio. Deposita 14 bistrati di palladio di ferro cobalto e termina con un ulteriore strato di tappatura del palladio. Al termine della deposizione, scaricare il campione dal sistema di deposizione.

Immergere il campione in acetone per 30 minuti e risciacquarlo con isopropanolo. Quindi asciugarlo con azoto UHP ed esaminarlo al microscopio. Conservalo in un ambiente pulito e asciutto fino all'uso.

Utilizzare uno scivolo di vetro con una barra magnetica a forma di croce di 100 micrometri di larghezza depositata con multistrati ferromagnetici. Collegare il campione al supporto utilizzando nastro a doppia lato. Utilizzare un legante di filo per legare quattro fili al campione, uno su ogni gamba dell'elettrodo incrociato.

Impostare il portacampioni e il campione all'interno del sistema di misurazione del trasporto con un campo magnetico in modo che il campo magnetico sia perpendicolare al campione. Eseguire misurazioni trasversali della tensione come descritto nel manoscritto testuale. Spazzare il campo magnetico e misurare la tensione trasversale in funzione del campo.

Tracciare la resistenza trasversale in funzione del campo magnetico per determinare il segnale anomalo di Hall, che è proporzionale alla magnetizzazione perpendicolare nella pellicola. Preparare il mezzo di crescita di base e il mezzo di differenziazione per la coltura cellulare PC12 come descritto nel manoscritto di testo. Coltivare cellule in un pallone da coltura non trattato con 10 millilitri di mezzo di crescita di base, aggiungendo 10 millilitri di mezzo al pallone ogni due o tre giorni.

Sottocultura delle cellule dopo otto giorni. Per l'assorbimento cellulare, centrifugare la sospensione cellulare per otto minuti a 200 G e temperatura ambiente, quindi scartare il supernatante. Rimosovano le cellule in tre millilitri di nuovo mezzo di crescita di base.

Centrifugare nuovamente le cellule per cinque minuti, quindi scartare il supernatante e rimescolare le cellule in tre millilitri di mezzo di differenziazione fresco. Aspirare le cellule 10 volte usando una siringa e un ago per rompere i grappoli cellulari, quindi contare le cellule usando un emocitometro e seminare un milione di cellule in un piatto regolare, non rivestito di 35 millimetri. Aggiungere il volume calcolato di sospensione MNP e mezzo di differenziazione al piatto per ottenere la concentrazione MNP desiderata.

Mescolare le cellule, gli MNP e il mezzo di differenziazione, quindi incubare il piatto in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 24 ore. Pulire il substrato modellato con il 70% di etanolo e posizionare in un piatto di coltura di 35 millimetri nel cappuccio. Posizionare un grande magnete sotto il substrato modellato per un minuto, quindi rimuoverlo spostando il piatto su e via e togliendo il magnete dal cappuccio.

Accendere la luce ultravioletta per 15 minuti. Per preparare un substrato di vetro rivestito di collagene, diluire il collagene di tipo uno con un rapporto uno-50 in etanolo al 30%. Coprire il vetro con la soluzione.

Lasciare il piatto scoperto nel cappuccio per quattro ore fino a quando tutta la soluzione evapora, quindi lavarlo tre volte in PBS sterile. Rimuovere le cellule dall'incubatrice, centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti a 200 G e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo di differenziazione fresco e contare le cellule usando un emocitometro.

Seme 10 alle cinque cellule in cima al substrato in un piatto di coltura di 35 millimetri e aggiungere due millilitri di mezzo di differenziazione. Incubare la coltura in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, aggiungere uno a 100 beta-NGF murino fresco alle cellule.

Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere beta-NGF fresco ogni due giorni. Immagini le cellule ogni due giorni usando la microscopia ottica ed esegui l'immunostaining sulle cellule dopo la formazione della rete. Piattaforme magnetiche con diverse forme geometriche sono state fabbricate e gli MNP fluorescenti in ossido di ferro sono stati sintetizzati dalla nucleazione.

Le misurazioni magnetometriche degli MNP mostrano che la curva di magnetizzazione non aveva isteresi, un campo di bassa saturazione e una saturazione di magnetizzazione relativamente elevata. Le cellule PC12 sono state incubate in mezzo mescolate con gli MNP fluorescenti ad ossido di ferro, trasformandole in unità magnetiche. I MNP sono stati interiorizzati nel soma delle cellule, ma non nei nuclei.

La concentrazione di ferro all'interno delle cellule è aumentata con l'aumento della concentrazione di MNP nel mezzo. La vitalità delle cellule PC12 caricate da MNP per diverse concentrazioni di MNP è stata valutata confrontando i parametri morfologici delle celle caricate MNP utilizzando l'analisi Shoal, non mostrando alcuna differenza rispetto alle celle di controllo. I test basati su XTT e Resazurin hanno confermato che le concentrazioni valutate di MNP non hanno mostrato una citotossicità significativa verso le cellule.

Le cellule PC12 con e senza trattamento MNP sono state coltivate e differenziate su un substrato magnetico. Le cellule magnetizzate sono state trovate per attaccarsi ai modelli magnetici e far crescere i rami secondo i modelli, mentre le cellule senza trattamento MNP sono cresciute senza affinità con i dispositivi magnetici. Qui viene mostrato il posizionamento delle cellule su un substrato con geometria esagonale.

Il 75% dei corpi cellulari carichi di MNP era in contatto con le strisce magnetiche, mentre solo il 35% delle celle nonmagnetizzate si trovava sulle strisce. Oltre all'effetto di posizionamento cellulare, queste piattaforme magnetiche sono state trovate per controllare la direzionalità dei neuriti in crescita. Per valutare l'effetto magnetico sulla direzionalità della crescita neuronale, è stato misurato l'angolo tra i neuriti e le strisce magnetiche, mostrando una correlazione significativa con l'orientamento delle strisce magnetiche.

Questa procedura è facilmente adattabile per dirigere composti attivi, come i farmaci, dopo averli coniugati a nanoparticelle magnetiche. Il può essere tradotto in test di screening dei farmaci ad alta produttività o trattamento locale all'interno dei tessuti. Questo nuovo approccio apre nuove possibilità per funzionalizzare altri substrati o dispositivi aggiungendo strutture magnetiche attraenti.

Attualmente, stiamo sviluppando interfacce di chip neuronali biocompatibili migliorate.