Name: Ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri l'ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per analizzare interazioni genomiche con il nucleoscheletro. Questo metodo economico permette di visualizzare cromosomi, telomeri e loci genici in cellule di cancro e progeria.

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Vorremmo ringraziare il Prof. Michael Bittner per il gentile dono delle sonde per la pittura del braccio cromosomico. LG è stato sostenuto dal progetto EURO-Laminopathies, finanziato dall'UE, e dal Brunel Progeria Research Fund.

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo dell'alone di DNA è un metodo eccellente di scelta quando si analizzano le interazioni tra il nucleoscheletro e il genoma, tuttavia, ci sono anche alcuni passaggi critici che devono essere rispettati. Uno dei parametri più importanti è l'ottimizzazione della densità di semina cellulare. Se le cellule diventano troppo confluenti, gli aloni di DNA si sovrapporranno alle cellule vicine rendendo impossibile eseguire l'analisi. Il CSK e i tamponi di estrazione devono essere sempre fatti freschi il giorno dell'uso con spermina, spermidina e digitonina aggiunte al tampone di estrazione alla fine del processo di preparazione per mantenere la loro attività biologica. Se si esegue Halo-FISH è estremamente importante utilizzare la corretta temperatura di denaturazione degli aloni di DNA per consentire alla sonda o alla vernice di ibridarsi successivamente.
La microscopia elettronica è stata utilizzata per visualizzare la matrice nucleare, con strutture filamentose identificate20. Tuttavia, la microscopia elettronica è limitata in quanto le associazioni della matrice con la cromatina non possono essere facilmente dedotte. In effetti, il metodo dell'alone del DNA è più versatile rispetto alla microscopia elettronica poiché è possibile esaminare geni, cromosomi e stati cellulari specifici. Inoltre, l'analisi proteomica delle proteine della matrice nucleare è in fase di studio21,22. Questo metodo è utile per confrontare i componenti della matrice nucleare, in particolare quando si confrontano le cellule malate, tuttavia, non fornisce la distribuzione spaziale e gli attaccamenti evidenziati dalla tecnica standard dell'alone del DNA.
I test dell'alone del DNA hanno dei limiti. In primo luogo, poiché la matrice viene estratta, questo può essere eseguito solo su cellule fisse, quindi l'imaging dal vivo non è possibile. Sebbene il metodo DNA Halo sia relativamente veloce e facile da eseguire, il processo complessivo può richiedere molto tempo quando si tiene conto della coltura cellulare, della generazione di sonde, dell'Halo-FISH e dell'analisi.
L'acquisizione di immagini di aloni di DNA e HALO-FISH utilizzando la microscopia a super-risoluzione migliorerebbe notevolmente la risoluzione delle sonde e degli anticorpi specifici del DNA. Inoltre, poiché i fluorocromi possono essere risolti spettralmente più facilmente, potrebbe essere possibile utilizzare un certo numero di sonde di DNA in un singolo esperimento, fornendo ancora più informazioni. Miglioramenti nelle tecniche di biologia molecolare come la cattura della conformazione cromosomica (3C) sono stati utilizzati per determinare le interazioni dei loci genici e analizzare l'organizzazione spaziale della cromatina nella cellula. I saggi di DNA Halo e 3C possono essere combinati, un termine noto come M3C23, dimostrando ancora una volta l'adattabilità della tecnica DNA Halo.
I dati originali presentati qui servono a dimostrare le possibilità di interrogare il comportamento del genoma e come presentare tali dati. Con questi dati abbiamo dimostrato che è possibile determinare differenze significative nell'attaccamento del genoma utilizzando (1) sonde di pittura cromosomica, in questo studio rivelando che il cromosoma 18 è il cromosoma meno attaccato tra quelli analizzati (Figura 3); (2) Loci genici con differenze significative tra due loci genici e (Figura 4) (3) Telomeri, che sono meno fortemente attaccati nelle cellule quiescenti rispetto alle cellule proliferanti e senescenti (Figura 5). Siamo in grado di distinguere tra cellule proliferanti e non proliferanti attraverso la presenza dell'antigene marcatore di proliferazione Ki67 che è una proteina insolubile quindi rimane con i nuclei residui o utilizzando l'incorporazione di nucleotidi per evidenziare le cellule che hanno attraversato la fase S entro un periodo di tempo specifico (Figura 2). Questa tecnica ci ha anche permesso di analizzare il comportamento del genoma in cellule che sono compromesse nei loro nucleoscheletri, cioè cellule di lamininopatia e qui e in Bikkul et al., 2018 riveliamo che il genoma può essere meno strettamente attaccato rispetto alle cellule di controllo e può essere ripristinato quando trattato con farmaci specifici che migliorano l'effetto della mutazione della lamina A nelle cellule HGPS classiche15. Tuttavia, mostriamo qui nuovi dati per le cellule HGPS atipiche AGO8466, prive di una mutazione della lamina A ma contenenti una forma insolita della proteina del complesso LINC SUN119 in cui il cromosoma 13 è meno strettamente attaccato (Figura 6).
HALO-FISH è un metodo unico che consente lo studio delle interazioni genomiche con il nucleoscheletro in combinazione con l'immunofluorescenza indiretta per risolvere le proteine non rimosse dalla procedura di estrazione. È stato dimostrato che il nucleoscheletro è modificato in varie malattie come alcuni tipi di cancro19 e l'importanza di alcune proteine associate al nucleoscheletro come biomarcatori diagnostici24,25. Pertanto, questa tecnica ha un ruolo importante nell'esaminare l'effetto del nucleoscheletro sull'organizzazione/disorganizzazione della cromatina nella malattia 15,24,25,27 e non è limitata alle cellule umane, con sonde di pittura cromosomica di altri animali, lo stesso protocollo DNA-alone potrebbe essere impiegato 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

La "matrice nucleare" fu descritta per la prima volta da Berezney e Coffey nel 19741. Dopo aver eseguito estrazioni con elevate molarità saline e trattamento con nucleasi su nuclei di fegato di ratto, hanno identificato una struttura strutturale proteica. La procedura dell'alone di DNA è stata successivamente adattata da questo metodo e comporta la rimozione di proteine solubili in modo che persistano solo la matrice nucleare (NM) e le proteine e i cromosomi associati alla NM. Le regioni di attaccamento del DNA si trovano alla base dei circuiti di DNA e sono chiamate regioni attaccate alla matrice (MAR) o regioni di attacco dell'impalcatura (SAR), che sono resistenti all'estrazione con alte concentrazioni di sale e detergente ionico litio-3,5-diiodosalicilato (LIS) rispettivamente. Negli aloni di DNA, il DNA associato a MAR/SAR è legato all'interno del nucleo residuo mentre le anse di DNA si estendono lontano da questi siti e formano l'alone di DNA. Ora sappiamo che il genoma è ancorato attraverso domini associati alla lamina (LAD) alla lamina nucleare e attraverso regioni nucleolari associate (NAD) e possibilmente attraverso altre strutture nucleari come specifici corpi nucleari.
Il metodo dell'alone di DNA può essere utilizzato per la mappatura fisica del DNA, dei geni e delle regioni cromosomiche poiché il DNA esteso e la cromatina forniscono una risoluzione maggiore perché la cromatina viene spogliata degli istoni e il DNA viene allungato 2,3,4,5,6. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni quando si utilizzano aloni di DNA per questa applicazione. Ad esempio, il DNA strettamente associato ai nuclei residui degli aloni di DNA può essere inaccessibile alle sonde, precludendogli così l'analisi e la mappatura fisica6. Altre tecniche come il fiber-FISH 2,4,5,7 e la pettinatura molecolare 8 consentono anche la mappatura fisica e hanno il vantaggio di essere relativamente veloci e facili da eseguire. Entrambi sono utilizzati preferenzialmente per la mappatura del DNA dei geni rispetto agli aloni di DNA. Questi metodi estraggono le fibre della cromatina attraverso l'uso di estrazioni di solventi o sali dal nucleo, tuttavia, la pettinatura molecolare tende ad avere una migliore riproducibilità 8,9.
Vi è una crescente evidenza che il nucleoscheletro ha un ruolo nel supportare processi nucleari chiave, come i siti di attaccamento per il DNA, il rimodellamento della cromatina, la trascrizione del DNA, la riparazione del DNA e la replicazione del DNA11,12. Come tale, la tecnica dell'alone di DNA è stata sviluppata per studiare le interazioni tra il nucleoscheletro e il genoma durante queste attività cellulari ed è stata regolarmente utilizzata e riportata nella ricerca. Questa tecnica è stata utilizzata anche per studiare le interazioni tra il genoma e il nucleoscheletro in relazione alla progressione della malattia con cambiamenti associati alla malignità nella struttura nucleare identificati11.
La tecnica dell'alone di DNA è stata utilizzata anche per studiare la relazione tra il genoma e il nucleoscheletro durante lo sviluppo e la differenziazione12. Numerosi studi hanno utilizzato una variazione della tecnica dell'alone di DNA nota come alosperma13 o SpermHalo-FISH se accoppiato con FISH14. La cromatina degli spermatozoi è strettamente legata alle proteine note come protamine e questa tecnica è stata sviluppata per migliorare l'accesso al DNA degli spermatozoi. Halosperm è stato utilizzato per studiare l'integrità del DNA degli spermatozoi e determinare se il danno al DNA è presente. Gli spermatozoi con meno danni al DNA sono correlati a una dimensione dell'alone di DNA più grande, mentre gli spermatozoi con livelli aumentati di DNA frammentato e danneggiato avevano aloni piccoli o nessuno. Pertanto, l'alosperma può essere utilizzato come potenziale marcatore prognostico della qualità embrionale e della gravidanza di successo con la fecondazione in vitro13. Questo esempio sottolinea le potenziali applicazioni cliniche di questa tecnica. Nel nostro lavoro abbiamo utilizzato HALO-FISH per valutare i cambiamenti nel comportamento del genoma e l'effetto di specifici trattamenti farmacologici nella malattia da invecchiamento precoce Sindrome di Hutchinson-Gilford Progeria (HGPS)15.
Insieme, questi e altri studi, evidenziano l'ampiezza dei processi / applicazioni che la tecnica dell'alone di DNA può essere utilizzata per studiare e l'utilità della tecnica.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10388739</td><td>Utilizzato per creare aloni di DNA</td></tr><tr><td>5-bromo-2&prime;-deossi-uridina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>Nucleotide marcato</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Nucleotide marcato</td></tr><tr><td>Agar Technical</td><td>Thermo Fisher Scientific 15562141</td><td></td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>Controlla le dimensioni del prodotto di DOP-PCR e la traduzione del nick</td></tr><tr><td>HGPS di tipo 2 atipico fibroblasti (AG08466)</td><td>Coriell Institute</td><td>AG08466</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Bacto triptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16269751</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Biotina-16-dUTP</td><td>Roche Diagnostics&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>Nucleotidi marcati</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Sindrome da progeria classica di Hutchinson-Gilford (HGPS) fibroblasti (AG06297)&nbsp;</td><td>Coriell Institute</td><td>AG0297</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Barattolo Coplin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>Contiene 5 vetrini o 8 vetrini uno dietro l'altro</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 15279011 <td>Blocca l'ibridazione aspecifica in acqua trattata con HALO FISH</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Solfato</td> <td>di destranoSigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>Miscela di ibridazione</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Componente del tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>Nucleotidi marcati</td></tr><tr><td>Asino anti-topo Cy3</td><td>Jackson Laboratory</td><td>715-165-150</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>secondario EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Componente del tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td>Componente del tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>Precipitazione della sonda e HALO FISH</td></tr><tr><td>Apparato bovino fetale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Siero per colture cellulari</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>2D FISH di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Lana di vetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>Colonna di filatura</td></tr><tr><td>Spermatozoo di aringhe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>Precipitazione della sonda</td></tr><tr><td>HXP&trade; Lampada (lampada per microscopio ad alogenuri metallici)</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>Acquisizione di immagini di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>Pulizia dei vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC Kit</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR KAPA</td><td>Biosystems</td><td>KK2103</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Leica DM4000 con fotocamera DFC365 FX e software di acquisizione immagini LAS AF (Versione: 4.5.0).</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Acquisizione di immagini di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Luria-Bertani agar</td><td>Thermo Fisher Scientific 13274843</td><td></td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Componente del tampone CSK</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>Pulizia e sterilizzazione dei vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-BrdU di topo</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>Visualizzazione BrdU</td></tr><tr><td>Siero</td> <td>di vitello neonatoThermo Fisher Scientific 16010159</td><td></td><td>Siero per colture cellulari e reagente bloccante</td></tr><tr><td>Kit di traduzione Nick Acqua</td> di grado PCR <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>PCR e isolamento del DNA di cloni BAC</td><td></td></tr><tr><td>Primer PCR Sigma-Aldrich</td> PIPES <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>P1851</td><td>Componente di CSK e tamponi di estrazione</td></tr><tr><td>Acetato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>Piatto quadrato per colture cellulari, polistirene con quattro scomparti. Questo ha una superficie idrofoba, è sterile, non pirogeno/endotossina e non citotossico.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Ki67 di coniglio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>Marker di proliferazione</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Cemento di gomma</td><td>Halford's</td><td>101836</td><td>2D FISH di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>Colonna di rotazione</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Precipitazione della sonda</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Componente di CSK, estrazione e tamponi SSC</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>Componente del tampone SSC</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato&nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Componente del tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Spermina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>Componente del tampone di estrazione</td></tr><tr><td>Streptavidina-Cy3&nbsp;</td><td>Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies</td><td>pa43001</td><td>Sonda anticorpo</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Componente del tampone CSK</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Tampone CSK+A66:D68</td></tr><tr><td>SuperFrost&trade; vetrini per microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12372098</td><td>Vetrini per microscopio: spessore 1 mm, lunghezza 76 mm, larghezza 26 mm. Non rivestito.</td></tr><tr><td>Suino anti-coniglio TRITC&nbsp;</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNA FISH KIT</td><td>Agilent Dako</td><td>K532511-8</td><td>Delineazione dei telomeri</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253-100G</td><td>Colonna tampone</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Componente del tampone CSK</td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10158962</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Vectashield mountant contenente DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>2D FISH di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Sonde cromosomiche umane intere Calbiochem</td><td></td><td></td><td>FISH 2D di aloni di DNA</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10108202</td><td>Isolamento del DNA di cloni BAC</td></tr></tbody></table>

ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di dna per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Il genoma è associato a diverse strutture all'interno dei nuclei cellulari, al fine di regolarne l'attività e ancorarla in posizioni specifiche. Queste strutture sono conosciute collettivamente come nucleoscheletro e includono la lamina nucleare, i nucleoli e i corpi nucleari. Sebbene esistano molte varianti dell'ibridazione fluorescenza in situ (FISH) per studiare il genoma e la sua organizzazione, queste sono spesso limitate dalla risoluzione e forniscono informazioni insufficienti sull'associazione del genoma con le strutture nucleari. Il metodo dell'alone di DNA utilizza alte concentrazioni di sale e detergenti non ionici per generare anelli di DNA che rimangono ancorati alle strutture all'interno dei nuclei attraverso regioni di attaccamento all'interno del genoma. Qui vengono estratte proteine nucleari solubili, come istoni, lipidi e DNA non strettamente legati alla matrice nucleare. Ciò porta alla formazione di un alone di DNA non attaccato che circonda un nucleo residuo che a sua volta contiene DNA strettamente associato a strutture nucleari interne e proteine resistenti all'estrazione. Questi filamenti di DNA estesi consentono una maggiore risoluzione e possono facilitare la mappatura fisica. In combinazione con FISH, questo metodo ha l'ulteriore vantaggio di studiare le interazioni genomiche con tutte le strutture a cui è ancorato il genoma. Questa tecnica, denominata HALO-FISH, è altamente versatile per cui gli aloni di DNA possono essere accoppiati con sonde di acido nucleico per rivelare loci genici, cromosomi interi, satelliti alfa, telomeri e persino RNA. Questa tecnica fornisce una visione dell'organizzazione e della funzione nucleare nelle cellule normali e nella progressione della malattia come con il cancro.

Questo metodo di preparazione dell'alone di DNA ci ha aiutato nei nostri sforzi per determinare le differenze nel comportamento del genoma all'interno di cellule giovani e vecchie, ma anche in cellule derivate da malattie dell'invecchiamento precoce con proteine nucleoscheletriche aberranti15. La Figura 1 mostra esempi di aloni di DNA in cui è possibile vedere il bordo di un nucleo residuo, il DNA che rimane all'interno del nucleo residuo e il DNA non attaccato che si è infilato nell'area circostante creando un alone di DNA. Descrive anche l'analisi che mostra come viene ottenuto il nucleo residuo e le misurazioni di NE e CTE. È possibile distinguere tra cellule proliferanti e non proliferanti incorporando un nucleotide marcato come BrdU quando le cellule sono in fase S o impiegando il marcatore di proliferazione diagnostica anti-pKi67, che rivela nucleoli, e regioni di eterocromatina nelle cellule G117,18. Si presume che le cellule primarie cresciute in alto siero senza raggiungere la confluenza, che sono negative per i marcatori di proliferazione, siano senescenti. Le cellule primarie cresciute in siero basso o sono diventate confluenti, cioè inibite dal contatto che sono negative per i marcatori di proliferazione, sono considerate quiescenti e sarebbero in grado di rientrare nel ciclo cellulare proliferativo dati i nutrienti e la situazione corretti. Essere in grado di distinguere tra cellule Ki67 positive e negative ci ha permesso di determinare le differenze tra fibroblasti dermici umani proliferanti, quiescenti e senescenti. La Figura 2 mostra aloni di DNA di fibroblasti dermici umani proliferanti creati da cellule in cui BrdU è stato incorporato in essi durante la replicazione del DNA, un meccanismo che non si verifica nelle cellule non proliferanti, e successivamente colorato con anticorpi anti-BrdU. La colorazione con l'anticorpo marcatore proliferativo anti-pKi67 è visibile anche nella Figura 2. Questo è un antigene robusto e sopravvive al protocollo FISH e quindi può essere colorato per post-FISH e pre-montaggio. Pertanto, le cellule proliferanti sono positive (rosse) per BrdU e anti-pKi67 (rosso) nella colonna di sinistra e le cellule non proliferanti, anzi le cellule senescenti nella Figura 2 sono visualizzate nella colonna di destra. I segnali verdi sono singoli telomeri rivelati con un kit PNA FISH/FITC dei telomeri. La combinazione di immunofluorescenza con aloni di DNA consente l'analisi durante diversi stati cellulari, come mostrato nella Figura 2 quando si studiano le cellule proliferanti, quiescenti e senescenti. A seconda dell'anticorpo scelto possono essere esaminate altre condizioni, come la differenziazione, il danno al DNA attraverso l'irradiazione, ecc.
I territori cromosomici possono anche essere visualizzati all'interno di aloni di DNA utilizzando FISH. A causa della preparazione che consente lo spooling del DNA fuori dai nuclei, la forma del territorio cromosomico può essere disturbata, con quantità più o meno grandi del cromosoma trovate nell'alone di DNA, a seconda dell'ancoraggio del genoma all'interno del nucleo residuo e delle sue strutture. La Figura 3 rivela un pannello di aloni di DNA in cui sono stati rivelati singoli cromosomi con specifiche sonde di pittura cromosomica dell'intero braccio (rosso) per i cromosomi 1, 13, 17 e 18. Anti-pKi67 (verde) è stato usato per marcare le cellule proliferanti e la sua assenza all'interno della stessa coltura, sullo stesso vetrino, denotando cellule senescenti. È molto evidente dalle immagini e dai dati presentati come CTE / NE che il piccolo cromosoma 18 povero di geni è un cromosoma che ha pochi attaccamenti e bobina più lontano nell'alone di DNA lontano dai nuclei residui ed è significativamente più lontano dal centro dei nuclei residui rispetto agli altri cromosomi. Tuttavia, questo vale anche per il cromosoma 1. Utilizzando il marcatore proliferativo anti-pKi67 è stato anche possibile confrontare la proliferazione con cellule senescenti, all'interno della stessa coltura e sullo stesso vetrino, e questa analisi ha rivelato che i cromosomi all'interno di questi due stati cellulari molto diversi non sono significativamente diversi l'uno dall'altro, per quanto riguarda l'attaccamento con le strutture nucleari residue.
È interessante notare che i geni mostrano anche differenze statisticamente significative tra cellule proliferanti e senescenti rispetto al rimanere all'interno di un nucleo residuo o essere situati nell'alone del DNA. La Figura 4 lo dimostra con loci genici delineati da sonde BAC marcate in rosso e anti-Ki67 in verde. Non ci sono differenze significative tra le posizioni dei geni nelle cellule proliferanti rispetto a quelle senescenti, dopo una preparazione dell'alone di DNA. Tuttavia, ci sono significativamente più loci di catenina alfa 1 CTNNA1 all'interno dell'alone del DNA rispetto ai loci della ciclina D1 CNDD1 , dove ce ne sono pochissimi. La Figura 5 mostra i preparati di alone di DNA con telomeri in verde. Lo sfondo è lasciato volutamente alto per consentire la visualizzazione dei segnali dei telomeri all'interno dell'alone di DNA. In questo insieme di dati sono state incluse cellule quiescenti, cioè cellule che sono state affamate di siero per 7 giorni e curiosamente ci sono significativamente più telomeri non attaccati e situati all'interno degli aloni di DNA nelle cellule quiescenti che per le cellule proliferanti e senescenti. Nella figura 5a si può osservare la proporzione di telomeri nell'alone di DNA, in particolare per l'immagine "Esperimento 2". Ciò corrisponde alla Figura 5b dove la percentuale media di telomeri nell'alone di DNA è di circa il 17% nelle cellule quiescenti. Ci sono alcune prove che non tutti i telomeri nelle cellule senescenti possono essere visti come alcuni di loro forse molto corti.
Questo metodo di alone di DNA ha avuto successo per noi per studiare le alterazioni dell'interazione del genoma all'interno dei nuclei nelle cellule malate15. La Figura 6 mostra le differenze nell'attaccamento cromosomico nei fibroblasti di controllo primario e nelle cellule malate con sindrome di progeria tipica (lamina A) e atipica, che esprime una diversa isoforma SUN1 e nessuna mutazione della lamina A19. I cromosomi 1 e 13 mostrano differenze statisticamente significative nel loro attaccamento all'interno dei nuclei residui rispetto agli aloni di DNA di controllo. La figura 6b correla la posizione dell'intero territorio cromosomico al nucleo residuo e all'alone di DNA. Valori pari o inferiori a 1 indicano che il cromosoma si trova all'interno del nucleo residuo e valori superiori a 1 dimostrano cromosomi o porzioni di cromosomi all'interno dell'alone di DNA.
Nel complesso, ciò evidenzia l'utilità di HALO-FISH nello studio delle interazioni genomiche di interi cromosomi, geni specifici e telomeri in una varietà di condizioni che influenzano il ciclo cellulare (proliferazione, quiescenza e senescenza) o all'interno di cellule patologiche, ad esempio linee cellulari di progeria e cancro. In effetti, le differenze nelle interazioni tra questi stati implicano che il nucleoscheletro ha un ruolo importante nella regolazione dei processi chiave all'interno del nucleo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figura 1: Nucleo estratto HDF che mostra il nucleo residuo e l'alone di DNA e panoramica del metodo di analisi. (a) Un nucleo HDF preparato mediante test dell'alone di DNA e controcolorato con DAPI. Il nucleo residuo brillantemente colorato mostra DNA ancorato al nucleoscheletro e questo è circondato dal DNA non attaccato che forma un alone di DNA. Ingrandimento = x 100; barra di scala 10 μm. (b) Il canale blu cattura il nucleo colorato con DAPI e il DNA circostante. Il nucleo residuo viene selezionato e rimosso utilizzando ImageJ. La freccia rappresenta la distanza dal centro nucleare al bordo nucleare residuo (NE). (c) Il canale rosso mostra il segnale della sonda. (d) L'immagine indicata con "Risultato" è il risultato della sovrapposizione del canale rosso all'immagine del canale blu; ciò consente la distanza dal centro nucleare al margine del territorio cromosomico più lontano (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione dell'alone di DNA con telomeri PNA FISH su HDF proliferanti e senescenti. Telomere PNA FISH su HDF sottoposti ad analisi dell'alone di DNA. I segnali dei telomeri sono visualizzati in verde (FITC), il DNA residuo e dell'alone è stato controcolorato utilizzando DAPI (blu) e i nuclei proliferanti sono stati rilevati utilizzando anticorpi anti-BrdU o anti-pKi67 tramite immunofluorescenza indiretta in rosso (TRITC). Ingrandimento = x 100; Barra di scala 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figura 3: Interazioni nucleoscheletro-cromosoma e analisi mediante saggio dell'alone di DNA. (a) 2D-FISH con sonde specifiche per i cromosomi 1, 13, 15, 17 e 18 è stato eseguito su HDF sottoposti a preparazione di alone di DNA. Interi cromosomi sono stati dipinti in rosso (Cy3) e i nuclei sono stati sondati con pKi67 per determinare se fossero proliferanti o senescenti. Le cellule proliferanti (pKi67+) sono state delineate in verde (FITC), mentre le cellule senescenti sono rimaste non colorate (pKi67-) cioè nessun segnale verde rilevato. Ingrandimento = x 100; barra di scala 10 μm. (b) Ancoraggio cromosomico da parte del nucleoscheletro in HDF proliferanti e senescenti che avevano subito HALO-FISH. Le misurazioni mostrano il rapporto tra il margine del territorio cromosomico più lontano (CTE) e il rispettivo bordo nucleare (NE) per i cromosomi 1, 13, 15, 17 e 18 nelle cellule proliferanti (pKi67+) e senescenti (pKi67-). Le barre di errore rappresentano ± SEM. (c) Rappresentazione modificata del box plot del bordo del territorio cromosomico (CTE) al rispettivo bordo nucleare (NE) di cromosomi specifici nei nuclei di pKi67+ e pKi67-. Q1 = quartile inferiore; Min = valore più basso registrato; Med = mediana; Max = valore massimo registrato; Q3 = quartile superiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figura 4: Interazioni gene-specifiche nelle HDF usando HALO-FISH. (a) I nuclei estratti dall'alone di DNA sono stati sondati con sonde gene-specifiche (CCND1 e CTNNA1) per studiare il loro ancoraggio al NM su cellule proliferanti e senescenti. I segnali del gene sono mostrati in rosso (Cy3) e anti-pKi67 raffigura le cellule proliferanti e il segnale viene visualizzato in verde (FITC). Per l'immagine proliferante di CCND1, il nucleo residuo è racchiuso all'interno del cerchio bianco e lo spazio tra il cerchio bianco e verde raffigura l'alone di DNA. Ingrandimento = x 100; Barra di scala 10 μm. (b) I segnali gene-specifici per CCND1 e CTNNA1 sono confrontati tra il nucleo residuo e l'alone di DNA, e anche tra cellule proliferanti e senescenti. Le barre di errore rappresentano ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figura 5: Saggio dell'alone di DNA su HDF quiescenti sondati con telomero PNA-FISH. (a) La quiescenza delle HDF è stata indotta mediante coltura in terreno sierico basso per 7 giorni. È stato eseguito il test dell'alone di DNA e PNA-FISH ha permesso la visualizzazione dei telomeri tramite segnale FITC (verde) e il nucleo residuo e l'alone di DNA circostante sono stati controcolorati con DAPI (blu). Le cellule sono state anche colorate con anticorpi anti-pKi67 per garantire che i nuclei non proliferassero. Ciò è stato ripetuto in due diverse occasioni. Ingrandimento = x 100; Barra di scala 10 μm. (b) Confronto della percentuale media di telomeri localizzati all'interno dell'alone di DNA in cellule HDF proliferanti, senescenti e quiescenti. Le barre di errore rappresentano ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figura 6: Esame dell'ancoraggio dell'intero cromosoma al nucleoscheletro nelle cellule HGPS utilizzando HALO-FISH26. (a) I nuclei di controllo HDF (2DD), HGPS classico (AG06297) e HGPS atipico di tipo 2 (AG08466) sono stati sottoposti a preparazione di alone di DNA e quindi 2D-FISH utilizzando vernici cromosomiche intere per i cromosomi 1, 13, 15 e 17. I cromosomi interi sono raffigurati in verde (FITC) e il DNA è stato controcolorato con DAPI (blu). Ingrandimento = x 100; Barra di scala 10 μm. (b) Il posizionamento dei cromosomi all'interno dei nuclei estratti è stato determinato misurando il rapporto tra il margine medio del territorio cromosomico (CTE) e il bordo nucleare (NE). Un rapporto superiore a 1 dimostra che il CTE più lontano si trova al di fuori del corrispondente NE all'interno dell'alone di DNA, mentre un rapporto inferiore a 1 significa che il CTE più lontano si trova all'interno del NE all'interno del nucleo residuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Costituenti</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix (senzaTTP) (2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP (2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotina-16-dUTPorDigoxigenina-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolymerase (1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Sagoma</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Tabella che mostra i componenti e i volumi della DOP-PCR per una reazione 1x
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Passo</td>
			<td>Cicli</td>
			<td>Temp (grado centigrado)</td>
			<td>Ore</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minuti</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 secondi</td>
		</tr><tr><td>Ricottura del primer</td>
			<td>62</td>
			<td>1 min</td>
		</tr><tr><td>Estensione</td>
			<td>72</td>
			<td>30 secondi</td>
		</tr><tr><td>Estensione finale</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 minuti</td>
		</tr><tr><td>Raffreddamento</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Tenere</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Tabella che mostra il ciclo DOP-PCR, la temperatura e il profilo temporale.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Costituente</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>Tampone NT 10x (0,5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M beta-mercaptoetanolo</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X Stock nucleotidico (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotina-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolimerasi I</td>
			<td>5U per μg di DNA</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td>
			<td>Fino a 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Tabella che mostra i componenti e i volumi di traduzione nick per una sonda.

La combinazione di preparazioni di alone di DNA con ibridazione fluorescenza in situ consente un'analisi ad alta risoluzione delle interazioni genomiche con il nucleoscheletro. Il genoma attaccato porta a segnali fluorescenti ibridati situati all'interno dei nuclei residui estratti, mentre il genoma non attaccato è nell'alone di DNA che circonda i nuclei residui.

Ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Questo protocollo può essere utilizzato per valutare gli attaccamenti al nucleoscheletro piuttosto che utilizzare il sequenziamento DamID, ed è un test a singola cellula. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo metodo è che è conveniente e facilmente accessibile. Può evidenziare differenze funzionali tra geni e cromosomi che normalmente non si verificano con altre tecniche di visualizzazione.Le organizzazioni spaziali e funzionali all'interno del genoma nelle cellule tumorali e progeria trattate e le differenze comportamentali genomiche nelle cellule senescenti possono essere valutate utilizzando questo protocollo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o tessuto per tutta la durata della vita e di qualsiasi malattia. Può anche essere utilizzato in organismi modello in cui sono disponibili sonde.Per iniziare, preparare 500 millilitri di acido cloridrico al 10% e versarlo in un grande becher. Far cadere i vetrini del microscopio singolarmente nell'acido e incubarli per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker impostato su due G.Decantare l'acido dal becher e lavare i vetrini 10 volte in acqua di rubinetto. Poi altre 10 volte in acqua deionizzata.Risciacquare i vetrini in metanolo due volte e tenerli in metanolo fino alla sterilizzazione. Rovesciare i vetrini su un tovagliolo di carta per asciugarli e avvolgerli in un foglio di alluminio per la sterilizzazione in autoclave o forno caldo. Coltivare le cellule nel mezzo appropriato con siero per almeno 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.Raccogliere ogni tipo di cellula e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare una volta 10 alle cinque celle in 10 millilitri di mezzo per vetrino. Rimuovere il piatto di coltura contenente i vetrini e le cellule attaccate dall'incubatore.Scartare il supporto ed etichettare le diapositive usando una matita. Quindi metterli in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di tampone citoscheletrico ghiacciato. Incubare il barattolo per 15 minuti su ghiaccio o a quattro gradi Celsius.Scartare il tampone citoscheletrico e sciacquare rapidamente i vetrini in 50 millilitri di tampone alone di DNA una tantum tre volte immergendoli in un barattolo di coplin con il tampone. Trasferire i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di tampone di estrazione e incubare per quattro minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare consecutivamente i vetrini in 50 millilitri di 10 volte, cinque volte, due volte e una volta tampone dell'alone di DNA per un minuto ciascuno.Al termine, immergere i vetrini attraverso una serie sequenziale di etanolo da 10, 30, 70 e 95% di etanolo. Prendi le diapositive attraverso una serie sequenziale di etanolo da 50 millilitri di etanolo 70, 90 e 100% per cinque minuti ciascuna. Asciugarli all'aria su una piastra riscaldante.Quindi cuocere in forno a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Denaturare i vetrini mettendoli in soluzione di formammide al 70% due volte SSC per due minuti a 70 gradi Celsius. Posizionare i vetrini denaturati in 50 millilitri di etanolo ghiacciato al 70% per cinque minuti.Quindi spostarli attraverso una serie di etanolo di 90, 95 e 100% a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno. Al termine, asciugare all'aria i vetrini su una piastra riscaldante. Denaturare le sonde di DNA a 75 gradi Celsius per 10 minuti in un blocco caldo o a bagnomaria.Quindi incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di pipettare 10 microlitri sul vetrino appropriato. Sovrapporre la sonda con un coprislip di 21 x 21 millimetri e sigillarla con cemento di gomma. Incubare i vetrini per un minimo di 18 ore a 37 gradi Celsius in una camera di ibridazione umidificata.Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il cemento di gomma con una pinza. Quindi incubare i vetrini in 50 millilitri di soluzione di formammide al 50% due volte SSC a pH sette che è stata preriscaldata a 45 gradi Celsius per tre incubazioni di cinque minuti. Quindi, posizionare i vetrini in 50 millilitri di soluzione SSC 0,1 volte che è stata preriscaldata a 60 gradi Celsius, ma posta in un bagno d'acqua di 45 gradi Celsius.Incubare per cinque minuti e sostituire il buffer due volte per incubazioni di cinque minuti. Mettere i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di soluzione quattro volte SSC a temperatura ambiente e incubare per 15 minuti con tre cambi di tampone. Per evitare il legame anticorpale non specifico, applicare 100 microlitri di soluzione 4% BSA quattro volte SSC a ciascun vetrino e sovrapporlo con un pezzo di pellicola di paraffina.Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi incubare i vetrini con 100 microlitri di streptavidina Cy3 diluita una su 200 per un'ora a temperatura ambiente per rilevare la sonda etichettata. Mettere i vetrini in un barattolo di coplin contenente 50 millilitri di soluzione quattro volte SSC a temperatura ambiente e incubare per 15 minuti con tre cambi di tampone.Montare le guide in 20 microlitri di una soluzione di montaggio contenente DAPI e sovrapposizione con un coprislip da 22 x 50 millimetri. Visualizza aloni di DNA e territori cromosomici utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo di olio 100X. La preparazione dell'alone di DNA consente di vedere il bordo di un nucleo residuo, il DNA che rimane all'interno del nucleo residuo e il DNA non attaccato che si è insinuato nell'area circostante.Gli aloni di DNA di fibroblasti dermici umani proliferanti sono stati creati da cellule con BRDU incorporato e successivamente colorati con anticorpi anti-BRDU. Le cellule proliferanti erano positive per BRDU e anti-pKi-67. Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare i territori cromosomici all'interno degli aloni di DNA.I singoli cromosomi sono stati etichettati con specifiche sonde di pittura cromosomica dell'intero braccio per i cromosomi 1, 13, 17 e 18. Anti-pKi-67 è stato usato per marcare le cellule proliferanti e la sua assenza all'interno della stessa coltura. I preparati di alone di DNA con telomeri in verde sono mostrati qui.È possibile osservare la proporzione di telomeri nell'alone di DNA, in particolare nell'immagine dell'esperimento due. La percentuale media di telomeri era di circa il 17% nelle cellule quiescenti. Differenze nell'attaccamento cromosomico sono state rilevate nei fibroblasti di controllo primario e nelle cellule malate con sindrome di progeria di Hutchinson-Gilford tipica e atipica, che esprime una diversa isoforma Sun1 e nessuna mutazione di Lamin A.I cromosomi uno e 13 mostrano differenze statisticamente significative nel loro attaccamento all'interno dei nuclei residui rispetto agli aloni di DNA controllati. La posizione dell'intero territorio cromosomico era correlata al nucleo residuo e all'alone di DNA. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che le cellule siano seminate alla densità corretta ed estratte al momento giusto.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire immunofluorescenza indiretta e RNA FISH.

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Un metodo per l'analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica è descritto. Il metodo utilizza incorporazione di BrdU in combinazione con...

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette la rilevazione di acidi nucleici nel loro ambiente nativo all'interno delle cellule. Noi descriviamo qui un protocollo per la, rilevazione simultanea combinata di RNA e DNA mediante FISH, che può essere usato per studiare inattivazione del cromosoma X in cellule staminali embrionali di topo.

DNA-RNA combinato fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (FISH) per studiare inattivazione del cromosoma X nelle cellule staminali embrionali di topo differenziata Femminile

Qui, presentiamo un metodo semplice per eseguire l'ibridazione in situ del DNA a fluorescenza (DNA ISH) per visualizzare sequenze eterocromatiche ripetitive su cromosomi montati su vetrini. Il metodo richiede un numero minimo di reagenti ed è versatile per l'uso con sonde corte o lunghe, tessuti diversi e per la rilevazione con segnali basati sulla fluorescenza o non sulla fluorescenza.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato  Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Questo protocollo illustra un sistema di dimerizzazione proteica indotto chimicamente per creare condensati sulla cromatina.  Viene dimostrata la formazione del corpo nucleare della leucemia promielocitica (PML) sui telomeri con dimerizzatori chimici. La crescita, la dissoluzione, la localizzazione e la composizione delle goccioline sono monitorate con imaging di cellule vive, immunofluorescenza (IF) e ibridazione fluorescente in situ (FISH).

Condensati proteici indotti da dimerizzazione chimica sui telomeri

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

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