Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae
April 11th, 2021
Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.
I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirare aerobicamente. La loro disfunzione è una fonte ben nota di malattie umane. I mitocondri di lievito di Baker contengono genoma circolare che codifica per otto proteine.
In questo video, abbiamo descritto il protocollo utilizzato per saggiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito attraverso l'etichettatura radioattiva di prodotti traslazionali e la successiva separazione per elettroforesi gel. La procedura prevede diversi passaggi principali. Striato lievito da colture di stock congelati su piatti freschi con mezzo appropriato.
Mettere le piastre nell'incubatore di coltura a 30 gradi per 24-48 ore. Inoculare queste colture in due millilitri di mezzo dalla striscia fresca in un tubo da 15 millilitri e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 gradi. Misurare la densità ottica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nanometri.
Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbenza in tubi sterili Palette cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare questo supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi.
Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. Diluire le cellule in due millilitri di mezzo agar fresco.
Incubare il bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi fino a quando la densità ottica raggiunge da 1,5 a 1,9 da 1,5 a 1,9 valori. Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di micro centrifuga. Ruotare i tubi a 3000 G per un minuto.
Scartare il supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettare le cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente Scartare il supernatante.
Sospendere di nuovo le cellule di lievito in 0,5 millilitri di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino alla concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro Incubare per cinque minuti bordo assunto a 200 RPM e 30 gradi per inibire la traduzione citosolica.
Aggiungere da 25 a 30 Aggiungere da 25 a 30 microcurie di metinina S35 di metinina S35 alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi. Aggiungere meionina fredda senza etichetta e borimicina per interrompere l'etichettatura Incubate per 10 minuti di bordo prelevato a 200 giri/min e 30 gradi. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 G per 30 secondi.
Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.
Aggiungere 75 microlitri di tampone di lysis alla tavolozza e al vortice per cinque o 10 secondi. Aggiungere 500 microlitri di 0,5 tris tampone molare di 0,5 tris buffer molare con pH 6.8. Con pH 6.8.
Vortice brevemente. Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Vortice per cinque secondi.
Aggiungere 150 microlitri di cloroformio al campione. Vortice per cinque secondi. Centrifugare i campioni per due minuti a 12.000 G.Scartare accuratamente l'opaface con un campionatore.
Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte. Centrifuga i campioni per due minuti a 12.000 G.Discard supernatant.
Asciugare all'aria la pallette per due minuti a 80 gradi. Sciogliere le proteine precipitate in 60 microlitri di tampone campione Laemmli. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 14 gradi.
Causare il gel di poliacrilammide Laemmli SDS al 17,5%. Caricare 15 microlitri di ogni campione nelle tasche. Eseguire il gel nella cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della linfa gel.
Macchia il gel con Kumasi blu brillante e fai la scansione o la foto che è richiesta come controllo del carico. Asciugare il gel nell'essiccatore a gel. Tienilo nella cassetta con schermo di fosforo di archiviazione per tre o cinque giorni.
Scansiona lo schermo su un imager al fosforo. Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di Saccharomyces cerevisiae. Il tipo selvatico e la variante mutante soppressioni del gene Aim23 che codifica per l'iniziazione alla traduzione mitocondriale fattore tre.
I prodotti di traduzione mitocondriale erano già attivamente etichettati e separati nel gel di poliacrilammide denaturante. I campioni venivano raccolti ogni due minuti e mezzo prima della saturazione per costruire il corso di tempo. Il gel è stato macchiato, asciugato e schermato dopo l'esposizione di cinque giorni.
Nel caso di un esperimento riuscito, l'immagine mostra otto bande assegnate secondo il modello standard. Tuttavia, le intensità delle singole bande possono essere altamente variabili a seconda della deformazione e delle condizioni sperimentali. Ogni banda corrisponde a un prodotto di traduzione.
I dati suggeriscono che il ceppo mutante è in grado di sintesi proteica mitocondriale perché tutti i prodotti che appaiono nel tipo selvaggio sono visibili in questo mutante. Tuttavia, le intensità delle bande sono diverse dal tipo selvaggio, il che significa che questa cancellazione di Aim23 influenza l'espressione genica mitocondriale. Kumasi è stato preparato in macchia blu e funge da controllo del carico.
Il loro risultato nei dati può essere quantificato per identificare le differenze tra ceppi o condizioni sperimentali utilizzando il software Image G o Image Quan. Per questi, il rapporto del segnale corrispondente a ogni prodotto viene calcolato al segnale totale. I valori medi e le deviazioni standard sono calcolati in almeno tre esperimenti indipendenti.
La cinetica della proteina sintetizzata girata è studiata in un esperimento dell'anno scorso. I campioni vengono raccolti nei punti di tempo indicati dopo che la reazione di etichettatura è stata interrotta dalla meionina fredda e dalla borimicina. Questo controllo è necessario per stimare la stabilità del prodotto.
La colorazione immuno-con anti-porina un anticorpo è un controllo del carico. Abbiamo descritto il metodo, che viene spesso utilizzato per studiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito. Questo protocollo è relativamente semplice e veloce da eseguire.
Allo stesso tempo, consente di ottenere informazioni preziose sul tasso di traduzione di quattro mRNA mitocondriali di lievito, il che è altamente vantaggioso. Tuttavia, ha diverse limitazioni che richiedono ulteriori esperimenti e si trova in questi livelli interstatali di proteine e mRNA. Può fornire le informazioni su queste funzioni nel sistema di traduzione mitocondriale, ma dovrebbero essere utilizzate tecniche più avanzate per scoprire il meccanismo.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per la marcatura e la visualizzazione degli otto polipeptidi codificati dal genoma mitocondriale del lievito di birra. Il metodo prevede la marcatura radioattiva dei prodotti traduzionali seguita da elettroforesi su gel.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Genetica
Contesto
- I mitocondri sono cruciali per la respirazione aerobica nelle cellule eucariotiche.
- Il disfunzionamento dei mitocondri è collegato a varie malattie umane.
- Il lievito di birra ha un genoma mitocondriale circolare.
- Questo genoma codifica per otto proteine essenziali.
Obiettivo dello studio
- Marcatura di tutti i polipeptidi codificati dal genoma mitocondriale del lievito.
- Visualizzazione di questi polipeptidi come bande separate.
- Migliorare la comprensione della biosintesi proteica mitocondriale.
Metodi utilizzati
- Marcatura radioattiva dei prodotti traduzionali.
- Separazione delle proteine marcate mediante elettroforesi su gel.
- Striscio del lievito da colture in stock congelate su piastre fresche.
- Utilizzo di un terreno appropriato per la crescita del lievito.
Risultati principali
- Marcatura riuscita di tutti gli otto polipeptidi mitocondriali.
- Visualizzazione dei polipeptidi come bande distinte su gel.
- Dimostrazione dell'efficacia del protocollo negli assay di biosintesi proteica.
- Approfondimenti sulla funzione mitocondriale e sulla sintesi proteica.
Conclusioni
- Il protocollo marca e visualizza efficacemente le proteine mitocondriali.
- Questo metodo può essere applicato a ulteriori studi sulla funzione mitocondriale.
- Comprendere questi processi è vitale per affrontare le malattie mitocondriali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative labeling and visualization of mitochondrial translation products in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of mitochondrial gene expression and protein biosynthesis. This capability is critical for mechanistic de-risking in early discovery, particularly when evaluating the impact of genetic perturbations on organellar function. The method supports portfolio decisions by providing robust, comparative data on mitochondrial translation across wild-type and mutant strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial translation rates for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic modifications on mitochondrial protein synthesis.
- Facilitates comparative analysis between wild-type and mutant strains to clarify pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for isolating and quantifying mitochondrial translation products.
- Delivers reproducible, quantitative banding patterns for assay standardization and downstream screening.
- Enables reliable detection of biosynthetic defects for compound or genetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial translation outputs with disease-relevant models when mitochondrial dysfunction is implicated.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative assessment of mitochondrial gene expression.
- Provides mechanistic insight into translation defects relevant to mitochondrial pathobiology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, where mitochondrial function is a key readout.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying translation of mitochondrial-encoded proteins under different genetic backgrounds.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for comparing biosynthetic rates across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of band intensities to compare translation efficiency and stability.
- Translational Research: Connects mitochondrial translation data to disease-relevant phenotypes in yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial translation analysis across multiple genetic or pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for mitochondrial translation analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, comparative data on mitochondrial biosynthesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on mitochondrial translation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, radiolabeling, and protein electrophoresis.
- Needs access to phosphorimaging and quantitative gel analysis infrastructure.
- Demands rigorous controls and replication to ensure data reliability and cross-team comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for translation specificity.
- Interpretation of translation rates must consider additional experiments for mechanistic conclusions.
