Name: Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri l'etichettatura radioattiva e l'elettroforesi su gel per visualizzare i polipeptidi mitocondriali in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente di studiare la biosintesi proteica mitocondriale.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione russa per la ricerca di base, numero di sovvenzione 18-29-07002. P.K. è stato supportato dall'assegnazione statale del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, numero di sovvenzione AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. è stato supportato dal Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione numero 075-15-2019-1659 (Programma del Kurchatov Center of Genome Research). Il lavoro è stato in parte svolto sulle attrezzature acquistate nell'ambito del Programma di Sviluppo dell'Università Statale di Mosca. I.C., S.L., e M.V.B. sono stati inoltre supportati dalla borsa di studio dell'Università Statale di Mosca "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Preparazione della coltura del lievito
<ol><li>Striature di lievito dalle colture di stock congelate su piatti freschi con il mezzo appropriato. Mettere le piastre in un incubatore di coltura a 30 °C per 24-48 ore. NOTA: Lascia che i mutanti sensibili alla temperatura crescano alla temperatura permissiva.</li>
	<li>Inoculare le colture di lievito in 2 ml di mezzo YPGal (2% peptone, 1% estratto di lievito, 2% di galattosio) dalla striscia fresca in tubi da 15 ml e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 °C.</li>
	<li>Misurare la densità ottica della coltura ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD600).</li>
	<li>Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbanza in tubi sterili, celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante.</li>
	<li>Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s. Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Diluire le cellule in 2 mL di mezzo YPGal fresco.</li>
	<li>Incubare l'agitazione a 200 giri/min e 30 °C fino a quando L'OD600 raggiunge i valori di 1,5-1,9. NOTA: I tassi di crescita del lievito variano, quindi preparati ad aspettare. È ragionevole fare i passi 1.3-1.6 la mattina presto. Di solito ci vogliono 4-5 ore, ma può richiedere più tempo.</li>
</ol>2. Incorporazione di isotopi radioattivi
<ol><li>Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di microcentrifugo. Ruotare i tubi a 3.000 x g per 1 minuto e scartare il supernatante. Lavare con 0,5 mL di acqua sterile con vortice per 5 s.<ol>
<li>Celle di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente e scartare il supernatante. Resuspend cellule di lievito in 0,5 mL di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 ml. NOTA: Il tampone di traduzione è una soluzione contenente il 2% di galattosio (w/v) e 50 mM di fosfato di potassio con pH 6,0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino ad una concentrazione finale di 0,2 mg/mL. Incubare per 5 min agitando a 200 giri/min e 30 °C per inibire la traduzione citosolica. NOTA: La soluzione di cicloeximide (20 mg/mL, in etanolo) deve essere preparata fresca prima dell'esperimento. Il cloramfenicolo può essere sostituito con successo con l'anisomicina nella stessa concentrazione7.</li>
	<li>Aggiungere 25-30 μCi di 35S-metinina alla sospensione cellulare e incubare per 30 min agitando a 200 giri/min e 30 °C. NOTA: Può essere utilizzata anche la miscela di 35S-metinina e 35S-cisteina. Pure 35S-methionine si traduce nel segnale più forte e nel miglior rapporto segnale-rumore. Generalmente, la metonina è più efficace della cisteina perché il contenuto di questo amminoacido nelle proteine mitocondriali è più alto. Tuttavia, la miscela EasyTag di 35S-metinina e cisteina è meno costosa e dà risultati comparabili7. ATTENZIONE: 35S-metinina è radioattiva. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di materiali radioattivi. NOTA: È noto che l'incorporazione della radioattività raggiunge un limite a causa del quale i segnali totali si livellano nel tempo. Una volta raggiunto questo limite, è quasi impossibile determinare le tariffe con cui vengono sintetizzati i diversi prodotti di traduzione. Per analizzare il tasso di traslazione mitocondriale, è imperativo essere in una condizione in cui l'intensità del segnale aumenta con il tempo di incubazione con 35S-metionina in modo lineare. Per i comuni ceppi di laboratorio di tipo selvatico, il segnale è già saturo per tempi di incubazione molto più brevi dei 30 minuti. I mutanti traslizionali possono comportarsi in modo molto diverso. Si dovrebbe eseguire un corso di tempo per stabilire la cinetica dell'incorporazione di radioattività e quindi il ritmo di traduzione, almeno quando si lavora con un nuovo ceppo. Per questo, si consiglia di prelevare campioni con un intervallo di diversi minuti (ad esempio, 2,5, 5,0, 7,5, 10 e 20 minuti).</li>
	<li>Aggiungere metinina "fredda" senza etichetta (la concentrazione finale deve essere di 20 mM) e puromicina (la concentrazione finale deve essere di 1-10 μg/mL) per interrompere l'etichettatura. Incubare per 10 min agitando a 200 giri/min e 30 °C. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per dare ai ribosomi il tempo di finire di tradurre i peptidi. In caso contrario, tutti i polipeptidi più corti della lunghezza intera verranno rilevati con dimensioni diverse. Un esperimento a tempo (pulse-chase) può essere fatto in questo passaggio per determinare la stabilità dei prodotti di traduzione mitocondriale. Per questo, continuare l'incubazione prelevare campioni con un intervallo di 30 min (ad esempio, 30, 60, 90 e 120 min).</li>
</ol>3.Lisi cellulare del lievito ed estrazione di proteine
<ol><li>Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 x g per 30 s. Lavare le cellule con 0,5 mL di acqua sterile vortice per 5 s. Cellule di lievito pellet a 9.000 x g per 30 s a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. nota. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni a -20 °C.</li>
	<li>Aggiungere 75 μL di tampone dilisi al pellet e al vortice per 5-10 s. NOTA: Il tampone di lysis è una soluzione di 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanolo e 1 mM PMSF in acqua. Evitare un'eccessiva incubazione con tampone di lisi che porta all'idrolisi alcalina delle proteine. Procedere immediatamente al passaggio 3.3.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone Tris-HCl da 0,5 M con pH 6,8. Vortice brevemente.</li>
</ol>4. Precipitazione delle proteine
ATTENZIONE: Metanolo e cloroformio sono solventi organici. Seguire le consuete pratiche di sicurezza per la manipolazione di sostanze organiche.
<ol><li>Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Vortice per 5 s.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di cloroformio al campione. Vortice per 5 s.</li>
	<li>Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare con cura la fase superiore con un campionatore.</li>
	<li>Aggiungere 600 μL di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte.</li>
	<li>Centrifugare i campioni per 2 min a 12.000 x g. Scartare il supernatante.</li>
	<li>Asciugare all'aria il pellet per 2 min a 80 °C. NOTA: Tutto il liquido deve evaporare. C'è il rischio di avere una separazione aberrante delle proteine nel gel se il pellet è stato asciugato in modo insufficiente. Tuttavia, non è possibile asciugare troppo il pellet, quindi può anche essere conservato durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>Sciogliere le proteine precipitate in 60 μL di 1 tampone campione di Laemmli.</li>
	<li>Riscaldare per 10 min a 40 °C. NOTA: Evitare di bollire i campioni a 95 °C, perché ciò causa aggregazione. Se gli aggregati si formano ancora, ruotare i campioni a 12.000 x g per 2 minuti e raccogliere il supernatante. I campioni possono essere conservati a -20 °C. Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>5. PAGINA SDS
<ol><li>Lanciare il gel Laemmli SDS-poliacrilammide al 17,5%. NOTA: 6 M di urea possono essere aggiunti al gel per risolvere meglio atp8 e atp9. Gradiente 15%-20% gel può anche dare una migliore risoluzione.</li>
	<li>Caricare 15 μL (40-50 μg) di ogni campione nelle tasche. NOTA: Non è necessario misurare la concentrazione proteica se i valori di OD600 erano vicini al passaggio 1.6. In caso meno, misurare le concentrazioni proteiche utilizzando il saggio con reagenti compatibili con i detergenti.</li>
	<li>Eseguire il gel in una cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della lunghezza del gel. NOTA: Per il sistema utilizzato (ad esempio, protean II xi cell), usiamo una delle due modalità: 16-17 h a 5 V / cm o 5 h a 15 V / cm. Nessuna proteine corre più veloce del colorante blu bromofenolo, ma le lunghe corse possono causare la sfocatura dei segnali Atp8 e Atp9.</li>
	<li>Macchiare il gel con Coomassie blu brillante e fare una scansione o una foto, che è necessaria come controllo di carico. NOTA: Un modo alternativo per effettuare un controllo del carico è l'immunoblotting con un anticorpo contro il gene mitocondriale "house-keeping", ad esempio porina 1.</li>
</ol>6. Autorarografia
<ol><li>Asciugare il gel in un gel-essiccatore. Tienilo nella cassetta con uno schermo di fosforo di archiviazione per 3-5 giorni. NOTA: Un'alternativa allo screening del gel essiccato è il trasferimento di proteine a una membrana di nitrocellulosa mediante elettroblotting e screening in seguito. Si traduce in segnali più forti e bande più nitide.</li>
	<li>Scansiona lo schermo su un fosforimager. NOTA: In alternativa all'imaging al fosforo, la pellicola a raggi X può anche essere utilizzata per rivelare i segnali.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le indagini sull'espressione genica occupano una parte centrale nelle moderne scienze della vita. Sono stati sviluppati numerosi metodi che forniscono informazioni su questo complesso processo. Qui, abbiamo descritto il metodo che consente di accedere alla biosintesi proteica nel lievito di fornaio S. cerevisiae mitochondria. Di solito viene applicato per confrontare le efficienze di traduzione degli mRNA nei mitocondri del ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico per accedere alle conseguenze della m...

I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana1. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli2. Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio dell'espressione genica mitocondriale per diversi motivi. In primo luogo, il loro genomaè completamente sequenziato 3, ben annotato, e una grande somma di dati è già disponibile in letteratura grazie alla lunga storia di indagini condotte con questo organismo. In secondo luogo, le manipolazioni con il loro genoma nucleare sono relativamente veloci e facili a causa del loro rapido tasso di crescita e del sistema di ricombinazione omologo altamente efficiente. In terzo luogo, il lievito di fornaio S. cerevisiae è uno dei pochi organismi per i quali vengono sviluppate le manipolazioni con genomi mitocondriali. Infine, il lievito di fornaio è un organismo facultativo aerobe-anaerobe, che consente l'isolamento e lo studio di mutanti respiratori difettosi, poiché possono crescere in mezzi contenenti fonti di carbonio fermentabili.
Descriviamo il metodo per studiare l'espressione genica mitocondriale del lievito di fornaio S. cerevisiae al livello trascizionale4. Il suo principio principale deriva da diverse osservazioni. In primo luogo, il genoma mitocondriale del lievito codifica solo otto proteine: tre subunità del citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p5. Questo numero è piccolo e tutti possono essere separati per elettroforesi su un singolo gel nelle condizioni appropriate. In secondo luogo, i ribosomi mitocondriali appartengono alla classe procariotica piuttosto che eucariotica 6 e,quindi,la sensibilità agli antibiotici è diversa per i ribosomi citoplasmatici e mitocondriali del lievito. Permette l'inibizione della traduzione citoplasmatica con cicloeximide, fornendo le condizioni quando l'amminoacido etichettato(35S-metonina) è incorporato solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Di conseguenza, l'esperimento fornisce informazioni sul tasso di incorporazione di amminoacidi nelle proteine mitocondriali sintetizzata de novo, riflettendo l'efficienza complessiva della traduzione mitocondriale per ciascuno degli otto prodotti

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Agar batteriologico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Densimetro per celle Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette monouso standard MARCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cicloesimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galattosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>riscaldatore a blocco digitale</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&micro; Ci (18,5 MBq), soluzione acquosa stabilizzata</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metilenebisacrilammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubatore</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone da carne, batteriologico</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Pierce 660nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato da Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 imager al fosforo</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore di gel riscaldato sottovuoto</td><td>Mannaia Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di baker saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirazione aerobica. Contengono un genoma circolare e un apparato di espressione genica. Un genoma mitocondriale del lievito del fornaio codifica per otto proteine: tre subunità della citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di etichettare specificamente queste proteine con metinina 35S, separarle per elettroforesi e visualizzare i segnali come bande discrete sullo schermo. La procedura prevede diversi passaggi. In primo luogo, le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo contenente galattosio fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica tardiva. Successivamente, il trattamento cicloeximide blocca la traduzione citoplasmatica e consente l'incorporazionedi metoionina 35 S solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Quindi, tutte le proteine vengono estratte dalle cellule di lievito e separate dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Infine, il gel viene asciugato e incubato con lo schermo di fosforo di stoccaggio. Lo schermo viene scansionato su un fosforimager che rivela le bande. Il metodo può essere applicato per confrontare il tasso di biosintesi di un singolo polipeptide nei mitocondri di un ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico, che è utile per studiare i difetti dell'espressione genica mitocondriale. Questo protocollo fornisce preziose informazioni sul tasso di traduzione di tutti gli mRNA mitocondriali del lievito. Tuttavia, richiede diversi controlli ed esperimenti aggiuntivi per trarre conclusioni adeguate.

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di S. cerevisiae: il tipo selvatico (WT) e una cancellazione mutante del gene AIM23 (AIM23Δ), codificando il fattore di iniziazione alla traduzione mitocondriale 3 (Tabella 1)8. I prodotti di traduzione mitocondriale sono stati etichettati e separati radioattivamente in SDS-PAAG9. I campioni sono stati raccolti ogni 2,5 minuti prima della ...

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirare aerobicamente. La loro disfunzione è una fonte ben nota di malattie umane. I mitocondri di lievito di Baker contengono genoma circolare che codifica per otto proteine.In questo video, abbiamo descritto il protocollo utilizzato per saggiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito attraverso l'etichettatura radioattiva di prodotti traslazionali e la successiva separazione per elettroforesi gel. La procedura prevede diversi passaggi principali. Striato lievito da colture di stock congelati su piatti freschi con mezzo appropriato.Mettere le piastre nell'incubatore di coltura a 30 gradi per 24-48 ore. Inoculare queste colture in due millilitri di mezzo dalla striscia fresca in un tubo da 15 millilitri e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 gradi. Misurare la densità ottica della coltura alla lunghezza d'onda di 600 nanometri.Prendere il volume corrispondente a 0,2 unità di assorbenza in tubi sterili Palette cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare questo supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi.Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante. Diluire le cellule in due millilitri di mezzo agar fresco.Incubare il bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi fino a quando la densità ottica raggiunge da 1,5 a 1,9 da 1,5 a 1,9 valori. Trasferire il volume di coltura equivalente a un'unità ottica in un tubo di micro centrifuga. Ruotare i tubi a 3000 G per un minuto.Scartare il supernatante. Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettare le cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente Scartare il supernatante.Sospendere di nuovo le cellule di lievito in 0,5 millilitri di tampone di traduzione sterile. Posizionare la sospensione in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere cicloeximide alla sospensione cellulare fino alla concentrazione finale di 0,2 milligrammi per millilitro Incubare per cinque minuti bordo assunto a 200 RPM e 30 gradi per inibire la traduzione citosolica.Aggiungere da 25 a 30 Aggiungere da 25 a 30 microcurie di metinina S35 di metinina S35 alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti bordo prelevato a 200 RPM e 30 gradi. Aggiungere meionina fredda senza etichetta e borimicina per interrompere l'etichettatura Incubate per 10 minuti di bordo prelevato a 200 giri/min e 30 gradi. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione a 9.000 G per 30 secondi.Lavare le cellule con 0,5 millilitri di acqua sterile vortice per cinque secondi. Pallettizzazione delle cellule di lievito a 9.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente. Scartare il supernatante.Aggiungere 75 microlitri di tampone di lysis alla tavolozza e al vortice per cinque o 10 secondi. Aggiungere 500 microlitri di 0,5 tris tampone molare di 0,5 tris buffer molare con pH 6.8. Con pH 6.8.Vortice brevemente. Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Vortice per cinque secondi.Aggiungere 150 microlitri di cloroformio al campione. Vortice per cinque secondi. Centrifugare i campioni per due minuti a 12.000 G.Scartare accuratamente l'opaface con un campionatore.Aggiungere 600 microlitri di metanolo al campione. Mescolare con attenzione invertendo il tubo più volte. Centrifuga i campioni per due minuti a 12.000 G.Discard supernatant.Asciugare all'aria la pallette per due minuti a 80 gradi. Sciogliere le proteine precipitate in 60 microlitri di tampone campione Laemmli. Riscaldare i campioni per 10 minuti a 14 gradi.Causare il gel di poliacrilammide Laemmli SDS al 17,5%. Caricare 15 microlitri di ogni campione nelle tasche. Eseguire il gel nella cella frigorifere fino a quando il colorante blu raggiunge circa il 65% della linfa gel.Macchia il gel con Kumasi blu brillante e fai la scansione o la foto che è richiesta come controllo del carico. Asciugare il gel nell'essiccatore a gel. Tienilo nella cassetta con schermo di fosforo di archiviazione per tre o cinque giorni.Scansiona lo schermo su un imager al fosforo. Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di Saccharomyces cerevisiae. Il tipo selvatico e la variante mutante soppressioni del gene Aim23 che codifica per l'iniziazione alla traduzione mitocondriale fattore tre.I prodotti di traduzione mitocondriale erano già attivamente etichettati e separati nel gel di poliacrilammide denaturante. I campioni venivano raccolti ogni due minuti e mezzo prima della saturazione per costruire il corso di tempo. Il gel è stato macchiato, asciugato e schermato dopo l'esposizione di cinque giorni.Nel caso di un esperimento riuscito, l'immagine mostra otto bande assegnate secondo il modello standard. Tuttavia, le intensità delle singole bande possono essere altamente variabili a seconda della deformazione e delle condizioni sperimentali. Ogni banda corrisponde a un prodotto di traduzione.I dati suggeriscono che il ceppo mutante è in grado di sintesi proteica mitocondriale perché tutti i prodotti che appaiono nel tipo selvaggio sono visibili in questo mutante. Tuttavia, le intensità delle bande sono diverse dal tipo selvaggio, il che significa che questa cancellazione di Aim23 influenza l'espressione genica mitocondriale. Kumasi è stato preparato in macchia blu e funge da controllo del carico.Il loro risultato nei dati può essere quantificato per identificare le differenze tra ceppi o condizioni sperimentali utilizzando il software Image G o Image Quan. Per questi, il rapporto del segnale corrispondente a ogni prodotto viene calcolato al segnale totale. I valori medi e le deviazioni standard sono calcolati in almeno tre esperimenti indipendenti.La cinetica della proteina sintetizzata girata è studiata in un esperimento dell'anno scorso. I campioni vengono raccolti nei punti di tempo indicati dopo che la reazione di etichettatura è stata interrotta dalla meionina fredda e dalla borimicina. Questo controllo è necessario per stimare la stabilità del prodotto.La colorazione immuno-con anti-porina un anticorpo è un controllo del carico. Abbiamo descritto il metodo, che viene spesso utilizzato per studiare la biosintesi proteica nei mitocondri del lievito. Questo protocollo è relativamente semplice e veloce da eseguire.Allo stesso tempo, consente di ottenere informazioni preziose sul tasso di traduzione di quattro mRNA mitocondriali di lievito, il che è altamente vantaggioso. Tuttavia, ha diverse limitazioni che richiedono ulteriori esperimenti e si trova in questi livelli interstatali di proteine e mRNA. Può fornire le informazioni su queste funzioni nel sistema di traduzione mitocondriale, ma dovrebbero essere utilizzate tecniche più avanzate per scoprire il meccanismo.

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Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

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