Name: Utilizzo dellimmunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5nei cuori embrionali di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Impara l'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5 nei cuori embrionali di zebrafish. Questo metodo consente di studiare l'espressione proteica e valutare le malformazioni cardiache.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Sciences Foundation of China (numero di sovvenzione: 81870239, 81741005, 81972999) e the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

Il pesce zebra selvatico (AB) utilizzato in questo studio è stato ottenuto dal National Zebrafish Resource Center di Wuhan, in Cina. Tutte le procedure per gli animali qui descritte sono state riviste e approvate dall'Animal Care Institution del Comitato Etico della Soochow University.
1. Campionamento PM2.5 ed estrazione di composti organici
NOTA: PM2.5 è stato raccolto in un'area urbana a Suzhou, Cina, 1-7 agosto 2015, come descritto in precedenza5.
<ol><li>Cuocere filtri a membrana di quarzo da 47 mm in un forno a muffola a 500 °C per 2 ore per rimuovere i componenti organici.</li>
	<li>Posizionare un filtro in un campionatore PM2.5 per 24 ore di campionamento ininterrotto.</li>
	<li>Rimuovere il filtro e asciugare per 24 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Quantificare il filtro con una bilancia analitica.</li>
	<li>Estrarre i componenti organici dal filtro mediante estrazione Soxhlet utilizzando il diclorometano come solvente19.</li>
	<li>Asciugare l'EOM mediante evaporazione rotativa in un bagno d'acqua a 60 °C e flusso di azoto. Sciogliere EOM in DMSO e conservare a -20 °C.</li>
</ol>2. Raccolta e trattamento degli embrioni di Zebrafish
<ol><li>Mantenere il pesce zebra a 28,5 ± 0,5 °C in un sistema di acquacoltura a ricircolamento con un ciclo fotoperiodo di 14 ore di luce e 10 ore di buio.</li>
	<li>Posiziona il pesce zebra adulto sano in un acquario con un rapporto maschio-femmina di 2: 1.</li>
	<li>Il giorno dopo, raccogli gli embrioni e lavali con acqua di sistema (cioè acqua di riproduzione del pesce zebra).</li>
	<li>Selezionare e dividere casualmente gli embrioni di zebrafish che dimostrano uno sviluppo normale (dimensioni uniformi, pieno fiore e nessuna coagulazione delle uova) in 4 gruppi in singole piastre di Petri di vetro con un diametro di 7 cm (circa 50 embrioni per piatto).</li>
	<li>Trattare gli embrioni con PM2,5 (5 mg/L) in presenza o assenza di NAC a 0,25 μM da 2 hpf fino a 72 hpf. Utilizzare DMSO come controllo del veicolo fino a una concentrazione finale allo 0,1% (v/v).</li>
</ol>3. Osservazione morfologica degli embrioni di zebrafish e dissezione cardiaca
<ol><li>A 72 hpf, trasferire gli embrioni su vetrini di vetro e osservare al microscopio stereo. Registrare malformazioni cardiache, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte.</li>
	<li>Calcola i tassi di malformazione (la percentuale di embrioni con difetti cardiaci sul totale degli embrioni viventi) e analizza le differenze tra i gruppi utilizzando ANOVA uninozionale seguito dal test di confronto multiplo della Turchia (p < 0,05 = statisticamente significativo).</li>
	<li>Anestetizzare gli embrioni con 0,6 mg/ml di MS-222 per immobilizzarli su vetrini.</li>
	<li>Registra i battiti cardiaci per 30 s e quantifica la frequenza cardiaca utilizzando il software ImageJ5,20.</li>
	<li>Seziona i cuori degli embrioni di zebrafish con un ago a siringa usa e getta sotto uno stereomicroscopio. Attenzione: evitare di distruggere la forma del cuore.</li>
</ol>4. Saggio di immunofluorescenza
<ol><li>Per utilizzare un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish, utilizzare una penna barriera idrofoba per disegnare un cerchio su un lato di vetro pulito.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di paraformaldeide al 4% a 1,25 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS) per creare una soluzione fissativa.</li>
	<li>Posizionare 3 cuori sezionati in un cerchio di penna barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, in modo che i cuori si attacchino completamente ai vetrini.</li>
	<li>Lavare le diapositive tre volte in PBS con 0,1% Tween 20 (PBST) per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di albumina sierica bovina (BSA) a 1000 μL di PBST per ottenere una soluzione di BSA al 5% e incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora per bloccare il legame anticorpale non specifico.</li>
	<li>Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Diluire 2 μL di anticorpo monoclonale di topo contro 8-OHdG e 2 μL di anticorpo policlonale di coniglio contro γH2AX in 296 μL di PBST per ottenere una soluzione cocktail anticorpale primaria funzionante.</li>
	<li>Incubare i campioni cardiaci con 50 μL della soluzione di cocktail anticorpale primario contro 8-OHdG e γH2AX in una camera umidificata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (l'incubazione notturna può aumentare l'intensità del segnale).</li>
	<li>Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.</li>
	<li>Diluire 1 μL di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato CON FITC e 1 μL di anticorpo secondario anti-coniglio di capra cy3 in 498 μL di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionanti e incubare i campioni con gli anticorpi secondari (1:500 in PBST) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per 5 minuti per lavaggio al riparo dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) ai campioni per la colorazione nucleare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Applicare una copertina per scorrere e sigillare con lo smalto per evitare l'asciugatura e il movimento. Quindi immagine i campioni al microscopio a fluorescenza e quantifica il segnale di fluorescenza dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcola le variazioni relative con la media dei campioni di controllo DMSO. Determinare la significatività statistica dei dati come nel passaggio 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene il pesce zebra sia un eccellente modello di vertebrato per studiare la tossicità dello sviluppo cardiaco delle sostanze chimiche ambientali, a causa delle piccole dimensioni del cuore dell'embrione, è difficile ottenere abbastanza proteine per l'analisi western blot. Pertanto, presentiamo un metodo di immunofluorescenza sensibile per quantificare i livelli di espressione proteica dei biomarcatori di danno al DNA nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a PM2.5.
Durante ...

L'inquinamento atmosferico è ora un grave problema ambientale che il mondo deve affrontare. Il particolato fine ambientale (PM2,5), che è uno degli indicatori più importanti della qualità dell'aria, può trasportare un gran numero di sostanze nocive ed entrare nel sistema circolatorio del sangue, causando gravi danni alla salute umana1. Studi epidemiologici hanno dimostrato che l'esposizione al PM2,5 può portare ad un aumento del rischio di difetti cardiaci congeniti (CHD)2,3. Le prove degli esperimenti sugli animali hanno anche dimostrato che il PM2,5 può causare uno sviluppo cardiaco anormale negli embrioni di zebrafish e nella prole dei topi, ma i meccanismi molecolari della tossicità dello sviluppo cardiaco del PM2,5 sono ancora in gran parte sconosciuti4,5,6.
Il danno al DNA può causare l'arresto del ciclo cellulare e indurre l'apoptosi, che può distruggere ampiamente il potenziale delle cellule progenitrici e, di conseguenza, compromettere lo sviluppo del cuore7). È stato ben documentato che gli inquinanti ambientali, tra cui il PM2,5,hanno il potenziale di attaccare il DNA attraverso meccanismi di stress ossidativo8,9. Sia lo sviluppo cardiaco umano che quello del pesce zebra sono sensibili allo stress ossidativo10,11,12. 8-OHdG è un marcatore di danno ossidativo del DNA e il segnale γH2AX è un marcatore di rotture del doppio filamento di DNA. N-acetil-L-cisteina (NAC), un precursore sintetico della cisteina intracellulare e del glutatione, è ampiamente usato come composto antiossidante. In questo studio, utilizziamo NAC per indagare il ruolo dello stress ossidativo in PM2.5- danno al DNA indotto13.
Zebrafish come vertebrato modello è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco e le malattie cardiovascolari umane perché i meccanismi di sviluppo cardiaco sono altamente conservati tra i vertebrati14,15. I vantaggi dell'utilizzo del pesce zebra come modello includono le loro piccole dimensioni, la forte capacità riproduttiva e il basso costo di alimentazione. Di particolare interesse per questi studi, gli embrioni di zebrafish non dipendono dal sistema circolatorio durante lo sviluppo precoce e possono sopravvivere a gravi malformazioni cardiache14. Inoltre, la loro trasparenza consente di osservare direttamente l'intero corpo al microscopio. Pertanto, gli embrioni di zebrafish offrono un'eccezionale opportunità per valutare i meccanismi molecolari coinvolti nell'induzione della tossicità dello sviluppo cardiaco a seguito dell'esposizione a varie sostanze chimiche ambientali5,16,17. Abbiamo precedentemente riferito che lo stress ossidativo indotto da PM2,5porta a danni al DNA e apoptosi, con conseguenti malformazioni cardiache nel pesce zebra18. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato per indagare il danno al DNA indotto da PM2,5nel cuore degli embrioni di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>8-OHdG Anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Sartorius, Cina</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td>SW3015</td><td>Per il blocco</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>Per controcolorazione nucleare.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio,Pechino,Cina</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus, Giappone</td><td>IX73</td><td>Per l'imaging di segnali di fluorescenza/</td></tr><tr><td>Capra Anti-coniglio IgG Cy3</td><td>Carlsbad,USA</td><td>CW0159</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Capra Anti-coniglio IgG FITC</td><td>Carlsbad,USA</td><td>RS0003</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina (NAC)</td><td>Adamas-Beta, Shanghai, Cina</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>QILINBEIER, Cina</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma, Cina</td><td>P6148</td><td>Fare il 4% di paraformaldeide per la fissazione.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>HyClone, USA</td><td>SH30256.01</td><td>Preparare 0,1% Tween in PBS per il lavaggio.</td></tr><tr><td>Campionatore PM2.5</td><td>TianHong, Wuhan, Cina</td><td>TH-150C</td><td>Per il campionamento ininterrotto di PM2.5 24 ore su 24.</td></tr><tr><td>Sistema di acquacoltura a ricircolo</td><td>HaiSheng, Shanghai, Cina</td><td></td><td>Il pesce zebra è stato mantenuto in esso.</td></tr><tr><td>Estrattore Soxhlet</td><td>ZhengQiao, Shanghai, Cina</td><td>BSXT-02</td><td>Per l'estrazione di componenti organici.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon, Canada</td><td>SMZ645</td><td>Per la dissezione cardiaca da embrioni di zebrafish.</td></tr><tr><td>Tricaina metanosulfonato (MS222)</td> <td>Sigma, Cina</td><td>E10521</td><td>Per anestetizzare embrioni di pesce zebra</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Cina</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>& gamma; Anticorpo H2AX</td><td>Abcam, USA</td><td>ab26350</td><td>Anticorpo primario</td></tr></tbody></table>

utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al dna indotto da pm2,5nei cuori embrionali di zebrafish

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

L'esposizione al particolato fine ambientale (PM2,5)può portare a tossicità per lo sviluppo cardiaco, ma i meccanismi molecolari sottostanti non sono ancora chiari. L'8-idrossi-2'deossigenasi (8-OHdG) è un marker del danno ossidativo al DNA e γH2AX è un marcatore sensibile per le rotture del doppio filamento del DNA. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare i cambiamenti 8-OHdG eγH2AXindotti da PM 2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish utilizzando un test di immunofluorescenza. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con sostanze organiche estraibili (EOM) da PM2,5 a 5 μg/mL in presenza o assenza di N-acetil-L-cisteina antiossidante (NAC, 0,25 μM) a 2 ore dopo la fecondazione (hpf). DMSO è stato utilizzato come controllo del veicolo. A 72 hpf, i cuori sono stati sezionati dagli embrioni usando un ago a siringa e fissati e permeabilizzati. Dopo essere stati bloccati, i campioni sono stati sondati con anticorpi primari contro 8-OHdG e γH2AX. I campioni sono stati poi lavati e incubati con anticorpi secondari. Le immagini risultanti sono state osservate al microscopio a fluorescenza e quantificate utilizzando ImageJ. I risultati mostrano che EOM da PM2.5 ha migliorato significativamente i segnali 8-OHdG e γH2AX nel cuore degli embrioni di zebrafish. Tuttavia, NAC, agendo come spazzino di specie reattive dell'ossigeno (ROS), ha parzialmente contrastato il danno al DNA indotto dall'EOM. Qui, presentiamo un protocollo di immunofluorescenza per studiare il ruolo del danno al DNA nei difetti cardiaci indotti da PM2,5che possono essere applicati al rilevamento di cambiamenti di espressione proteica indotti da sostanze chimiche ambientali nei cuori degli embrioni di zebrafish.

Questo test di immunofluorescenza è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti di espressione proteica nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a sostanze chimiche ambientali.
In questa analisi rappresentativa, gli embrioni esposti a PM2,5 in assenza o presenza del NAC antiossidante sono stati valutati per la presenza di malformazioni cardiache (Figura 1). Come osserv...

Questo protocollo utilizza un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5nei cuori sezionati degli embrioni di zebrafish.

Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5nei cuori embrionali di zebrafish

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Questo metodo può essere utilizzato per rilevare con precisione e facilità l'espressione delle proteine bersaglio nel cuore del pesce zebra. Il cambiamento nella proteina bersaglio viene rilevato direttamente misurando l'immunofluorescenza. Eseguire la raccolta e il trattamento degli embrioni di zebrafish, come descritto nel manoscritto di testo.A 72 ore dalla fecondazione, trasferire gli embrioni su vetrini di vetro e osservarli al microscopio stereo. Registrare malformazioni cardiache, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte. Calcola i tassi di malformazione e analizza le differenze tra i gruppi utilizzando ANOVA a senso unico, seguito dal test di confronto multiplo della Turchia.Dopo aver anestetizzato gli embrioni con 0,6 milligrammi per millilitro MS222, registrare i battiti cardiaci per 30 secondi e quantificare la frequenza cardiaca utilizzando il software Image J. Seziona attentamente i cuori degli embrioni di pesce zebra con un ago a siringa usa e getta sotto uno stereomicroscopio. Utilizzare una penna barriera idrofoba per disegnare un cerchio su un vetrino pulito.Aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a 1,25 microlitri di PBS per creare una soluzione fissativa, quindi posizionare tre cuori sezionati in un cerchio di barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Lavare le diapositive tre volte in PBST per cinque minuti per lavaggio.Aggiungere 50 microlitri di BSA a 1.000 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di BSA al 5% e incubare i vetrini in una camera umida per un'ora per bloccare il legame anticorpale non specifico. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Diluire due microlitri di anticorpo monoclonale di topo contro 8-idrossideossiguanosina e due microlitri di anticorpo policlonale di coniglio contro gamma-H2AX in 296 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di cocktail anticorpale primario funzionante.Incubare i campioni di cuore con 50 microlitri della soluzione di cocktail anticorpale primario in una camera umidificata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Diluire un microlitro di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato FITC e un microlitro di anticorpo secondario anti-coniglio di capra psy-3 in 500 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionante.Incubare i campioni con gli anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente al buio. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Aggiungere 20 microlitri di DAPI ai campioni per la colorazione nucleare e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente.Applicare un coperchio sul vetrino e sigillarlo con lo smalto per evitare l'asciugatura e il movimento. Immagina i campioni al microscopio a fluorescenza e quantifica il segnale fluorescente dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcolare le variazioni relative utilizzando la media dei campioni di controllo DMSO e determinare la significatività statistica dei dati.Gli embrioni esposti a PM 2,5 in assenza o presenza dell'antiossidante, N-acetil-L-cisteina, o NAC, sono stati valutati per la presenza di malformazioni cardiache. L'EOM da PM 2,5 è costato un aumento significativo della teratogenesi cardiaca, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte, rispetto ai cuori trattati con controllo DMSO. Anche la frequenza cardiaca è diminuita significativamente negli embrioni esposti alle EOM.Aggiunta di difetti cardiaci indotti da EOM attenuati da NAC. Un test di immunofluorescenza è stato utilizzato per valutare l'entità del danno al DNA nei tessuti trattati con EOM. I livelli di espressione di 8-idrossideossiguanosina e gamma-H2AX sono stati significativamente aumentati nei cuori degli embrioni di zebrafish trattati con EOM, indicando un aumento del danno ossidativo al DNA e delle rotture del doppio filamento del DNA, rispettivamente.Il danno al DNA indotto dall'EOM è stato parzialmente contrastato dall'integrazione di NAC. Quando si tenta questo protocollo, fare attenzione quando si lavano i campioni con PBS, perché il cuore di zebrafish potrebbe staccarsi dal vetrino.

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Un modo rapido per condurre immunocolorazione cuore embrionale di zebrafish è descritto. Rispetto alla intero approccio immunostaining monte, questo metodo aumenta notevolmente la penetrazione degli anticorpi, che permette di ottenere immagini ad alta risoluzione che mostrano strutture cellulari / subcellulari nel cuore entro un tempo di elaborazione molto più ridotto.

Immunocolorazione di Dissected Cuore Zebrafish embrionali

Questo video dimostra un test altamente sensibile basato sull'immunofluorescenza per rilevare il danno ossidativo indotto da PM2,5 nel cuore di embrioni di zebrafish misurando i livelli di 8-OHdG e γH2AX, che indicano rispettivamente il danno al DNA e le rotture del DNA a doppio filamento.

Saggio di immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA mediato da PM2,5 negli embrioni di pesce

Alcune perturbazioni genetiche o l'esposizione a tossine possono interrompere i normali processi di sviluppo portando alla morte di specifici tipi di cellule. L'analisi della caspasi 3 attivata mediante immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di zebrafish rivela la localizzazione specifica dello stadio e del tessuto di cellule specificamente sottoposte ad apoptosi.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Qui descritto è un protocollo per l'imaging semi-automatica di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

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Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l&#39;analisi trascrizionale

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere in dettaglio un nuovo metodo per la valutazione della funzione cardiaca segmentale nel pesce zebra embrionale in condizioni fisiologiche e patologiche.

L'analisi dello spostamento della deformazione meccanica miocardiale (DIAMOND) rivela l'eterogeneità segmentale della funzione cardiaca nel pesce zebra embrionale

Descriviamo strumenti ottimizzati per studiare il cuore di zebrafish in vivo con microscopia a fluorescenza a foglio leggero. In particolare, suggeriamo linee transgeniche cardiache luminose e presentiamo nuove delicate tecniche di incorporamento e immobilizzazione che evitano difetti dello sviluppo e cardiaci. Viene inoltre fornita una possibile pipeline di acquisizione e analisi dei dati adattata all'imaging cardiaco.

Microscopia light sheet di dinamiche cardiache veloci in embrioni zebrafish

La manipolazione optogenetica delle vie di segnalazione può essere una potente strategia per studiare come la segnalazione viene decodificata nello sviluppo, nella rigenerazione, nell'omeostasi e nella malattia. Questo protocollo fornisce linee guida pratiche per l'utilizzo di attivatori di segnalazione della proteina morfogenica (BMP) nodale e della proteina morfogenica ossea (BMP) basati sul dominio di rilevamento della luce-ossigeno-voltaggio nell'embrione precoce di zebrafish.

Attivazione della segnalazione optogenetica negli embrioni di zebrafish

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Impara l'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5 nei cuori embrionali di zebrafish. Questo metodo consente di studiare l'espressione proteica e valutare le malformazioni cardiache.

Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM_2,5nei cuori embrionali di zebrafish

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