Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM_2,5nei cuori embrionali di zebrafish

Questo metodo può essere utilizzato per rilevare con precisione e facilità l'espressione delle proteine bersaglio nel cuore del pesce zebra. Il cambiamento nella proteina bersaglio viene rilevato direttamente misurando l'immunofluorescenza. Eseguire la raccolta e il trattamento degli embrioni di zebrafish, come descritto nel manoscritto di testo.

A 72 ore dalla fecondazione, trasferire gli embrioni su vetrini di vetro e osservarli al microscopio stereo. Registrare malformazioni cardiache, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte. Calcola i tassi di malformazione e analizza le differenze tra i gruppi utilizzando ANOVA a senso unico, seguito dal test di confronto multiplo della Turchia.

Dopo aver anestetizzato gli embrioni con 0,6 milligrammi per millilitro MS222, registrare i battiti cardiaci per 30 secondi e quantificare la frequenza cardiaca utilizzando il software Image J. Seziona attentamente i cuori degli embrioni di pesce zebra con un ago a siringa usa e getta sotto uno stereomicroscopio. Utilizzare una penna barriera idrofoba per disegnare un cerchio su un vetrino pulito.

Aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 4% a 1,25 microlitri di PBS per creare una soluzione fissativa, quindi posizionare tre cuori sezionati in un cerchio di barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno cinque minuti. Lavare le diapositive tre volte in PBST per cinque minuti per lavaggio.

Aggiungere 50 microlitri di BSA a 1.000 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di BSA al 5% e incubare i vetrini in una camera umida per un'ora per bloccare il legame anticorpale non specifico. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Diluire due microlitri di anticorpo monoclonale di topo contro 8-idrossideossiguanosina e due microlitri di anticorpo policlonale di coniglio contro gamma-H2AX in 296 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di cocktail anticorpale primario funzionante.

Incubare i campioni di cuore con 50 microlitri della soluzione di cocktail anticorpale primario in una camera umidificata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Diluire un microlitro di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato FITC e un microlitro di anticorpo secondario anti-coniglio di capra psy-3 in 500 microlitri di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionante.

Incubare i campioni con gli anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente al buio. Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio. Aggiungere 20 microlitri di DAPI ai campioni per la colorazione nucleare e incubarli per 30 minuti a temperatura ambiente.

Applicare un coperchio sul vetrino e sigillarlo con lo smalto per evitare l'asciugatura e il movimento. Immagina i campioni al microscopio a fluorescenza e quantifica il segnale fluorescente dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcolare le variazioni relative utilizzando la media dei campioni di controllo DMSO e determinare la significatività statistica dei dati.

Gli embrioni esposti a PM 2,5 in assenza o presenza dell'antiossidante, N-acetil-L-cisteina, o NAC, sono stati valutati per la presenza di malformazioni cardiache. L'EOM da PM 2,5 è costato un aumento significativo della teratogenesi cardiaca, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte, rispetto ai cuori trattati con controllo DMSO. Anche la frequenza cardiaca è diminuita significativamente negli embrioni esposti alle EOM.

Aggiunta di difetti cardiaci indotti da EOM attenuati da NAC. Un test di immunofluorescenza è stato utilizzato per valutare l'entità del danno al DNA nei tessuti trattati con EOM. I livelli di espressione di 8-idrossideossiguanosina e gamma-H2AX sono stati significativamente aumentati nei cuori degli embrioni di zebrafish trattati con EOM, indicando un aumento del danno ossidativo al DNA e delle rotture del doppio filamento del DNA, rispettivamente.

Il danno al DNA indotto dall'EOM è stato parzialmente contrastato dall'integrazione di NAC. Quando si tenta questo protocollo, fare attenzione quando si lavano i campioni con PBS, perché il cuore di zebrafish potrebbe staccarsi dal vetrino.