Name: Un modello di endotossina orientato allunità di terapia intensiva riproducibile nei ratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Impara un modello riproducibile di endotossiemia nei ratti per la ricerca sulla sepsi in terapia intensiva. Questo metodo consente valutazioni ripetute dei parametri fisiologici e molecolari, riducendo il numero di animali necessari.

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Gli autori ringraziano Beatrice Beck-Schimmer (MD) ed Erik Schadde (MD) per il loro esame critico e il loro prezioso contributo per questo manoscritto.

Tutti gli esperimenti presentati in questo protocollo sono stati approvati dalle autorità veterinarie del Cantone di Zurigo, Svizzera (numeri di approvazione 134/2014 e ZH088/19). Inoltre, tutte le fasi eseguite in questo esperimento sono state conformi alle Linee guida sugli esperimenti con gli animali dell'Accademia svizzera delle scienze medie (SAMS) e alle Linee guida della Federazione delle associazioni europee di scienza degli animali da laboratorio (FELASA).
1. Induzione dell'anestesia e monitoraggio degli animali
<ol><li>Tenere ratti Wistar maschi con un peso di 250-300 grammi (g) in gabbie ventilate in condizioni prive di agenti patogeni. Fornire un ciclo luce/buio di 12-12 ore a una temperatura ambiente di 22 ± 1 °C e libero accesso a cibo e acqua.</li>
	<li>Indurre l'anestesia generale per induzione volatile con isoflurano (concentrazione del 3-5%) in una scatola di induzione dell'anestesia per 30 secondi (Figura 1A) o, in alternativa, indurre l'anestesia con un'iniezione a colpo singolo di ketamina/xilazina (10/1 milligrammo (mg) per 100 g di peso corporeo).</li>
	<li>Trasferire l'animale in un luogo di lavoro e posare l'animale su un tappetino riscaldante durante l'intero esperimento. Mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37 °C.</li>
	<li>Utilizzare un naso per fornire ossigeno (600 ml / minuto). Aggiungere isoflurano 2-3% se l'anestesia volatile è stata scelta per il mantenimento dell'anestesia. Assicurati che l'animale stia respirando spontaneamente.</li>
	<li>Confermare il livello di anestesia dall'assenza del riflesso del pizzicamento delle dita dei piedi prima dell'installazione della tracheostomia e dei cateteri arteriosi e venosi.</li>
	<li>Verificare una sufficiente ossigenazione mediante monitoraggio della saturazione periferica di ossigeno (saturazione di ossigeno normale 98 - 100%).</li>
	<li>Utilizzare un unguento (unguento alla vitamina A) per proteggere gli occhi.</li>
	<li>Preparare strumenti chirurgici sterili e cateteri su un tavolino come mostrato nella Figura 1B.</li>
	<li>Inoltre, preparare il monitoraggio della pressione e della saturazione di ossigeno come mostrato nella Figura 1C.</li>
</ol>2. Accesso endovenoso
<ol><li>Applicare un laccio emostatico sulla coda prossimale del ratto per facilitare l'accesso venoso (Figura 2A).</li>
	<li>Disinfettare la coda 3 volte con alcool.</li>
	<li>Indurre un catetere endovenoso G26 in una delle due vene laterali della coda. NOTA: Dalla nostra esperienza è più facile posizionare l'accesso endovenoso nella parte distale della coda del ratto, perché la vena qui si trova più vicino alla pelle. Inoltre, in caso di cannulazione fallita, c'è abbastanza spazio per muoversi prossimalmente.</li>
	<li>Evitare rigorosamente l'iniezione d'aria.</li>
	<li>Sciogliere il laccio emostatico dopo aver posizionato il catetere endovenoso.</li>
	<li>Fissare il catetere endovenoso in posizione con nastro adesivo (Figura 2B).</li>
	<li>Collegare le pompe a siringa all'accesso endovenoso per l'applicazione continua di liquidi e farmaci.</li>
	<li>Utilizzare rubinetti a 3 vie per il liquido in bolo, l'applicazione di farmaci e il prelievo di sangue venoso.</li>
</ol>3. Tracheostomia
<ol><li>Radere l'area anteriore del collo dell'animale.</li>
	<li>Disinfettare la pelle rasata 3 volte con la soluzione di providone-iodio.</li>
	<li>Eseguire un'incisione longitudinale di circa 2 cm utilizzando un bisturi (con una lama numero 10).</li>
	<li>Ritrarre la pelle con 2-0 suture di seta.</li>
	<li>Preparare senza mezzi termini la laringe e la trachea con le forbici chirurgiche (Figura 3A).</li>
	<li>Assicurati di aprire la trachea con micro forbici chirurgiche alla3-5a fibbia tracheale.</li>
	<li>Inserire una cannula tracheale sterile nella trachea. Fare attenzione, non inserire la cannula troppo in profondità per evitare la ventilazione unilaterale.</li>
	<li>Fissare la cannula in posizione utilizzando una sutura di seta 2-0.</li>
	<li>Collegare la cannula a un ventilatore per la ventilazione controllata dalla pressione o dal volume (Figura 3B).</li>
</ol>4. Accesso arterioso
<ol><li>Disinfettare la coda del ratto 3 volte con la soluzione di povidone-iodio.</li>
	<li>Tagliare la pelle usando un bisturi (con una lama numero 10) circa 1 cm longitudinalmente sul lato ventrale.</li>
	<li>Fare attenzione, non tagliare troppo profondamente per evitare una lesione dell'arteria della coda.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio chirurgico per esporre l'arteria con attenzione. Tagliare la fascia che circonda l'arteria con micro forbici chirurgiche.</li>
	<li>Ligate la parte distale dell'arteria usando una sutura di seta 6-0.</li>
	<li>Preparare una sutura di seta prossimale 6-0 ma non stringere la seta (Figura 4A).</li>
	<li>Introdurre un catetere G-26 nell'arteria tra la sutura di seta distale e prossimale.</li>
	<li>Una volta che il catetere è nell'arteria, stringere la sutura di seta prossimale e fissare il catetere in posizione (Figura 4B).</li>
	<li>Collegare il catetere a un trasduttore di pressione per fornire una misurazione continua della pressione arteriosa (pressione arteriosa media normale: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).</li>
	<li>Inoltre, posizionare un rubinetto a 3 vie tra il catetere collegato al trasduttore di pressione e il catetere G-26 per il prelievo di sangue arterioso.</li>
</ol>5. Misurazione di base, induzione della sepsi e misurazioni di follow-up
<ol><li>Dopo che l'animale ha raggiunto uno stato stazionario, iniettare l'LPS.</li>
	<li>Raccogliere campioni di sangue quando viene raggiunto uno stato stazionario (di solito dopo 15-30 minuti).</li>
	<li>Sostituire la perdita di liquidi da campioni di sangue con la soluzione di Ringer in un rapporto di 1:4.</li>
	<li>Per indurre la sepsi, iniettare l'LPS come bolo o come applicazione LPS continua.</li>
	<li>Per l'applicazione in bolo, iniettare 1 mg di LPS/chilogrammo di peso corporeo (kg) disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 1 mg/ml.</li>
	<li>Per l'applicazione continua, iniettare 300 μg di LPS/kg/ora durante l'intero esperimento utilizzando una pompa a siringa (soluzione madre di LPS: 1 mg/mL in PBS).</li>
	<li>Evitare l'iniezione d'aria in ogni momento al fine di prevenire l'embolia atmosferica.</li>
	<li>Definire protocolli di sostituzione dei fluidi, protocolli di applicazione vasocostrittori e criteri di aborto (ad esempio ipotensione definita come una pressione arteriosa media inferiore a 50 mmHg per più di 30 minuti nonostante la sostituzione del fluido) prima di impostare l'esperimento. NOTA: Si consiglia un'infusione continua della soluzione di Ringer ad una velocità di 10 ml/kg/ora.</li>
	<li>Sottrarre qualsiasi somministrazione continua di fluidi (ad esempio, per l'applicazione LPS continua) dalla quantità infusa in modo che i risultati siano comparabili con quelli dei gruppi di controllo. NOTA: Alla fine dell'esperimento, e prima di prelevare qualsiasi organo come fegato, rene o milza per ulteriori analisi come l'esame istologico o biochimico, gli animali possono essere eutanasizzati da un'incisione della vena cava inferiore. Il metodo raccomandato di eutanasia è quello di portare gli animali su un piano chirurgico di anestesia prima dell'incisione della vena cava inferiore e dell'iniezione di soluzione salina ghiacciata nel cuore sinistro, specialmente se devono essere valutati marcatori infiammatori negli organi. Assicurarsi di rispettare i requisiti legali e le linee guida locali. Per verificare l'insufficienza d'organo correlata alla sepsi, è possibile analizzare il marcatore pro-apoptosi come la caspasi-3 e l'α1-microglobulina per verificare il danno tubulare nei reni. L'analisi specifica per organo di marcatori come CINC-1, MCP-1 e IL-6 può anche fornire informazioni sulla risposta infiammatoria specifica dell'organo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse per quanto riguarda lo studio presentato. Martin Schläpfer ha presentato un brevetto per mitigare gli effetti negativi della chirurgia e/o dell'anestesia per i pazienti che utilizzano gas medicali, in particolare ossigeno (O2) e anidride carbonica (CO2). Ha ricevuto sovvenzioni di ricerca illimitate da Sedana Medical, Svezia, e da Roche, Svizzera, non correlate a questo lavoro.

Il protocollo qui descritto consente un modello di sepsi altamente riproducibile, ma semplice da imparare, che può essere adattato in base alla domanda di ricerca. I dati essenziali in vivo che si riferiscono alla funzione degli organi come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e la saturazione di ossigeno arterioso periferico possono essere raccolti continuamente e il prelievo di sangue può essere eseguito ripetutamente durante l'esperimento. Inoltre, è possibile installare modifiche relative ai protocolli di so...

La sepsi e la sua forma più grave, lo shock settico, sono sindromi sul terreno di un'infezione, con conseguente reazione infiammatoria di overshooting con il rilascio di citochine, che porta a cambiamenti fisiologici e biochimici con una difesa immunitaria soppressa e risultati fatali 1,2. Questa reazione infiammatoria squilibrata provoca disfunzione d'organo e insufficienza d'organo in vari organi vitali come polmone, rene e fegato. Con il 37%3, la sepsi è uno dei motivi più comuni per cui un paziente deve essere ricoverato in un'unità di terapia intensiva (ICU). La mortalità per sepsi attualmente varia intorno al 20-30%4. Un trattamento antibiotico precoce ed efficace è della massima importanza5. La rianimazione di liquidi e vasopressori deve essere installata precocemente, a parte questo, il trattamento è puramente di supporto6.
La sepsi è definita come un'infezione comprovata o sospetta con batteri, funghi, virus o parassiti, che è accompagnata da disfunzione d'organo. I criteri di shock settico sono soddisfatti quando un ulteriore collasso cardiovascolare non risponde al solo trattamento con fluidi e un livello di lattato superiore a 2 millimole / litro è presente2. L'insufficienza d'organo correlata alla sepsi può verificarsi in qualsiasi organo, ma è molto comune nel sistema cardiovascolare, nel cervello, nei reni, nel fegato e nel polmone. La maggior parte dei pazienti affetti da sepsi richiede l'intubazione endotracheale per proteggere le vie aeree del paziente, per proteggere dall'aspirazione e per applicare una ventilazione espiratoria positiva con un'alta frazione di ossigeno inspirato per prevenire o superare l'ipossia. Al fine di tollerare un tubo tracheale e ventilazione meccanica, i pazienti di solito richiedono sedazione.
Le endotossine, come i lipopolisaccaridi (LPS) come componente della membrana dei batteri gram negativi, inducono una forte reazione infiammatoria attraverso il recettore toll-like (TLR) 47. L'attivazione di un percorso definito assicura una reazione infiammatoria stabile. Citochine come la proteina 1 chemioattrattante dei neutrofili indotta da citochine (CINC-1), la proteina 1 chemioattrattante monocitaria (MCP-1) e l'interleuchina 6 (IL-6) sono note come fattori prognostici per gravità ed esito in questo modello8. L'applicazione di LPS per via endovenosa è stata utilizzata con successo per studiare vari aspetti della sepsi nei ratti 8,9.
Il trattamento della sepsi è ancora una sfida, in particolare a causa della mancanza di modelli animali predittivi. Se l'endotossiemia con attivazione dell'infiammazione sistemica sia un modello adeguato per lo sviluppo di terapie farmacologiche è discutibile. Tuttavia, con il noto percorso TLR 4 indotto da LPS è possibile acquisire importanti conoscenze.

<table><tbody><tr><td>Suture di seta 2-0</td><td>Ethicon, Sommerville, NJ</td><td>K833</td><td></td></tr><tr><td>Catetere endovenoso chirurgico standard 26</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>391349</td><td>Apparecchiature per anestesia standard</td></tr><tr><td>6-0 LOOK seta intrecciata nera</td><td>Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA</td><td>SP114</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa Alaris</td> chirurgica standard <td>Bencton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma, Basilea, Svizzera</td><td>7.68034E+12</td><td>Numero GTIN</td></tr><tr><td>Micropinze a punte fini curve</td> Strumenti di <td>precisione mondiali (WPI), Sarasota, FL</td><td>504513</td><td>Facilita la preparazione vascolare</td></tr><tr><td>Micropinze a punte fini</td> Strumenti di <td>precisione mondiali (WPI), Sarasota, FL</td><td>501976</td><td>Le punte devono essere lucidate regolarmente</td></tr><tr><td>Monitoraggio dell'anestesia Infinity Delta XL</td><td>Draeger, L&uuml; beck, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, flaconi da 250 mL</td><td>Attane, Piramal, Mumbai, India</td><td>LDNI 22098</td><td>Attrezzatura veterinaria standard</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketalar)</td><td>Pfitzer, New York, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride (LPS) da Escherichia coli, sierotipo 055:B5</td><td>Sigma, Buchs, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc piccolo</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania</td><td>EH11.1</td><td>Chirurgico standard</td></tr><tr><td>Ringerfundin</td><td>Bbraun, Melsungen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore Tec-3 Isofluorane</td><td>Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL</td><td>non più disponibile</td><td>Attrezzatura veterinaria standard</td></tr><tr><td>Xilazina (Xilazina Streuli)</td><td>Streuli AG, Uznach, Svizzera</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di endotossina orientato all'unità di terapia intensiva riproducibile nei ratti

A Reproducible Intensive Care Unit-Oriented Endotoxin Model in Rats

La sepsi e lo shock settico rimangono la principale causa di morte nelle unità di terapia intensiva. Nonostante i significativi miglioramenti nella gestione della sepsi, la mortalità varia ancora tra il 20 e il 30%. Sono urgentemente necessari nuovi approcci terapeutici al fine di ridurre il fallimento multiorgano correlato alla sepsi e la morte. Modelli animali robusti consentono uno o più approcci terapeutici e di testare il loro effetto sui parametri fisiologici e molecolari. In questo articolo viene presentato un semplice modello animale.
In primo luogo, l'anestesia generale è indotta negli animali con l'uso di volatili o mediante anestesia intraperitoneale. Dopo il posizionamento di un catetere endovenoso (vena della coda), la tracheostomia e l'inserimento di un catetere intraarterio (arteria della coda), viene avviata la ventilazione meccanica. Vengono registrati valori basali della pressione arteriosa media, della saturazione di ossigeno nel sangue arterioso e della frequenza cardiaca.
L'iniezione di lipopolisaccaridi (1 milligrammo/chilogrammo di peso corporeo) disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato induce una risposta infiammatoria forte e riproducibile attraverso il recettore toll-like 4. Le correzioni dei fluidi e l'applicazione della noradrenalina vengono eseguite sulla base di protocolli consolidati.
Il modello animale presentato in questo articolo è facile da imparare e fortemente orientato al trattamento clinico della sepsi in un'unità di terapia intensiva con sedazione, ventilazione meccanica, monitoraggio continuo della pressione sanguigna e prelievo di sangue ripetitivo. Inoltre, il modello è affidabile, consentendo dati riproducibili con un numero limitato di animali in conformità con i principi 3R (ridurre, sostituire, perfezionare) della ricerca sugli animali. Mentre gli esperimenti sugli animali nella ricerca sulla sepsi non possono essere facilmente sostituiti, le misurazioni ripetitive consentono una riduzione degli animali e mantenere gli animali settici anestetizzati diminuisce la sofferenza.

Il sistema presentato consente l'endotossiemia con animali emodinamicamente stabili come riportato in precedenza9. Mentre la pressione arteriosa media rimane stabile negli animali con e senza stimolazione LPS gli animali trattati con LPS sviluppano caratteristiche di sepsi come un eccesso di base negativo e una forte reazione infiammatoria misurata dalle citochine plasmatiche (6 ore dopo l'applicazione) come CINC-1 (867 ng / mL), MCP-1 (5027 ng / mL) e IL-6 (867 ng / mL) 8,...

Qui, presentiamo un modello di endotossina riproducibile orientato all'unità di terapia intensiva nei ratti.

Un modello di endotossina orientato all'unità di terapia intensiva riproducibile nei ratti

Sepsis and septic shock remain the leading cause of death in intensive care units. Despite significant improvements in sepsis management, mortality still ...

Questo protocollo è un modello robusto e riproducibile di endotossiemia in cui i parametri fisiologici e molecolari possono essere valutati ripetutamente. Questo approccio può aiutare a rispondere alle domande nella ricerca sulla sepsi. Mentre il nostro modello non sostituisce gli esperimenti sugli animali, perfeziona i modelli di sepsi attraverso la sedazione continua e riduce il numero di animali attraverso il campionamento ripetuto.I principianti potrebbero avere difficoltà con l'inserimento di cateteri arteriosi e venosi, ma è necessaria solo una formazione limitata per padroneggiare queste tecniche. La visualizzazione dell'intera configurazione sperimentale facilita i ricercatori a impostare, o adattare, i loro modelli per imitare più da vicino una situazione in terapia intensiva. Inizia trasferendo l'animale anestetizzato su un tappetino riscaldante.Mantenere la temperatura corporea tra 36,5 e 37 gradi Celsius. Assicurati che l'animale stia respirando spontaneamente fornendo ossigeno con un cono nasale. Confermare il livello di anestesia dall'assenza del riflesso del pizzico della punta prima dell'installazione della tracheostomia e dei cateteri arteriosi e venosi.Usa un unguento per proteggere gli occhi. Preparare strumenti chirurgici sterili e cateteri insieme al monitoraggio della pressione e della saturazione di ossigeno per un'ossigenazione sufficiente. Applicare un laccio emostatico sulla coda prossimale del ratto per facilitare l'accesso venoso e disinfettare la coda tre volte con l'alcol.Introdurre un catetere endovenoso calibro 26 in una delle due vene laterali della coda evitando l'iniezione d'aria. Sciogliere il laccio emostatico dopo aver posizionato il catetere endovenoso e fissare il catetere endovenoso in posizione con nastro adesivo. Collegare le pompe a siringa con rubinetti a tre vie all'accesso endovenoso per l'applicazione continua di liquidi e farmaci.Iniziare la tracheostomia radendo l'area anteriore del collo dell'animale, quindi disinfettare la pelle rasata tre volte con una soluzione di iodio povidone. Eseguire un'incisione longitudinale di due centimetri utilizzando una lama di bisturi numero 10. Ritrarre la pelle con 2-0 suture di seta.Quindi ha preparato senza mezzi termini la laringe e la trachea da aprire con le forbici chirurgiche. Inserire una cannula tracheale sterile nella trachea, facendo attenzione a non penetrare troppo in profondità per evitare la ventilazione unilaterale. Fissare la cannula in posizione utilizzando una sutura di seta 2-O e quindi collegare la cannula a un ventilatore per la ventilazione a pressione o a volume controllato.Definire protocolli di sostituzione dei fluidi, protocolli di applicazione vasocostrittori e criteri di aborto prima di impostare l'esperimento. Disinfettare la coda del ratto tre volte con la soluzione di iodio povidone e quindi tagliare il cerchio cutaneo di un centimetro longitudinalmente sul lato ventrale usando un bisturi, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità per evitare una lesione dell'arteria della coda. Utilizzare un microscopio chirurgico per esporre l'arteria con attenzione.Tagliare la fascia che circonda l'arteria con micro forbici chirurgiche. Quindi ligatare la parte distale dell'arteria eseguendo la sutura prossimale di seta 6-0, ma non stringere la seta. Introdurre un catetere calibro 26 nell'arteria tra la sutura di seta distale e prossimale, quindi stringere la sutura di seta prossimale per fissare il catetere in posizione.Collegare il catetere a un trasduttore di pressione per fornire una misurazione continua della pressione arteriosa. Inoltre, posizionare un rubinetto a tre vie tra il catetere collegato al trasduttore di pressione e il catetere a 26 gauge per il prelievo di sangue arterioso. Dopo che l'animale ha raggiunto uno stato stazionario, ha indotto la sepsi iniettando LPS e raccogliendo campioni di sangue.Sostituire la perdita di liquidi dai campioni di sangue con la soluzione di Ringer in un rapporto da uno a quattro, evitando l'iniezione di aria in ogni momento al fine di prevenire l'embolia atmosferica. La pressione arteriosa media rimane stabile negli animali con e senza stimolazione LPS. Gli animali trattati con LPS sviluppano caratteristiche di sepsi, come l'eccesso di base negativo.Gli animali trattati con LPS hanno anche sviluppato una forte reazione infiammatoria, che è stata misurata dalle citochine plasmatiche, come la proteina chemioattrattante-1, la proteina-1 chemioattrattante monocitaria e l'interleuchina-6. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di predefinire regimi fluidi e vasopressori e di definire criteri di terminazione al fine di ottenere dati di ricerca solidi e riproducibili. Questo protocollo può essere adattato ad altri modelli di sepsi.Quindi una domanda di ricerca viene risolta con l'approccio più adatto e in conformità con i principi di ridurre, perfezionare, sostituire il benessere degli animali.

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Una polmonite Modello robusto in immunocompetenti roditori per valutare antibatterico efficacia contro<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; o<em&gt; A. baumannii</em

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Impara un modello riproducibile di endotossiemia nei ratti per la ricerca sulla sepsi in terapia intensiva. Questo metodo consente valutazioni ripetute dei parametri fisiologici e molecolari, riducendo il numero di animali necessari.

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