Name: Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Impara a separare cellule follicolari e ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish utilizzando una capillare di vetro tirato. Questo metodo rapido riduce i danni agli ovociti e supporta colture primarie, analisi dell'espressione genica e fecondazione in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 e 31560334], progetto di visiting scholar sostenuto dal China Scholarship Council e dal fondo del Laboratorio chiave statale di ecologia e biotecnologia d'acqua dolce [2020FB05].

Tutte le procedure eseguite negli esperimenti sui pesci sono conformi alle normative del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale della Northwest Normal University.
1. Preparativi
<ol><li>animali<ol>
<li>Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm. NOTA: Abbiamo usato il pesce zebra di un mercato locale.</li>
		<li>Mantenere il pesce zebra in un sistema idrico circolato con una luce di 14 ore e un ciclo buio di 10 ore a circa 28 °C.</li>
		<li>Nutrire il pesce due volte al giorno con gamberetti salamoia appena nati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capillare in vetro tirato<ol>
<li>Utilizzare un capillare di vetro di 15 cm e posizionare la testa in un bruciatore di alcol per riscaldarlo. Tenere un'estremità del vetro capillare a mano e tenere l'altra estremità con le forcep.</li>
		<li>Dopo aver riscaldato 5-10 secondi, il vetro sul fuoco del bruciatore di alcol diventa rosso e morbido. Allungare la testa del capillare di vetro con le forcep per rendere l'apertura capillare con il diametro richiesto. NOTA: Il diametro dipende dai diametri del follicolo: previtellogenico (PV; circa 0,30 mm di diametro), vitellogenico precoce (EV; circa 0,40 mm di diametro), midvitellogenico (MV; circa 0,50 mm di diametro), vitellogenico tardivo (LV; circa 0,60 mm di diametro) e pieno ma immaturo (FG; circa 0,65 mm di diametro).</li>
		<li>Allungare l'apertura del capillare di vetro al diametro appropriato, che è leggermente più piccolo delle dimensioni dei follicoli separati. Il capillare di vetro con un'apertura molto più grande delle dimensioni dei follicoli ovarico non può eseguire la separazione, ma quelli molto più piccoli romperebbero i follicoli durante la separazione. Praticare più volte lo stiramento del capillare di vetro. NOTA: Il tempo di riscaldamento dipende dalle dimensioni del capillare di vetro. Non allungare direttamente il capillare di vetro sul fuoco del bruciatore di alcol. Romperà il capillare di vetro.</li>
		<li>Tagliare il capillare in vetro con una fresa ad ampolla e rompere il capillare di vetro con le forcep per ottenere un'incisione liscia. NOTA: Un'apertura affilata o rotta del capillare di vetro danneggerebbe i follicoli.</li>
		<li>Utilizzando un tubo di plastica da 30 cm, inserire una punta della pipetta da 1 ml con un elemento filtrante ad un'estremità, inserire il capillare di vetro tirato all'estremità della pipetta e collegare una punta della pipetta da 200 μL su un'altra estremità.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari in diverse fasi
<ol><li>Dissezione dell'ovaio zebrafish<ol>
<li>Riempire un secchio di ghiaccio a 4/5 pieno di ghiaccio liquame e aggiungere acqua di pesce sufficiente per far galleggiare il ghiaccio liquame. Attendere 2-5 minuti, controllare la temperatura dell'acqua e assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 2-4 °C.</li>
		<li>Anestetizza le femmine adulte posizionando i pesci nell'acqua ghiacciata per almeno 2-5 minuti, fino a quando i pesci non interrompo il movimento delle branchie. Decapitare il pesce tagliando il midollo spinale usando forbici affilate per garantire la morte.</li>
		<li>Posizionare il pesce sulla piastra di sezionazione con le forcep.</li>
		<li>Utilizzare le forbici sezionanti per tagliare come segue. Sezionare dalla cloaca alle branchie lungo la linea mediana dell'addome. Tagliato dal retro della cloaca. Tagliare dalla punta anteriore al lato dorsale. Rimuovere delicatamente la pelle e i muscoli su un lato del corpo. Esporre gli organi interni ed esegnare l'intera ovaia con le forcep.</li>
		<li>Immediatamente, posizionare delicatamente le ovaie in un piatto di coltura da 100 mm contenente il mezzo L-15 (L-15) di Leibovitz al 60%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento dei follicoli ovarico NOTA: Il sistema di staging che abbiamo adottato si basa sulla definizione originale di Selman etal.<ol>
<li>Isolare manualmente follicoli di stadi diversi utilizzando una coppia di forcep fini come descritto in precedenza8.</li>
		<li>Raggruppare i follicoli ovarico nelle seguenti fasi: stadi PV, EV, MV, LV e FG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici<ol>
<li>Mettere i follicoli ovarico in diverse fasi in una piastra di Petri pulita contenente il 60% di mezzo L-15.</li>
		<li>Utilizzando il capillare di vetro tirato dal passo 1.2, succhiare i follicoli nel capillare di vetro di 2-3 cm e soffiarli fuori. NOTA: Quando il diametro di apertura dei capillari di vetro è appropriato, il follicolo può essere separato dall'ovocita per inalazione una volta.<ol>
<li>Se lo strato cellulare follicolare è attaccato saldamente all'ovocita, ripetere 2-3 volte per eseguire una separazione completa. Evitare molteplici tentativi di forzare un follicolo attraverso un capillare più piccolo, che danneggerebbe il follicolo. NOTA: Nel processo di inalazione e soffiatura, lo strato follicolare cade e si separa dall'ovociti e, infine, le cellule follicolari e gli ovociti denudati sono separati(Figura 1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mettere in comune gli ovociti denudati ma intatti e raccogliere gli ovociti denudati sopravvissuti per ulteriori saggi.</li>
		<li>Per verificare se le cellule follicolari sono state separate da follicoli intatti, macchiare i follicoli intatti e separare gli ovociti con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).<ol>
<li>Fissare i campioni in paraformaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente (RT) per 1 h. Lavare più volte da PBS.</li>
			<li>Macchia da DAPI a RT per 30 min. Lavato più volte con PBS. Visualizza e fotografa con un microscopio a fluorescenza (ad esempio, Leica DFC7000 T).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per confermare la separazione completata, fissare i follicoli intatti e gli ovociti separati in paraformaldeide tamponata al 4% durante la notte a 4 °C e incorporare il mezzo di congelamento dell'intissue (ad esempio, Leica) a -25 °C.<ol>
<li>Tagliare i tessuti fissi su un microtomo e montare su scivoli di vetro.</li>
			<li>Lavare le sezioni in PBS e visualizzare i nuclei cellulari con DAPI. Visualizza e fotografa su un microscopio a fluorescenza.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Maturazione in vitro (IVM) e fecondazione in vitro (FIV)
NOTA: La procedura di IVM di fecondazione in vitro è stata seguita come descritto in precedenza con modifica minore 11,12,13.
<ol><li>Preparare il mezzo di maturazione fresco (+DHP medium) prima della dissezione dell'ovaio dalla femmina adulta di zebrafish. Per preparare il mezzo di maturazione fresco, aggiungere 9 ml del mezzo L-15 di Leibovitz, pH 9,0, a tubi conici da 15 ml. Aggiungere 10 μL di 17α-20β-diidrossi-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL di dH2O e 500 μL di albumina sierica bovina al 10% (BSA).</li>
	<li>Preparare in anticipo la soluzione Hank e la soluzione E3. Preparare la soluzione di Hanks come descritto da Baars etal. Preparare mezzo E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4e 1-5% Methylene Blu.</li>
	<li>Eseguire la dissezione dell'ovaio di zebrafish e l'isolamento dei follicoli ovarico come nei passaggi 2.</li>
	<li>Raccogli follicoli da stadio adulti e usalo come ovociti immaturi. Per ogni femmina adulta di zebrafish, almeno 150-200 follicoli a stadio adulto possono essere isolati. Selezionare i follicoli integri e sani per IVM.</li>
	<li>Incubare i follicoli da stadio adulti in mezzo +DHP in piastre da 12 po ', controllando periodicamente per garantire che gli ovociti rimangano intatti. Rimuovere eventuali ovociti di lysing con una pipetta Pasteur. NOTA: Durante la maturazione degli ovociti, gli ovociti diventeranno progressivamente traslucidi. La maggior parte degli ovociti diventa traslucida dopo il trattamento del DHP per 2 ore. Questo può essere osservato al microscopio sezionato con ottica a luce trasmessa.</li>
	<li>Rimuovere le cellule follicolari più ose da ogni ovociti maturato come descritto nel passaggio 2.3.</li>
	<li>Trasferire gli ovociti denudati in una piastra di Petri con alcune gocce di mezzo di coltura e procedere alla fecondazione.</li>
	<li>Preparare la soluzione di sperma fresco utilizzando teste sezionate da almeno tre maschi in 500 μL della soluzione di Hanks. Metti la soluzione di sperma sul ghiaccio, dove può mantenere la sua potenza di fecondazione fino a 2-3 ore.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione spermatica agli ovociti denudati e maturati su una piastra di Petri. Aggiungere delicatamente la soluzione di spermatozoi tra le uova e ruotare lo sperma e le uova insieme usando una punta di pipetta.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 1 mL di soluzione media E3 per attivare le uova e di nuovo ruotare delicatamente uova e spermatozoi utilizzando una punta di pipetta.</li>
	<li>Dopo circa 1 minuto di post-fecondazione (mpf), inondare la piastra con soluzione media E3. L'espansione completa del corrione può essere osservata entro 10-15 mpf.</li>
	<li>Tra 35-45 mpf, selezionare gli embrioni che sono sottoposti a scissione simmetrica nello stadio a 2 cellule e che vengono quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono sottoposti a scissione cellulare.</li>
	<li>Consentire agli embrioni di svilupparsi nella piastra di Petri a 28 °C, con un limite di 80 embrioni per piastra di 10 cm. Visualizza e fotografa lo sviluppo dell'embrione.</li>
</ol>

<ol><li>Clelland, E., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine%2Fparacrine+control+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine/paracrine control of zebrafish development.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).</li>
<li>Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafollicular+paracrine+communication+in+the+zebrafish+ovary%3A+the+state+of+the+art+of+an+emerging+model+for+the+study+of+vertebrate+folliculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).</li>
<li>Li, J., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+studying+ovarian+development%3A+Recent+advances+from+targeted+gene+knockout+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication+in+the+mammalian+ovary%3A+oocytes+carry+the+conversation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation.</a> Science. 296, 2178-2180 (2002).</li>
<li>Liu, L., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+differentiation+factor+9+and+its+spatiotemporal+expression+and+regulation+in+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary.</a> Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).</li>
<li>Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+%28PACAP%29+and+its+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+evidence+for+potentially+dual+roles+of+PACAP+in+controlling+final+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).</li>
<li>Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+3+is+involved+in+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish.</a> Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+G+protein-coupled+estrogen+receptor+1%2C+GPER%2C+in+inhibition+of+oocyte+maturation+by+endogenous+estrogens+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish.</a> Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).</li>
<li>Peyton, C., Thomas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+in+estrogen+inhibition+of+oocyte+maturation+mediated+through+the+G+protein-coupled+estrogen+receptor+%28Gper%29+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio).</a> Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).</li>
<li>Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+manipulation+of+maternal+gene+products+using+in+vitro+oocyte+maturation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).</li>
<li>Seki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+reliable+in+vitro+maturation+system+for+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes.</a> Reproduction. 135, 285-292 (2008).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+heat+shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).</li>
<li>Xie, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+based+on+in+vitro+oocyte+injection+to+improve+CRISPR%2FCas9+gene+editing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 34555(2016).</li>
<li>Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+PDE9a+in+meiotic+maturation+of+zebrafish+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo qui un nuovo metodo per la semplice e rapida separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il principale di questi è la facilità di separazione notevolmente aumentata con alta efficienza ed efficacia, in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna. Questo punto aumenta l'applicabilità ai ricercatori che non sono bravi nell'anatomia microscopica. Secondo la nostra esperienza, si possono separa...

Zebrafish è un importante organismo modello per lo studio dello sviluppo e della fisiologia dei vertebrati. Il pesce zebra può servire come un buon modello per lo studio dei meccanismi molecolari dello sviluppoovarico 1,2,3. Molte caratteristiche dello sviluppo ovarico sono molto conservate durante l'evoluzione dai pesci ai mammiferi1,2. Simile agli altri vertebrati, gli adulti zebrafish hanno ovaie asincrone, contenenti follicoli ovarico di tutte le fasi di sviluppo4. Il follicolo è l'elemento riproduttivo fondamentale dell'ovaio. Il follicolo è costituito dall'ovocitio che è circondato da uno o più strati di cellule somatiche chiamate cellule follicolari. Lo sviluppo dei follicoli dipende dalla comunicazione bidirezionale tra ovociti e cellule follicolari5. È fondamentale separare le cellule follicolari e gli ovociti dai follicoli ovarici per diversi scopi di ricerca come la coltura primaria delle cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro.
I metodi di separazione tradizionali includono la separazione meccanica mediante forcep e digestioneenzimatica 6,7,8,9,10. Tuttavia, la separazione meccanica per forcep è dispendiosa in termini di tempo e laboriosa. Causerà anche l'alto danno all'ovocita durante la separazione. Sebbene il metodo di digestione enzimatica sia semplice da usare e richieda un breve periodo di tempo, il tempo di trattamento e la concentrazione enzimatica devono essere convalidati e il tasso di integrità e sopravvivenza degli ovociti isolati non è l'ideale. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti in diversi stadi di sviluppo utilizzando tubi capillari in vetro tirato.

<table><tbody><tr><td>17&alfa;,20&beta;-DHP</td><td>Cayman</td><td>16146-5 (5 mg)</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Taglierina per fiale</td><td>AS ONE</td><td>5-124-22 1 busta (100 pezzi)</td><td></td></tr><tr><td>Anidro Na2HPO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Gamberetti in salamoia</td><td>Hongjie</td><td>250 g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura</td><td>Biosharp</td><td>BS-90-D (10PCS/PK)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>S2110 (25mL)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Pinza da dissezione</td><td>VETUS</td><td>HRC30</td><td></td></tr><tr><td>Forbice da dissezione</td><td>Kefu</td><td>160 mm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P (200 pz/CONF.)</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Solarbio</td><td>C0031 (1 mg)</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Kaixin Chemical</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medio</td><td>Gibco</td><td>41300-039 (10&volte; 1L)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipette</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Beichen Fangzheng</td><td>500 g</td><td></td></tr><tr><td>Penicilia-streptomycia</td><td>Gibco</td><td>#15140122 (100 mL)</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>ZEISS</td><td>Scopri.v20</td><td></td></tr></tbody></table>

separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish è diventato un modello ideale per studiare lo sviluppo ovarico dei vertebrati. Il follicolo è l'unità di base dell'ovaio, che consiste di ovociti e cellule follicolari circostanti. È fondamentale separare sia le cellule follicolari che gli ovociti per vari scopi di ricerca come per la coltura primaria di cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro, ecc. Il metodo convenzionale utilizza le forcep per separare entrambi i compartimenti, il che è laborioso, richiede molto tempo e ha alti danni all'ovocita. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti utilizzando un capillare in vetro tirato. Sotto uno stereomicroscopio, gli ovociti e le cellule follicolari possono essere facilmente separati mediante pipettazione in un capillare di vetro fine tirato (il diametro dipende dal diametro del follicolo). Rispetto al metodo convenzionale, questo nuovo metodo ha un'alta efficienza nella separazione sia degli ovociti che delle cellule follicolari e ha bassi danni agli ovociti. Ancora più importante, questo metodo può essere applicato ai follicoli in fase iniziale anche nella fase pre-vitellogenesi. Pertanto, questo semplice metodo può essere utilizzato per separare le cellule follicolari e gli ovociti del pesce zebra.

Questo metodo può essere utilizzato per separare cellule follicolari e ovociti in diverse fasi dello sviluppo del follicolo ovarico nel pesce zebra. La figura 1 mostra la separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari dai follicoli ovarici utilizzando un tubo di vetro capillare (Figura 1). Per verificare se le cellule follicolari fossero separate da follicoli intatti, i follicoli intatti e gli ovociti separati da diversi stadi dei follicoli dall...

Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è separare le cellule follicolari e gli ovociti nel follicolo ovarico di Zebrafish. Il follicolare è l'unità di base dell'ovaio, che consiste degli ovociti e delle cellule follicolari circostanti. È l'ampio strumento per separare sia la cellula follicolare che i compartimenti esterni per politiche ben ricercate tra cui la cattura primaria delle cellule follicolari e l'aumento dell'espressione genica, tutta la saturazione e la fecondazione in vitro.Recentemente, zebrafish è diventato un potente modello di Nissan, che studia un controllo dello sviluppo già. Qui, presentiamo un metodo semplice, quindi separa le cellule follicolari e gli ovociti del follicolo Zebrafish che faciliterà le indagini sullo sviluppo già in Zebrafish Lo spot, nessuna massa o i due separati sulle cellule follicolari e su tutti i lati dei giri utilizzano post che ha un labirinto, richiede tempo e ha avuto alti danni all'esterno. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per due scomparti separati usando o in parte gli occhiali tasso Tamela sotto una barriera corallina pura.Il nostro mirino Metro, sia all'esterno che alle cellule follicolari, può essere facilmente fabbric

separation-follicular-cells-oocytes-ovarian-follicles

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Un protocollo ottimizzato per la maturazione in vitro di oociti zebrafish utilizzati per la manipolazione di prodotti genici materni è presentato qui.

Manipolazione funzionale delle materne genica Utilizzando<em&gt; In Vitro</em&gt; La maturazione degli ovociti in Zebrafish

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

L'avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l'isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.

Isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino utilizzando una combinazione di frammentazione, omogeneizzazione e filtrazione seriale

Questo protocollo descrive una procedura modificata per isolare rapidamente ovociti puliti allo stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa, fornendo così un metodo conveniente per la ricerca specifica per gli ovociti.

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

Qui, descriviamo un protocollo per separare il tuorlo, le cellule della granulosa e le cellule della teca nei follicoli preovulatori aviari. Questa manipolazione di precisione consente indagini critiche sul ruolo di questi strati nella funzione riproduttiva, aiutando la comprensione dello sviluppo follicolare, della regolazione ormonale e della ricerca sulle malattie per migliorare la resa agricola e le intuizioni biomediche.

Separazione di strati di granulosi e cellule di teca del follicolo preovulatorio aviario per applicazioni a valle

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

Presentiamo le tecniche necessarie per isolare la frazione vascolare stromale (SVF) dai depositi di tessuto adiposo inguinale (sottocutaneo) e perigonadico (viscerale) di topo per valutare la loro espressione genica e l'attività collagenolitica. Questo metodo include l'arricchimento di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC)ad alto contenuto di Sca1 utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.

Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

Impara a separare cellule follicolari e ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish utilizzando una capillare di vetro tirato. Questo metodo rapido riduce i danni agli ovociti e supporta colture primarie, analisi dell'espressione genica e fecondazione in vitro.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Esplora altri video