Name: Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri il saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare. Questo metodo utilizza liposomi con coloranti fluorescenti per analizzare le interazioni peptido-membrana.

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Gli autori ringraziano Emilie Josse per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione "La Ligue contre le Cancer", dalla "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" e dal "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Preparazione di grandi vescicole unilamellari (LUV)
<ol><li>Preparare i ROV per il loro uso come membrana cellulare mimica per il test di perdita di fluorescenza.</li>
	<li>Mescolare con una siringa di vetro Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g / mol), sfingomielina (SM, 760,22 g / mol) e colesterolo (Chol, 386,65 g / mol) al rapporto molare 4: 4: 2. La soluzione lipidica è ottenuta da una soluzione stock di ciascun lipide solubilizzato in un solvente a metanolo/cloroformio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL in un pallone a fondo tondo di vetro da 25 ml. Sulla base di 4 μmol di DOPC, 4 μmol di SM e 2 μmol di Chol, la soluzione lipidica è ottenuta da soluzione stock mescolando rispettivamente 126 μL, 117 μL e 31 μL. ATTENZIONE: Il metanolo è un solvente tossico e infiammabile e il cloroformio è tossico e cancerogeno. Entrambi devono essere maneggiati con la protezione appropriata sotto un cappuccio.</li>
	<li>Evaporare metanolo/cloroformio utilizzando un evaporatore rotativo sotto vuoto per 45-60 minuti a 60 °C fino alla formazione di un film lipidico essiccato.</li>
	<li>Preparare due soluzioni tampone HEPES di serie. Preparare il tampone HEPES 1 mescolando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e regolare il pH a 7,4. Preparare il tampone HEPES 2 mescolando 20 mM HEPES e 145 mM NaCl e regolare il pH a 7,4. I tamponi HEPES possono essere conservati a 4 °C per 1 mese. NOTA: Si consiglia di verificare l'osmolarità dei buffer utilizzando un osmometro.</li>
	<li>Preparare la soluzione di idratazione lipidica sciogliendo la coppia colorante-quencher fluorescente impermeabile alla membrana, 8-aminonaftalene-1, 3, acido 6-trisolfonico, sale disodico a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e p-xilene-bispyridinium bromuro a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) in soluzione tampone HEPES. La miscelazione di ANTS con DPX porta a una soluzione di colore giallo. Per raggiungere le concentrazioni di 12,5 mM di ANTS e 45 mM di DPX, sciogliere 21,4 mg e 76 mg, rispettivamente in 4 mL di tampone HEPES 1. NOTA: La soluzione di idratazione lipidica può essere conservata per 2 settimane a 4 °C avvolgendo il tubo con un foglio di alluminio.</li>
	<li>Ricostituire le vescicole multilamellari (MLV) riconsesciendo il film lipidico essiccato con 1 mL della soluzione di idratazione lipidica e vorticosamente fino alla dissoluzione del film lipidico essiccato. Assicurarsi che la soluzione sia completamente solubilizzata poiché piccoli aggregati lipidici avranno un impatto negativo sui passaggi precedenti. Inoltre, controllare la parete del pallone di vetro a fondo tondo per assicurarsi che non vi sia alcun film lipidico rimanente. NOTA: La soluzione apparirà opalescente e giallo chiaro dopo la solubilizzazione.</li>
	<li>Sottoporre le vescicole a cinque cicli di congelamento/disgelo per ottenere vescicole unilamellari. Eseguire ogni ciclo mettendo il pallone di vetro a fondo tondo per 30 s in azoto liquido per la fase di congelamento, quindi lasciandolo a bagnomaria per 2 minuti per la fase di scongelamento. NOTA: La temperatura dell'acqua del bagno deve essere superiore di 5-10°C alla temperatura di fusione dei lipidi.</li>
	<li>Preparare l'estrusore lipidico inserendo due supporti filtranti preliminarmente umidificati con tampone HEPES in ciascun pezzo di estrusore in politetrafluoroetilene (PTFE) posto nel contenitore dell'estrusore metallico.</li>
	<li>Mettere una membrana in policarbonato umidificato HEPES (dimensione dei pori di 0,1 μm, diametro 25 mm) sulla parte superiore di un supporto del filtro.</li>
	<li>Assemblate i due monti per estrusori metallici e avvitali.</li>
	<li>Posizionare l'estrusore assemblato nel supporto e introdurre una siringa da 1 mL nel foro appropriato all'estremità di ciascun pezzo di estrusore di politetrafluoroetilene. L'estrusione corrisponde al passaggio del liquido testato da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato.</li>
	<li>Testare l'estrusore con 1 mL di buffer HEPES caricato in una delle siringhe da 1 mL per assicurarsi che non vi siano perdite o problemi.</li>
	<li>Sostituire il buffer HEPES da 1 mL con il campione MLV.</li>
	<li>Eseguire l'estrusione facendo passare il campione MLV da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato almeno 21 volte per ottenere LUT uniformi delle stesse dimensioni. NOTA: L'estrusione deve essere eseguita a una temperatura superiore alla temperatura di fusione della miscela lipidica.</li>
</ol>2. Purificazione dei UV
<ol><li>Preparare una purificazione della colonna per rimuovere l'eccesso di ANTS e DPX non incapsulato.</li>
	<li>Introdurre gel destro reticolato (G-50) risospenso in mezzo acquoso con 0,01% NaN3 (65 g/mol) in una colonna per cromatografia liquida (Luer Lock, non rivestita, 1,0 cm x 20 cm, volume letto 16 mL) fino a 1 cm sotto la parte superiore della parte incolore della colonna.</li>
	<li>Aprire il rubinetto e lasciare scorrere il liquido per depositare il gel destrorso reticolato.</li>
	<li>Lavare la colonna eluita con 20 mL di buffer HEPES 2 ed eliminare il flusso di uscita della colonna.</li>
	<li>Chiudere il rubinetto una volta che il volume morto di solvente sopra la colonna è ridotto al minimo (<100 μL) ma sufficiente per evitare qualsiasi essiccazione del gel destrone reticolato.</li>
	<li>Posizionare i ROV appena estrusi (gialli) sulla colonna e farli entrare nel gel destrorso reticolato.</li>
	<li>Aggiungere continuamente il buffer HEPES 2 alla colonna per eseguire la purificazione LUV.</li>
	<li>Eluire circa 2 mL di tampone HEPES 2 (non dimenticare di riempire regolarmente la parte superiore della colonna per evitare di asciugare il gel destrolare reticolato): la soluzione libera gialla ANTS e DPX migra più lentamente dei liposomi.</li>
	<li>Inizia a raccogliere ROV purificati in tubi (1,5 ml).</li>
	<li>Osserva le gocce di eluente dalla colonna e quando diventano opalescenti, contengono liposomi. Cambiare il tubo per recuperare la frazione contenente LUV.</li>
	<li>Eluire fino a quando le gocce non sono più opalescenti (~1 mL). Successivamente, eluire altri 0,5 ml in una frazione separata e quindi interrompere l'eluizione. NOTA: Gli standard sono ora disponibili in una vasta gamma di pesi molecolari, come kit o singoli pesi molecolari per calibrare il volume di eluizione dei LUN.</li>
	<li>Avvolgere i tubi con i ROV in un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del colorante a fluorescenza.</li>
	<li>Lavare la colonna con un buffer HEPES da 20 ml 2.</li>
	<li>I LUN possono quindi essere conservati per una settimana a 4 °C. NOTA: Poiché la stabilità LUV potrebbe dipendere dalla concentrazione e dalla composizione di LUV, nonché dalla forza ionica, la dimensione dei UV deve essere controllata utilizzando uno strumento di diffusione dinamica della luce (DLS) (vedere paragrafo 4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità LUV) prima di ogni test.</li>
</ol>3. Quantificare la concentrazione di ROV
<ol><li>Stimare la concentrazione di LUV mediante un kit di quantificazione dei fosfolipidi, che consente la valutazione della concentrazione di colina19. Questo test potrebbe essere applicato quando i fosfolipidi con colina contenente testa polare sono sostanziali (>50% dei LUV).</li>
	<li>Preparare il reagente colorante sciogliendo 18 mg di substrato cromogeno in 3 mL di tampone fornito.</li>
	<li>Caricare una cuvetta di polistirene, 10 x 10 x 45 mm, con 3 ml di reagente di colore.</li>
	<li>Utilizzare il reagente di colore puro come condizione vuota (Blank). Aggiungere 20 μL di campione LUV (Test) o 20 μL di soluzione standard di concentrazione nota di colina (Standard).</li>
	<li>Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 37 °C tutte le condizioni (Blank, Test e Standard).</li>
	<li>Misurare l'assorbanza (densità ottica, OD) del campione di prova e della soluzione standard con la soluzione in bianco come controllo a 600 nm con uno spettrofotometro.</li>
	<li>Controllare i valori OD che consentono di stimare la concentrazione lipidica dei LUD, C[LUV], in equivalente colina rispetto allo standard di concentrazione nota.</li>
	<li>Eseguire il calcolo utilizzando la seguente equazione: C[LUV] (mol / l) = (Campione OD / Standard OD) x C[Standard] (mol / l) NOTA: Il kit di quantificazione dei fosfolipidi ha fornito una soluzione standard di cloruro di colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL corrispondente alla concentrazione molare di C[Standard] = 3,87 mmol/L. OD Sample e OD Standard sono le assorbanze misurate a 600 nm per le soluzioni LUV e Colina, rispettivamente.</li>
</ol>4. Caratterizzazione delle dimensioni e dell'omogeneità del LUV
<ol><li>Eseguire una misurazione utilizzando uno strumento DLS per determinare la dimensione LUV (in nm) e l'indice di polidispersità (PdI).</li>
	<li>Programmare la "procedura operativa standard" (SOP) appropriata indicando la viscosità del solvente/tampone e della cuvetta utilizzata.</li>
	<li>Posizionare 500 μL della soluzione di LUV in una semi-micro cuvetta di polistirene.</li>
	<li>Inserire la semi-micro cuvetta in polistirene in uno strumento DLS.</li>
	<li>A temperatura ambiente, misurare la distribuzione dimensionale in termini di dimensione media (Z-media) della distribuzione delle particelle e di omogeneità (indice di polidispersità, PdI).</li>
	<li>Tutti i risultati sono ottenuti da due misurazioni indipendenti eseguite ciascuna in tre cicli ripetitivi. NOTA: i valori standard per i LUV saranno una dimensione media di 137 ± 7 nm con un PdI di 0,149 ± 0,041.</li>
</ol>5. Preparazione di soluzioni peptidiche
<ol><li>Preparare una soluzione stock del peptide, che deve essere analizzata per il test di perdita.</li>
	<li>Sciogliere la polvere peptidica (purezza >95%) in acqua pura (ad esempio, 1 mg di peptide in 500 μL di acqua pura). NOTA: Si raccomanda di diluire i peptidi in acqua pura e di evitare la solubilizzazione del dimetilsolfossido (DMSO), che potrebbe indurre artefatti (ad esempio, permeabilizzazione della membrana20).</li>
	<li>Vortice la soluzione peptidica per 5 s.</li>
	<li>Sonicare la soluzione peptidica in un bagno di sonicazione in acqua per 5 minuti e quindi centrifugare per 5 minuti a 12.225 x g. Raccogliere il surnatante per la determinazione della concentrazione.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 280 nm di tre diluizioni peptidiche indipendenti e quindi calcolare la concentrazione peptidica utilizzando il suo coefficiente di estinzione molare ε (a seconda del contenuto di triptofano e tirosina nella sequenza peptidica) e la regola di Beer-Lambert. NOTA: Se il peptide contiene triptofano e tirosina, il coefficiente di estinzione molare ε viene calcolato sulla base di triptofano ε = 5.690 M-1cm-1 e tirosina ε = 1.280 M-1cm-1. Se la sequenza peptidica non contiene triptofano o tirosina, è possibile eseguire altri test colorimetrici per misurare la concentrazione (ad esempio, BCA o Bradford).</li>
	<li>Diluire la soluzione peptidica in acqua pura fino a una soluzione finale di 100 μM e conservare a 4 °C. NOTA: In acqua pura, non si verifica alcuna degradazione peptidica durante lo stoccaggio a 4 °C. Tuttavia, la concentrazione di peptidi deve essere misurata ogni 2 settimane per garantire che non si verifichi alcuna evaporazione dell'acqua.</li>
</ol>6. Saggio di perdita di fluorescenza
<ol><li>Il saggio di perdita di fluorescenza viene misurato su uno spettrofluorometro a temperatura ambiente. La lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione è fissata rispettivamente a Ex = 360 nm ± 3 nm ed Em = 530 nm ± 5 nm.</li>
	<li>Diluire i ROV in tampone HEPES 2 da 1 mL fino a una concentrazione finale di 100 μM in una cuvetta a fluorescenza al quarzo. Aggiungere un agitatore magnetico per omogeneizzare la soluzione durante l'esperimento.</li>
	<li>Misurare i SOLI ROV durante i primi 100 s, tra t = 0 s e t = 99 s per accedere alla fluorescenza di fondo. NOTA: I SOLI VUV potrebbero anche essere misurati durante l'intero esperimento (15 min) per accedere alla fluorescenza di fondo e alle potenziali perdite.</li>
	<li>Successivamente, misurare la perdita come un aumento dell'intensità di fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica per i successivi 900 s (15 min). Questo protocollo viene eseguito per ogni concentrazione di peptide testata da 0,1 μM a 2,5 μM.</li>
	<li>Infine, la fluorescenza al 100% è stata ottenuta solubilizzando i UV con l'aggiunta di 1 μL di Triton X-100 (0,1%, v/v), risultando nella sonda completamente inestinguibile tra t = 1.000 s e t = 1.100 s.</li>
</ol>7. Quantificazione della perdita
<ol><li>Sopprimere i valori ottenuti dopo t = 1.090 s per mantenere lo stesso numero di punti per ogni condizione testata.</li>
	<li>Calcola la fluorescenza minima, Fmin, facendo la media di 50 punti tra t = 0 s e t = 49 s (solo LUV).</li>
	<li>Calcola la fluorescenza massima, Fmax, facendo la media di 50 punti tra t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUN con Triton X-100).</li>
	<li>Calcola la percentuale di perdita (%Perdita) in ogni punto temporale (t = x), secondo la seguente equazione: %Perdita(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Calcolare la deviazione media e standard per i valori ottenuti con diversa preparazione LUV (n ≥ 2) per la stessa condizione.</li>
	<li>Traccia la percentuale di perdita, %Perdita(t=x), in funzione del tempo (i).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Il test di perdita di fluorescenza presentato è un metodo semplice e veloce per affrontare la destabilizzazione della membrana da parte del peptide che penetra nelle cellule. Facile da fare, consente anche un confronto indiretto tra diversi peptidi che interagiscono con la membrana o altre molecole che interagiscono con la membrana. Per quanto riguarda le fasi critiche del protocollo, poiché questo test fornisce valori relativi tra il basale (SOLO LUV) e il massimo rilascio di fluorescenza (condizione di Triton), di soli...

Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membranaplasmatica 1,2. I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un'ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori "traslocanti diretti", il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, ulteriori indagini hanno rivelato che queste prime osservazioni provenivano principalmente da sovrastima di fluorescenza dovuta all'artefatto sperimentale e / o ai protocolli di fissazione che utilizzavano metanolo3. Al giorno d'oggi, è ampiamente accettato che l'assorbimento di CPP avviene sia per endocitosi che per traslocazione indipendente dall'energia4,5,6,7 a seconda di diversi parametri come la natura del carico, il collegamento utilizzato tra CPP e carico, la linea cellulare studiata, ecc.
I CPP possono essere utilizzati come agenti di trasfezione secondo due strategie, che coinvolgono un legame chimico (strategia covalente) o interazioni elettrostatiche / idrofobiche (strategia non covalente) tra il CPP e il suo carico8,9,10,11. Sebbene entrambe le strategie abbiano dimostrato la loro efficienza nel trasferimento cellulare di diversi carichi, la comprensione del meccanismo di internalizzazione da parte dei CPP è ancora controversa e l'equilibrio tra vie di endocitosi o penetrazione diretta è ancora difficile da misurare12,13. Sebbene sia disponibile una serie di strumenti e strategie sperimentali per affrontare chiaramente il coinvolgimento dei processi endocitici, la traslocazione diretta sembra, tuttavia, più difficile da caratterizzare poiché implica interazioni più discrete con i componenti della membrana plasmatica. Le membrane biologiche sono solitamente composte da numerosi componenti, dai fosfolipidi alle proteine di membrana, che possono variare a seconda del tipo cellulare e/o dell'ambiente (condizioni di stress, divisione cellulare, ecc.). Questa diversità di composizione, e di conseguenza l'assenza di un modello di membrana cellulare universale, non consente studi in un unico modo. Tuttavia, per aggirare queste limitazioni sono stati sviluppati approcci passo-passo con estratti di membrana o membrana artificiali. Dalle piccole vescicole unilamellari agli approcci monostrato, ogni modello era chiaramente pertinente per rispondere alle domande specifiche14,15. Tra questi, le grandi vescicole unilamellari (LUV) costituiscono un modello appropriato di imitazione della membrana per studiare le interazioni peptide/ membrana come punto chiave nel processo di internalizzazione.
In questo contesto, il seguente protocollo descrive lo studio degli effetti dei peptidi e delle interazioni peptidi/membrana sull'integrità dei LUD attraverso il monitoraggio sia di un colorante fluorescente anionico che del corrispondente quencher policanica incapsulato in liposomi. Questo strumento viene utilizzato per studiare le interazioni CPP/membrana al fine di capire se sono in grado di eseguire una traslocazione diretta della membrana. Sebbene di solito applicato per confrontare diversi peptidi che interagiscono con la membrana, questo saggio di perdita di fluorescenza LUV potrebbe anche essere utilizzato per studiare sia i coniugati CPP-cargo (strategia covalente) che i complessi CPP:cargo (strategia non covalente).
Il presente protocollo sarà quindi prima esemplificato con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WRAP)16recentemente sviluppati. WRAP è in grado di formare nanoparticelle a base di peptidi per fornire rapidamente ed efficacemente piccoli RNA interferenti (siRNA) in diverse linee cellulari16. Le proprietà di perdita di fluorescenza del peptide WRAP da solo o delle nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA sono state monitorate per caratterizzare il loro meccanismo di internalizzazione cellulare. La Corte ha dimostrato che il loro meccanismo di internalizzazione riguardava principalmente la traslocazione diretta7. In un secondo esempio, il peptide WRAP è stato coniugato covalentemente al peptide interferente proteina/proteina iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e la sua capacità di destabilizzare le membrane è stata confrontata in un saggio di perdita di fluorescenza con iCAL36 accoppiato a Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un altro CPP.
Infine, verranno discussi i vantaggi e i limiti del metodo sia dal punto di vista tecnologico che rispetto alla rilevanza biologica.

<table><tbody><tr><td>Pallone da 25 mL in vetro a fondo tondo</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-amminoaftalene-1, 3, acido 6-trisolfonico, sale disodico (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Proteggere dalla luce&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich 288306</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoilfosfatidilcolina)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Proteggere dall'estrusore d'aria</td></tr><tr><td></td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &; L siringa di vetro</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Fosfolipide</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>colonna per cromatografia liquida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in policarbonato nucleporo (0,1 & micro; m dimensione dei pori, diametro 25 mm)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>cuvetta in polistirene, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>cuvetta semi-micro in polistirene, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-xilene-bispiridinio bromuro (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Proteggere dalla luce...</td></tr><tr><td>cuvetta a fluorescenza al quarzo</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor system&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 resina</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Azide di sodio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Bagno sonicatore USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielina</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Proteggere dall'aria</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall'internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L'aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l'induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l'affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.

Il principio del saggio di dispersione in fluorescenza è mostrato nella Figura 1. In dettaglio, le grandi vescicole unilamellari (LUV) che incapsulano un colorante fluorescente e un quencher (nessun segnale di fluorescenza) sono trattate con la biomolecola di interesse. A causa dell'interazione del peptide con le membrane lipidiche, che potrebbe implicare permeabilità della membrana, riorganizzazione o addirittura rottura, il colorante a fluorescenza e il que...

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Questo saggio di perdita di fluorescenza è un metodo semplice per affrontare la destabilizzazione della membrana tramite biomolecole. Utilizzando liposomi incapsulati con coloranti fluorescenti, può essere utilizzato per confrontare diversi peptidi interagenti con membrane. Questo metodo è particolarmente utile per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi che penetrano nelle cellule, al fine di comprendere il meccanismo di internalizzazione cellulare e per valutare il loro coinvolgimento nella traslocazione diretta della membrana.Rispetto alle membrane biologiche, i liposomi consentono il controllo della composizione fosfolipidica al fine di imitare diversi valori lipidici, come le membrane plasmatiche, endosomiali o mitocondriali. Per preparare i LUV per il loro utilizzo come imitatori della membrana cellulare per un saggio di perdita di fluorescenza, utilizzare una siringa di vetro Hamilton per mescolare fosfatidilcolina, sfingomielina e colesterolo in un rapporto molare 4:4:2. Utilizzare un evaporatore rotante per far evaporare il cloroformio di metanolo sotto vuoto per 46-50 minuti a 60 gradi Celsius fino a quando non si è formato un film lipidico essiccato.Per ricostituire le vescicole multilamellari, risospendere il film lipidico essiccato con un millilitro di soluzione di idratazione lipidica e agitare accuratamente fino a quando il film lipidico essiccato non si è sciolto. Dopo aver confermato che tutto il lipide è stato incorporato e che non è rimasta alcuna pellicola sui lati del pallone, congelare e scongelare le vescicole cinque volte per 30 secondi in azoto liquido e due minuti in un bagno d'acqua a 30 gradi per ciclo. Per preparare l'estrusore lipidico, inserire due supporti filtranti HEPES trattati con tampone in ciascun pezzo dell'estrusore in PTFE all'interno del contenitore metallico dell'estrusore e posizionare una membrana in policarbonato umidificato HEPES con pori da 0,1 micron sulla parte superiore di un supporto filtrante.Avvitare insieme i due contenitori metallici dell'estrusore e posizionare l'estrusore assemblato nel supporto. Per verificare la presenza di perdite o altri problemi nell'estrusore, introdurre una siringa vuota da un millilitro nell'apposito foro a un'estremità del pezzo dell'estrusore in PTFE e un'altra siringa da un millilitro caricata con un millilitro di tampone HEPES all'altra estremità, quindi consegnare il campione di vescicola multi-lamellare all'estrusore allo stesso modo e spingere il campione da una siringa all'altra attraverso la membrana in policarbonato almeno 21 volte per ottenere LUV uniformi. Per purificare i LUV, aggiungere i LUV appena estrusi su una colonna per cromatografia liquida e lasciare che le vescicole entrino nel gel di destrano reticolato.Aggiungere continuamente il tampone HEPES due alla colonna e iniziare a eluire circa due millilitri di tampone HEPES due. La soluzione gialla libera di ANTS e DPX migrerà più lentamente dei liposomi. Dopo che un millilitro è stato eluito, iniziare a raccogliere i LUV purificati in provette da 1,5 millilitri.Quando le gocce di eluente diventano opalescenti, cambiare il tubo per recuperare la frazione contenente LUV. Quando le gocce non sono più opalescenti, eluire altri 500 microlitri in una frazione separata prima di interrompere l'eluizione. Per determinare la dimensione LUV e l'indice di polidispersione, indicare la viscosità del solvente nella semi-microcuvetta di polistirene da utilizzare nell'esperimento e il sistema di diffusione dinamica della luce e aggiungere 500 microlitri della soluzione LUV alla cuvetta, quindi caricare la cuvetta sullo strumento e misurare la distribuzione dimensionale in termini di dimensione media della distribuzione delle particelle e omogeneità.Per misurare la perdita di fluorescenza, diluire i LUV in un millilitro di tampone HEPES, due in una cuvetta di fluorescenza al quarzo a una concentrazione finale di 100 micromolari e aggiungere un agitatore magnetico per facilitare l'omogeneizzazione della soluzione durante l'esperimento. Misurare i soli LUV durante i primi 100 secondi per valutare la fluorescenza di fondo prima di misurare la perdita come aumento dell'intensità della fluorescenza dopo l'aggiunta di aliquote di soluzione peptidica nei successivi 900 secondi. Per misurare la perdita di florescenza al 100% come controllo positivo, aggiungere un microlitro di Triton X-100 ai LUV per solubilizzare le vescicole, ottenendo un completo disinserimento della sonda durante gli ultimi 100 secondi dell'analisi.Quindi utilizzare la formula per calcolare la percentuale di perdita in ogni punto temporale. In assenza di peptidi, non si osserva alcuna perdita di fluorescenza dai LUV. L'aggiunta di WRAP sui LUV induce un aumento significativo della fluorescenza, rivelando un'importante perdita di LUV e il rilascio di ANTS.Dopo 15 minuti, si ottiene una perdita di circa il 67% in presenza di 2,5 micromolari di WRAP rispetto al controllo positivo Triton. Al contrario, quando WRAP viene assemblato alla stessa concentrazione con piccoli RNA interferenti per formare nanoparticelle a base di peptidi, la perdita è 1,5 volte più debole rispetto al peptide libero. Quando si utilizza il peptide coniugato Penetratin-iCAL, non viene rilevato alcun aumento significativo della fluorescenza, mentre l'aggiunta del peptide WRAP-iCAL induce una perdita netta caratterizzata da un segnale fluorescente molto forte alla stessa concentrazione di 2,5 micromolari.Questi risultati indicano che il saggio di perdita di fluorescenza può essere utilizzato per rivelare la capacità di alcuni peptidi che penetrano nelle cellule di eseguire interazioni peptidiche con la membrana portando a una permeabilità della membrana più o meno pronunciata. Questo metodo favorisce una rapida identificazione delle interazioni dei peptidi di membrana che portano alla destabilizzazione della membrana al fine di decifrare il meccanismo di internalizzazione dei peptidi che penetrano nelle cellule o di altri peptidi attivi di membrana come i peptidi fotogenici o antimicrobici. In caso di interazione peptide-lipide senza induzione di perdite, sono necessari altri approcci come gli esperimenti di fluorescenza del triptofano.Questo test di perdita di fluorescenza è ampiamente utilizzato nel campo della CPP e può fornire importanti informazioni sulla traslocazione cellulare o sulla fuga endosomiale.

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Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

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