Stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale utilizzando il metodo Updegraff
15 maggio 2021
Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Lo scopo principale di questa dimostrazione è quello di fornire un protocollo Updegraff dettagliato per la stima del contenuto di cellulosa nei campioni di biomassa vegetale.
Qui, dimostriamo il metodo Updegraff, il metodo più utilizzato al mondo per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. La cellulosa è fondamentalmente composta da monomeri di glucosio collegati da beta-1, 4 legami glicosidici. Abbiamo diviso questo protocollo in cinque fasi.
Nella prima fase, prepariamo il materiale della biomassa vegetale. Nella seconda fase estraiamo la parete cellulare grezza. Nella terza fase, utilizziamo il trattamento Updegraff in cui Updegraff è composto da acido acetico e acido nitrico che aiuta nella rimozione di emicellulosa e lignina dai nostri campioni.
Nella quarta fase, lo sottoscrivamo all'idrolisi acida con l'aiuto di acido solforico che produce i monomeri di glucosio. Infine, nella quinta fase, usiamo il saggio dell'antronrone per stimare il contenuto cristallino di cellulosa. Raccogliere il materiale vegetale dalla serra, lavarlo accuratamente con acqua, asciugare all'aria per due giorni, separare il tessuto e trasferire il tessuto nei contenitori etichettati individualmente e incubare nell'incubatrice a 49 gradi centigradi per 10 giorni.
Quindi, infine, tagliare a pezzi usando forbici o lama. Congelare il tessuto e caricarlo in malta e pestello per la macinazione fine in polvere uniforme o, in alternativa, utilizzare Freezer / Mill. Qui dimostriamo di utilizzare Freezer / Mill, quindi carichiamo i nostri campioni di tessuto in queste fiale di rettifica e li posizionare nel congelatore / mulino ed eseguiamo la velocità di 10 CP per tre cicli.
La polvere di tessuto viene raccolta nel tubo Falcon come mostrato qui. Pesare 20 mg di polvere di tessuto e trasferirlo in un tubo pre-pesato da due ml. Aggiungere un mL di tampone di solubilizzazione proteica per rimuovere le proteine. vortice.
Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante. Ripetere questo passaggio altre due volte.
Aggiungere un mL di acqua sterile al pellet trattenuto. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ripetere questo passaggio altre due volte.
Aggiungere una ML di 70% di etanolo al pellet trattenuto. vortice. Trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 70 gradi con scuotimento simultaneo per un'ora. Dopo un'ora di incubazione, centrifugare a 15.000 giri/min per cinque minuti.
Ripetere questo passaggio ancora una volta. Al pellet salvato aggiungere un mL di metile al 100%. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti.
Aggiungere un mL di metanolo cloroformio. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un mL di acetone. vortice.
Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ri-scartare il supernatante e asciugarlo all'aria a 37 gradi centigradi durante la notte o continuare con l'essiccazione sottovuoto.
Caricare i campioni nell'essiccatore sottovuoto e asciugare all'aria per due o tre ore o fino a quando il pellet non è completamente asciutto. Pesare cinque mg dell'estratto della parete cellulare ottenuto dal passaggio precedente. Trasferire in un tubo a vite da due ml.
Includere anche il controllo positivo a questo punto. Usa due mg di carta filtrante Whatman per questo scopo. Trasferimento su un tubo a vite da due ml.
Aggiungere 1,5 mL di reagente Updegraff a ogni estratto di parete cellulare pesato. Vortice e incubare a 100 gradi centigradi in un blocco preriscaldato per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, trasferire su un rack.
Lasciare raffreddare in panchina per 10 minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
Aggiungere un mL di acqua sterile. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare 500 microlitri del supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare un mL del supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scarta completamente il supernatante.
Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante.
Asciugare a 37 gradi centigradi durante la notte. Dopo un'incubazione di una notte, trasferire su un rack. Aggiungere un mL di acido solforico al 67%. vortice.
Incubare a 25 gradi centigradi per un'ora con scuotimenti simultanei. Dopo un'ora di incubazione, assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto. Trasferimento su un rack.
Questa è la fase finale dell'estrazione della cellulosa. Ora i campioni sono pronti per la diluizione del campione. Per la diluizione del campione, utilizzare 10 microlitri di ciascun campione del passaggio precedente e aggiungere 490 microlitri di acqua sterile.
Ripetere questa procedura per tutti i campioni sperimentali. Per la preparazione della curva standard del glucosio, preparare uno stock fresco di un mg per mL di glucosio e preparare zero microgrammi a 200 microgrammi di concentrazioni aggiungendo un mg per mL di glucosio in incrementi di 20 microliter e copportare il volume finale a un mL con acqua sterile. Prendere 500 microliter di ogni standard preparato in un tubo a vite e aggiungere un mL 0,2% di antronrone.
E ora i campioni sono pronti per il test dell'antronrone. Aggiungere un mL di antronrone appena preparato. Mescolare immediatamente con vortice e trasferimento sul ghiaccio.
Ripetere per tutti gli standard e campioni allo stesso modo. Quindi trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 100 gradi per 10 minuti. Dopo 10 minuti di incubazione, trasferire sul ghiaccio e incubare per cinque minuti sul ghiaccio.
Dopo l'incubazione, assumere 200 microlitri di ogni campione in tre repliche. Ripetere per entrambi gli standard e campioni allo stesso modo. E una piastra carica da 96 po' è stata caricata in un rilevatore multimodale.
Utilizzando il programma Smart Max Pro, abbiamo impostato l'impostazione del filtro su 620 nanometri. Tipo di piastra a tipo 96-well. Selezionare tutta l'area di lettura.
Fare clic su OK. leggere. Leggi il piatto. Si ottengono le letture di assorbanza di standard e campioni, che verranno raccolte nella scheda excel per ulteriori analisi e stime del contenuto di cellulosa.
La curva standard del glucosio viene preparata utilizzando le concentrazioni di glucosio in microgrammi per mL sull'asse x e i valori di assorbanza normalizzati della rispettiva concentrazione a 620 nanometri sull'asse y. Otteniamo la linea di regressione con valori m e c nel grafico a dispersione tracciato che usiamo per stimare il contenuto di cellulosa cristallina del campione. Nel primo passo, abbiamo fatto una media dei valori di OD a 620 nanometri.
E poi abbiamo normalizzato i dati sottraendo il valore vuoto. Calcoliamo la concentrazione di glucosio usando la formula x è uguale a OD meno c/m dove colleghiamo i valori c e m dal passo precedente della linea di regressione nella curva standard. Poiché il volume totale utilizzato per il test dell'antronrone è di 500 microlitri, lo dividiamo per fattore di diluizione due.
Poiché il volume del campione utilizzato era di soli 10 microlitri, divideremo ulteriormente per 10 per ottenere microgrammi per concentrazione di microlitri di glucosio che è uguale a mg per concentrazione di mL. E poi abbiamo usato il fattore di umidità 1.11 che è il guadagno di umidità nel processo. E infine, calcoliamo il contenuto di cellulosa cristallina percentuale dividendolo con il peso della parete cellulare, che è vicino a cinque mg, e moltiplichiamo per 100 per ottenere la percentuale.
Poi abbiamo mediato il contenuto cristallino di cellulosa di tre repliche biologiche per ottenere il valore per i singoli campioni, che verrà confrontato con un'altra media di linea sperimentale di tre repliche biologiche. E il test t può essere usato per testare il loro livello di significatività. Qui nella tabella A, mostriamo i valori della tabella della concentrazione e del rispettivo OD a 620 nanometri, che è stato ulteriormente utilizzato per tracciare un grafico a dispersione e una linea di regressione con i valori m e c che sono stati utilizzati in C per ottenere le differenze di contenuto di cellulosa tra le due linee sperimentali.
In conclusione, entrambi i campioni mostrano differenze di cellulosa. Grazie per l'attenzione.
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Panoramica
Questa dimostrazione descrive il metodo di Updegraff, la tecnica più utilizzata per stimare il contenuto di cellulosa cristallina nella biomassa vegetale. Il protocollo è suddiviso in cinque fasi distinte, garantendo un approccio completo alla stima della cellulosa.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia vegetale
- Stima della cellulosa
- Analisi della biomassa
Sfondo
- La cellulosa è composta da monomeri di glucosio uniti da legami glicosidici beta-1,4.
- Il metodo di Updegraff è essenziale per comprendere la composizione della biomassa vegetale.
- Una stima accurata della cellulosa è fondamentale per numerosi studi biologici ed ecologici.
- Il metodo consente di differenziare la cellulosa da altri componenti della parete cellulare.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la stima della cellulosa.
- Migliorare la comprensione della composizione della biomassa vegetale.
- Facilitare la ricerca in biologia vegetale e campi correlati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del materiale di biomassa vegetale.
- Estrazione della parete cellulare grezza.
- Trattamento Updegraff con acido acetico e acido nitrico.
- Rimozione di emicellulosa e lignina dai campioni.
Risultati principali
- Stima accurata del contenuto di cellulosa in campioni vegetali.
- Separazione efficace della cellulosa dagli altri componenti della parete cellulare.
- Dimostrazione dell'affidabilità del metodo di Updegraff.
Conclusioni
- Il metodo di Updegraff è una tecnica affidabile per la stima della cellulosa.
- Comprendere il contenuto di cellulosa è fondamentale per la ricerca sulle piante.
- Questo protocollo può essere utilizzato in vari studi biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La stima quantitativa della cellulosa cristallina nella biomassa vegetale è fondamentale per i team di ricerca e sviluppo biofarmaceutici focalizzati sulla bioenergia, sull'ottimizzazione delle materie prime e sulla biologia della parete cellulare. Il metodo di Updegraff fornisce un flusso di lavoro solido e riproducibile per l'isolamento e la misurazione del contenuto di cellulosa, supportando una caratterizzazione della biomassa affidabile e studi comparativi. Questa capacità costituisce la base per la scoperta precoce, la validazione degli obiettivi e la ricerca traslazionale nei processi produttivi di bioprodotti di origine vegetale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una quantificazione precisa della cellulosa per studi basati su ipotesi sulla composizione della parete cellulare vegetale.
- Supporta la validazione funzionale di interventi genetici o chimici mirati alla biosintesi della cellulosa.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico isolando la cellulosa da altri componenti della parete che potrebbero interferire.
- Fornisce parametri quantitativi per la selezione di portafogli e la priorizzazione di bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una preparazione standardizzata e riproducibile dei campioni per saggi colorimetrici successivi.
- Consente lo screening ad alto rendimento di linee vegetali o trattamenti per la resa di cellulosa.
- Supporta la calibrazione del saggio mediante curve standard di glucosio e analisi di regressione.
- Garantisce risultati quantitativi affidabili per la valutazione di composti o caratteristiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la caratterizzazione della biomassa agli obiettivi traslazionali nel campo della bioenergia e della biotecnologia industriale.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica di linee vegetali ingegnerizzate.
- Permette decisioni di avanzamento corrette in base al rischio, basate su metriche quantitative della cellulosa.
- Supporta il confronto di nuove fonti di biomassa con standard consolidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo Updegraff si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica per i bioprodotti di origine vegetale, consentendo una quantificazione robusta della cellulosa in punti critici di svolta.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici isolando la cellulosa da biomasse complesse.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per lo sviluppo di saggi e campagne di screening.
- Analisi: Genera misurazioni basate sull'assorbanza e stime della cellulosa derivate da regressione per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta con la valutazione preclinica di caratteristiche della biomassa rilevanti per applicazioni industriali.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo standardizzato e ampiamente adottato, adattabile tra diverse specie vegetali e programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità negli studi sulla composizione della parete cellulare.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati, scalabili e riproducibili per la quantificazione della cellulosa.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e l'allocazione delle risorse nei processi di sviluppo di biomasse e caratteristiche.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione corretta per il rischio di linee vegetali o interventi basata su dati quantitativi sulla cellulosa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione della biomassa vegetale e nell'esecuzione di saggi colorimetrici.
- Necessita dell'accesso a centrifugazione, blocchi riscaldanti e lettori multimodali di piastre per la misurazione dell'assorbanza.
- Richiede una rigorosa standardizzazione intersquadre delle procedure di preparazione dei campioni e di analisi dei dati.
- Adattabile a diverse specie vegetali e tipi di tessuto con un'opportuna ottimizzazione.
- Dipende dalla corretta generazione della curva standard e da un'analisi statistica accurata per una quantificazione affidabile.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Phase I: Preparation of Samples
2:02
Phase II: Preparation of the Alcohol Insoluble Crude Cell Wall
4:52
Phase III: Removal of Hemicellulose and Lignin using Updegraff Reagent
7:10
Phase IV: Acid Hydrolysis of Cellulose into Glucose Monomers
7:49
Phase V: Anthrone Assay to Estimate the Glucose Concentration of Samples and Glucose Standard
10:04
Representative Results & Conclusion
