Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

La microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi fornisce una visione senza precedenti delle ultra strutture tridimensionali dei tessuti e può rispondere a una serie di domande precedentemente impossibili o estremamente difficili da perseguire. Questa tecnica consente la produzione rapida e riproducibile di set di dati tridimensionali con carica e artefatti minimi dei tessuti. E, cosa importante, consente l'acquisizione automatica di migliaia di immagini al giorno.

La microscopia elettronica a trasmissione standard fornisce un'eccellente ultra struttura cellulare. Tuttavia, queste immagini mancano di un contesto tridimensionale e possono essere difficili da interpretare. La microscopia elettronica seriale a scansione block-face fornisce quel contesto tridimensionale, consentendo l'interpretazione di processi complessi.

Sebbene questo protocollo sia affidabile e riproducibile, alcuni passaggi richiedono precisione e sono di fondamentale importanza per il successo di questa metodologia. Questo video mostrerà questi passaggi critici in dettaglio. Dopo aver corretto campioni in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare, contenente il 2,5% di glutaraldeide e due cloruri di calcio millimolare, i campioni devono essere tagliati in blocchi non più grandi di due millimetri a cubetti e lavati con tampone di cacodilato di sodio molare contenente due cloruro di calcio millimolare.

Il tessuto viene quindi colorato in sequenza con ferrocianuro di osmio, tiocarboidrazide e tetrossido di osmio. Dopo l'incubazione di tetrossido di osmio, trattare il tessuto con acetato di uranil acquoso all'1% a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciogliere 0,066 grammi di nitrato di piombo in 10 millilitri di soluzione di acido aspartico molare 0,03 e utilizzare un normale idrossido di potassio per regolare il pH della soluzione di aspartato di piombo del Walton a 5,5.

Dopo aver riscaldato la soluzione nel forno, lavare il tessuto cinque volte per tre minuti per lavaggio a temperatura ambiente, acqua doppia distillata, prima di trasferire il tessuto in una soluzione di aspartato di piombo riscaldata di Walton di 60 gradi Celsius per 30 minuti a 60 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il tessuto e disidratarlo in una serie crescente di acetone ghiacciato, seguita da un'incubazione di 10 minuti nell'acetone a temperatura ambiente. Quindi posizionare il tessuto in un rapporto 1:3 di resina mista dura in acetone per quattro ore di infiltrazione su una piattaforma rotante, seguito da un'infiltrazione di otto ore o durante la notte in un rapporto 1:1 di resina a soluzione di acetone su una piattaforma rotante, quindi, un'infiltrazione notturna in un rapporto 3:1 di resina e acetone sulla piattaforma rotante.

La mattina seguente, infiltrarsi nel tessuto in resina fresca al 100% per un'infiltrazione da quattro a otto ore, una durante la notte e un'infiltrazione di quattro ore a temperatura ambiente su una piattaforma rotante. La mattina successiva, utilizzare un bastoncino di legno per mescolare una piccola quantità di resina con polvere nera fumo fino a quando la resina non è satura della polvere, ma è ancora fluida e non diventa granulosa. La residenza dovrebbe assomigliare all'inchiostro spesso ed essere in grado di gocciolare lentamente senza grumi visibili Posizionare il campione di tessuto in uno stampo di gomma siliconica e catturare un'immagine per un successivo riferimento dell'orientamento del campione all'interno del blocco di resina.

Quando il campione è in posizione, coprire il tessuto nella resina satura nera fumo sulla punta dello stampo in silicone, con l'etichetta che indica i dettagli sperimentali e tissutali nello stampo all'estremità opposta della resina. Quindi, posizionare lo stampo in un forno a 65 gradi Celsius in pendenza per circa un'ora. Quando la resina infusa nero fumo si è polimerizzata a sufficienza, rimuovere lo stampo dal forno e, a partire da un pozzo vuoto, riempire il resto dello stampo con resina trasparente, facendo attenzione che l'etichetta rimanga visibile.

Quando il campione è stato ricoperto di resina trasparente, riposizionare lo stampo in silicone nel forno a 65 gradi Celsius, non su una pendenza, per 48 ore, quindi rimuovere lo stampo. Per preparare il blocco per l'imaging, posizionare il campione incorporato nella resina su un mandrino microtomo con l'estremità affusolata che sporge da circa cinque a sei millimetri dal mandrino. Bloccare il campione in posizione con la vite impostata e posizionare il campione sotto una lampada termica.

Dopo alcuni minuti, posizionare il mandrino in un supporto per microscopio stereo e utilizzare una nuova lama di rasoio a doppio taglio per rendere le sezioni sottili parallele alla faccia del blocco fino a quando il tessuto non è visibile, che sarà meno riflettente e granulare rispetto alle porzioni della resina prive di tessuto. Fissare un perno campione di alluminio nel portabigliere di rifilatura e fare diversi graffi profondi e incrociati nella faccia del perno per fornire una superficie più ampia per la colla utilizzata per tenere il campione in posizione. Posizionare il campione sotto una lampada termica e spingere il rasoio da uno a due millimetri direttamente nel blocco di resina prima di effettuare un secondo taglio perpendicolare di uguale profondità nel blocco, per tagliare via la resina in eccesso dal campione di tessuto in modo che il blocco sia di circa tre millimetri di diametro di due o tre millimetri di altezza.

Dopo questo taglio iniziale, riscaldare nuovamente il blocco sotto la lampada termica e utilizzare una nuova lama di rasoio a doppio taglio per tagliare la parte superiore del blocco di resina circa un millimetro sotto la porzione tagliata in un unico taglio liscio. Posizionare il portabicca di rifilatura, contenente il perno di alluminio tagliato, nel contenitore stereomicroscopio e applicare un sottile strato di colla cianoacrilato sulla faccia del perno in modo che copra completamente il perno senza formare un menisco visibile. Utilizzare le pin per premere il pezzo di blocco di tessuto tagliato al centro del viso del perno del campione per diversi secondi e lasciare che la colla si prenoti per diversi minuti.

Quando la colla si è accuratamente asciugata, individuare il tessuto sulla parte sollevata del blocco di resina e utilizzare un rasoio a doppio taglio per tagliare la porzione sollevata della resina contenente il campione di tessuto in un'area non superiore a un millimetro quadrato. Lentamente e con attenzione, rimuovere quanta più resina in eccesso possibile, lasciando il blocco leggermente più lungo in una dimensione, e utilizzare un file metallico finale per inclinare la resina in eccesso nell'area esterna alla porzione sollevata contenente il campione di tessuto verso il bordo del perno. Rimuovere le particelle di resina e la polvere dal campione preparato prima di applicare una sottile mano di vernice argentata e sputtering oro sull'intera superficie del blocco campione.

Dopo il rivestimento, tagliare qualsiasi vernice argentata in eccesso dalle superfici del viso del blocco e posizionare il blocco montato e tagliato nell'estremità bulbosa di un tubo di pipetta di trasferimento su misura con l'etichetta appropriata attaccata. Utilizzando l'imaging SBF-SEM, è stata identificata una rete di fasci di microfibrille senza elastina all'interno della cornea di topo adulto. Questa rete è organizzata in strati distinti, con le fibre strettamente associate ai cheratociti, anche all'interno di invaginazioni poco profonde sulla superficie del cheratocita.

L'applicazione di questo protocollo ha portato alla scoperta di una popolazione precedentemente sconosciuta di nervi corneali centrali che si fondono con cellule epiteliali basali al confine stromale-epiteliale. L'imaging SBF-SEM della cornea centrale rivela la presenza di vascucolatura limbale, fasci nervosi e cellule associate che possono essere segmentate manualmente per la ricostruzione 3D. Alcune insidie di questa procedura di imaging includono l'utilizzo di un tempo di divagazione dei pixel troppo lungo, che può causare immagini successive ondulate e distorte, piccole scariche di elettroni dalla faccia del blocco, portando a rapidi cambiamenti di contrasto nelle linee, graffi del coltello sulla faccia del blocco a causa di un coltello danneggiato o accumulo di detriti sul bordo del coltello , gli artefatti di un fascio di elettroni esteso si concentrano sulla faccia del blocco mentre il campione è ancora nella camera di imaging, fissazione impropria dei tessuti, che porta alla separazione delle strutture cellulari e del tessuto connettivo e salto dell'immagine a causa di una grande quantità di carica all'interno del tessuto o del blocco di resina.

Quando si taglia il blocco tissutale, è importante avere una buona comprensione di dove si trova il tessuto all'interno del blocco, in modo da non tagliare accidentalmente le regioni campione importanti. Se si desidera immagini a risoluzione più elevata di specifiche strutture cellulari o interazioni, l'imaging può essere interrotto, il blocco rimosso dal microscopio e le sezioni tagliate su un ultramicrotomo in cui possono essere visualizzate in un microscopio elettronico a trasmissione Microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi consente una visione del tutto unica dei tessuti biologici. Utilizzando questo protocollo, siamo stati in grado di acquisire rapidamente set di dati di qualità e di espandere la gamma di tessuti che possiamo esplorare.