Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Questa tecnica preserva tutti gli strati retinici e i tipi di cellule in situ, rendendola clinicamente più rilevante rispetto ai modelli animali e in vitro. Il vantaggio principale di questo protocollo è che riduce al minimo l'interruzione dell'integrità retinica durante la manipolazione dei tessuti, che è essenziale quando si confronta la retina sana e malata. Le malattie della retina possono essere imitate coltivando il tessuto in condizioni specifiche.

Ciò consente di testare nuove terapie farmacologiche. Le procedure di dissezione e raccolta dei campioni sono complesse. Pertanto, la dimostrazione visiva è fondamentale per aiutare i lettori a comprendere il protocollo scritto e condurre correttamente la procedura.

A dimostrare la procedura sarà Charisse Kuo, dottoranda del secondo anno del mio laboratorio. Preparare il terreno di coltura contenente la miscela F-12 modificata Eagle Medium/Nutrient di Dulbecco e una miscela una tantum di antibiotici e antimicotici. Per prima cosa, posiziona 500 microlitri di mezzo in una piastra a 24 pozzetti e bilanciala in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Avere il supporto pronto prima dell'estrazione dell'espianto evita lo slodging della retina alla successiva aggiunta. Per estrarre gli espianti retinici, iniziare posizionando la oculare su una capsula di Petri con l'iride e la lente rivolte verso l'alto e l'ONH che contatta la capsula di Petri. Tenere la oculare ferma al limbus usando una pinna e staccare l'iride e la lente facendo piccoli tagli circonferenzialmente lungo il bordo esterno del limbus.

Rimuovere l'iride e la lente con attenzione, assicurandosi di evitare di disturbare la retina. Identificare l'ONH utilizzando una sorgente di luce bianca brillante e incidere nei quattro quadranti verso l'ONH ruotando la capsula di Petri per una più facile manipolazione. Stendere e appiattire attentamente la oculare.

Applicare la pinna alla sclera anziché alla retina per evitare di interrompere l'integrità retinica. Rimuovere la piastra contenente il supporto preparato dall'incubatrice. Posizionare una trefina chirurgica sulla retina in una regione senza pieghe retiniche e premere forte per penetrare nella sclera, che dovrebbe generare un suono di fessurazione mentre si sfonda la capsula di Petri.

Ruotare la trefina per assicurarsi che la sclera sia stata penetrata completamente in modo tale che l'espianto retinico sia ora separato dal resto del campione. Applicare la pinna alla sclera e trasferire l'espianto retinico sandwich sul terreno di coltura. Coltura gli espianti retinici sandwich raccolti a 37 gradi Celsius per un massimo di 72 ore in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%.

La colorazione di ematossilina ed eosina ha dimostrato che gli espianti retinici sandwich conservavano l'integrità e una struttura lamellare distinta dal GCL all'ONL con nuclei compatti negli strati nucleari interni ed esterni. L'integrità retinica interrotta è stata trovata ai bordi dello stesso campione in cui la retina si era staccata dalla coroide e dalla sclera RPE sottostanti mostrando uno spessore retinico ridotto e perdita di nuclei nell'INL e nell'ONL. Nessun nucleo cellulare TUNEL-positivo, che segna l'apoptosi cellulare, è stato trovato in espianti retinici coltivati in condizioni basali, dimostrando una vitalità cellulare sostenuta anche dopo 72 ore.

L'etichettatura GFAP era limitata al GCL e all'IPL senza fibrosi gliale, un segno di patologia che sarebbe stato identificato come espressione estesa di GFAP nell'ONL. La vimentina è stata altamente espressa dallo strato di cellule gangliari allo strato nucleare esterno, mostrando l'integrità delle cellule Mueller preservata come si vede nei normali tessuti retinici. Il test magnetico Luminex ha mostrato che i livelli di IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 sono aumentati significativamente al di sopra del basale nelle colture di espianto retinico sandwich in citochine ad alto contenuto di glucosio e pro-infiammatorie dopo 24 ore.

Dopo 72 ore, i livelli di IL-18 e VEGF sono rimasti significativamente aumentati, ma non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nei livelli di IL-6 e IL-8. Quando si esegue questa procedura, lasciare sufficiente vitreo residuo, che appesantirà la retina in modo che non si stacchi dalla coroide RP e galleggi nel mezzo di coltura. La retina in coltura può essere ulteriormente caratterizzata utilizzando l'immunoistochimica e l'istologia, mentre le citochine infiammatorie rilasciate nel terreno di coltura possono essere misurate utilizzando un test magnetico Luminex.

Questo modello è più clinicamente traducibile rispetto ai modelli animali e in vitro, il che rende più adatto per testare l'efficacia di nuovi farmaci terapeutici per le malattie della retina.