Registrazione delle correnti elettriche attraverso la membrana plasmatica degli spermatozoi dei mammiferi

La registrazione dell'attività elettrica del cellulare spermatozoo utilizzando la tecnica patch-clamp è stata fondamentale per identificare vari canali ionici spermatozoi e per comprendere l'elettrofisiologia degli spermatozoi a livello molecolare. Questo metodo eccelle nella misurazione delle impronte elettrofisiologiche e farmacologiche dei canali ionici ed è lo strumento più affidabile per l'identificazione dei canali ionici. Data l'importanza fisiologica dei canali ionici e dei trasportatori elettrogeni per la fertilità maschile, questa tecnica è uno strumento potente per comprendere alcuni difetti spermatozoi che portano all'infertilità.

Per la fabbricazione di micropipette, si parte da capillari in vetro borosilicato con diametro esterno di 1,5 millimetri, diametro interno di 0,86 millimetri e filamento interno. Assicurarsi che il diametro interno della punta della pipetta sia di circa due micrometri prima della lucidatura al fuoco e che si riduca a 0,5 micrometri dopo una corretta lucidatura. Assemblare un ponte di agar per mantenere stabile l'ambiente intorno all'elettrodo di riferimento.

Crea un capillare di vetro a forma di L piegandolo sotto un piccolo fuoco Bunsen e lasciandolo raffreddare. Prepara una soluzione di 1%agarosio in un molare cloruro di potassio e riscaldala in un microonde finché l'agarosio non si scioglie e la soluzione diventa trasparente. Riempi con cura il capillare di vetro a forma di L con l'agarosio per evitare bolle d'aria e lascialo raffreddare a temperatura ambiente.

In alternativa, immergere il capillare di vetro a forma di L nell'agarosio fuso. Fai roteare il contenitore più volte e riscaldalo di nuovo nel microonde finché l'agarosio non bolle, espellendo così le bolle d'aria dal ponte dell'agar. Apri la parte inferiore dell'addome del topo con le forbici ed estrai entrambi gli epididimidi.

Posizionale in una piastra di coltura cellulare da 35 millimetri riempita con soluzione ad alta salinità o HS preriscaldata a temperatura ambiente. Trasferire gli epididimidi in una nuova piastra di coltura cellulare contenente soluzione di HS e rimuovere completamente ogni residuo di grasso. Separare gli epididimi in caput, corpus e cauda usando una lama a bisturi numero 15.

Trasferire il corpo di ogni epididimo in un nuovo piatto di coltura cellulare contenente soluzione di HS. Effettua più incisioni nella parte isolata dell'epididimo usando una lama puntata a pezzo 11. Trasferire le parti dell'epididimide con più incisioni in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 1,5 millilitri di soluzione HS.

Scuoti brevemente gli spermatozoi dall'epididimo nella soluzione usando la pinza Superfine Dumont Tipo 5A. Poi elimina l'epididimide e lascia il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti. Aspetta che la materia solida sedimenti sul fondo del tubo.

Poi trasferisci il sovrantantante in un altro tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Trova la cellula spermatozoida adatta con una goccia citoplasmatica usando un ingrandimento 600x. Assicurarsi che la goccia citoplasmatica sia ovale e abbia una forma leggermente allungata simile a un fuso.

Seleziona uno spermatozoo mobile con la testa attaccata al coprire in modo che lo spermatozoo sia parzialmente fissato, ma la goccia citoplasmatica e il resto del flagello continuino a muoversi con il battito dei flagelli. Assicurati che la testa dello spermatozoo sia attaccata in modo morbido alla copertura. Dopo la selezione visiva di uno spermatozoo con una morfologia corretta, riempi la micropipetta con la soluzione per pipette e fissala nel portapipette.

Per mantenere la punta della pipetta pulita dai detriti, applica pressione positiva sulla pipetta utilizzando l'assemblaggio a forma di tubo a U. Abbassa la pipetta e immergi la punta nella soluzione del bagno. Per visualizzare chiaramente la cellula, posizionare la punta della pipetta sopra la goccia citoplasmatica in modo che l'apertura della punta sia allineata diagonalmente verso la goccia.

Abbassa rapidamente la punta della pipetta verso la goccia in modo che siano nello stesso piano focale. Non appena la punta della pipetta tocca la goccia, applica pressione negativa sulla pipetta per far spostare parte della goccia nella punta e formare una tenuta giga-ohm. Poi solleva lo spermatozoo dalla copertura.

Compensare la transizione della capacità parranda usando la modalità compensatoria dell'amplificatore prima di passare alla modalità full cell. Esegui un rodaggio e la transizione nella modalità cellulare applicando un millisecondo, impulsi di tensione che aumentano gradualmente combinati con una aspirazione molto leggera. Dopo l'applicazione di ogni impulso di tensione di rodaggio, avviare lo strumento di test a membrana per verificare se si manifestano transitori di capacità maggiori.

Adatta la maggiore transizione di capacità per determinare la capacità dell'intera cella, così come la sua resistenza di accesso. Dopo un fallimento riuscito, procedere con gli esperimenti pianificati con patch-clamp a cellula intera, come l'applicazione di varie soluzioni di bagno contenenti diversi composti o la misurazione delle attività dei canali utilizzando protocolli a passo di tensione o a rampa di tensione. Le registrazioni CatSper sono state effettuate stabilendo una sigilla ad alta resistenza tra la pipetta patch e lo spermatozoo mammifero al punto della goccia citoplasmatica.

Le densità delle correnti CatSper di cesio intere sono state registrate da spermatozoi di neuroni selvatici caudali e spermatozoi neuronali caudali carenti di CatSper. Le cellule spermatozoi di specie diverse sono diverse nella loro morfologia e nelle vie regolatorie interne. Gli spermatozoi di primati e umani mostravano proprietà e regolazione dei canali CatSper simili.

Curiosamente, l'attivazione del progesterone di CatSper sembra essere unica per gli spermatozoi primati. Gli spermatozoi di cinghiale, toro e roditore non hanno mostrato alcuna alterazione stimolata dal progesterone delle loro correnti CatSper. Negli spermatozoi di toro e cinghiale, anche l'attività basale dei canali CatSper era al di sotto dei limiti rilevabili, suggerendo che l'afflusso di calcio e la conseguente iperattivazione siano guidati da altri canali o trasportatori o che sia necessario uno stimolatore naturale diverso per l'attivazione dei loro canali CatSper.

Le gocce citoplasmatiche piccole, lisce, uniformi e non troppo gonfie sono più adatte al patch-clamp. Dovresti evitare di usare quelle piccole gocce citoplasmatiche a senso unico, gonfie e completamente trasparenti, perché risulterebbero in una tenuta debole o assente. Questa tecnica consente lo studio dettagliato di specifici canali d'aria nel loro sistema naturale di espressione, e il successo dipende da spermatozoi variabili di alta qualità, regioni pure, competenze di fisiologia intellettuale di base, pazienza e, soprattutto, perseveranza.