Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo
22 dicembre 2020
Forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori murini.
Questo protocollo spiega i passaggi necessari per eseguire la microdissezione, la colorazione in immunofluorescenza a montaggio intero e la microscopia specifica per il nodo del seno e il nodo AV nel topo. La metodologia whole-mount è vantaggiosa per affrontare l'esatta localizzazione e morfologia 3D del seno e del nodo AV e per esaminare la relazione con il tessuto circostante. La morfologia dei tessuti è notevolmente preservata con solo una minima disidratazione e rottura fisica dei tessuti.
Per iniziare, perforare il cuore con un ago calibro 27 nell'area dell'apice spingendo con cautela l'ago nel ventricolo sinistro e iniettando delicatamente da cinque a 10 millilitri di PBS ghiacciato per immergere il cuore. Solleva con cautela il cuore usando una pinzetta e taglia i vasi grandi per rimuovere il cuore. Metti il cuore in una capsula di dissezione riempita con PBS ghiacciato al microscopio da dissezione.
Dopo aver determinato l'orientamento del cuore, girare il cuore in modo che la parte anteriore del cuore si trovi sul fondo del piatto. Immobilizzare il cuore inserendo piccoli spilli attraverso l'apice e l'appendice atriale nell'agarosio sul fondo del piatto di dissezione. Usando una pinzetta sottile e le forbici, rimuovi con cura il tessuto non cardiaco intorno alla vena cava superiore e inferiore.
Per esporre la regione intercavale, rimuovere la maggior parte dei ventricoli tagliando parallelamente al solco tra i ventricoli e gli atri con una micro forbice. Per la fissazione e la disidratazione, mettere il campione in paraformaldeide al 4% per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire il cuore in una soluzione di saccarosio al 15% e incubarlo per 24 ore a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, trasferire il cuore in una soluzione di saccarosio al 30% per altre 24 ore a quattro gradi Celsius. Lavare il cuore in Triton X-100 all'1% diluito in PBS. Quindi bloccarlo e permeabilizzarlo in soluzione bloccante durante la notte a quattro gradi Celsius.
Mettere il cuore in una provetta da 1,5 millilitri e incubarlo con Connexin 43 anti-topo di coniglio e anticorpi HTN4 anti-topo di ratto diluiti con soluzione bloccante per sette giorni a quattro gradi Celsius. Dopo sette giorni, rimuovere la soluzione contenente gli anticorpi primari utilizzando una pipetta. Lavare il cuore con la soluzione Triton X-100 all'1% tre volte per un'ora per lavaggio sull'agitatore orbitale.
Ripetere le fasi di lavaggio dopo l'incubazione con anticorpi secondari e DAPI. Dopo aver preparato gli anelli di plastica e averli riempiti di plastilina, posizionare il cuore nella scanalatura della plastilina con la parte posteriore del cuore rivolta verso l'alto. Identificare la SAN, che si trova sul lato dorsale del cuore con la regione intercavale.
Aggiungere PBS al cuore per spostare tutta l'aria all'interno della cavità fino a quando il cuore non è completamente coperto di PBS. Applicare il silicone sui bordi dell'anello di plastica. Premere delicatamente la parte circostante del campione nella plastilina per fissare il cuore e coprire il cuore con un vetrino coprioggetto.
Quindi premere delicatamente la parte posteriore della plastilina per spremere un po' di PBS e attaccare il cuore al vetrino coprioggetti facendo attenzione a evitare bolle d'aria all'interno dell'area di imaging. Posizionare i campioni di colorazione a montatura intera capovolti sulla piattaforma del microscopio confocale e procedere con l'imaging come descritto nel manoscritto del testo. I parametri per ciascun canale del microscopio confocale vengono impostati utilizzando il rispettivo software.
Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire l'imaging al microscopio confocale sia del nodo senoatriale che del nodo atrioventricolare nei cuori murini. La colorazione specifica del sistema di conduzione e del miocardio funzionante con anticorpi fluorescenti, che mirano rispettivamente a HCN4 e Connexin 43, consente di identificare il nodo senoatriale e il nodo atrioventricolare all'interno dell'anatomia intatta. Questo protocollo di colorazione a montaggio intero consente di studiare l'interazione di diversi tipi di cellule utilizzando vari anticorpi.
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Panoramica
Questo protocollo illustra i passaggi per la colorazione immunofluorescente in toto del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori di topi. La metodologia consente un'esatta localizzazione tridimensionale e l'esame della morfologia di queste strutture cardiache.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cardiovascolare
- Tecniche di immunofluorescenza
Sfondo
- Il nodo senoatriale (SAN) e il nodo atrioventricolare (AVN) sono fondamentali per la funzione cardiaca.
- L'immunofluorescenza su preparati interi fornisce informazioni sulla morfologia di questi nodi.
- Questa tecnica preserva la morfologia del tessuto con minima disidratazione.
- Comprendere la relazione tra questi nodi e i tessuti circostanti è essenziale per la ricerca cardiaca.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per la colorazione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori di topo.
- Facilitare lo studio della localizzazione tridimensionale dei nodi cardiaci.
- Migliorare la comprensione delle interazioni tra i tessuti cardiaci.
Metodi Utilizzati
- Microdissezione di cuori di topo.
- Colorazione immunofluorescente su preparati interi.
- Microscopia per la visualizzazione dei tessuti colorati.
- Utilizzo di PBS freddo su ghiaccio per la conservazione dei tessuti.
Risultati principali
- Colorazione riuscita del nodo senoatriale e del nodo atrioventricolare nei cuori di topo.
- Osservata preservazione della morfologia del tessuto.
- Visualizzazione chiara della localizzazione tridimensionale ottenuta.
- Migliore comprensione delle relazioni tra i nodi cardiaci e i tessuti circostanti.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per lo studio del nodo SA e del nodo AV nei topi.
- L'immunofluorescenza su preparati interi è una tecnica preziosa nella ricerca cardiaca.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per ottenere informazioni più approfondite.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione 3D ad alta risoluzione dei nodi senoatriale e atrioventricolare in modelli murini colma un'importante lacuna nella ricerca di elettrofisiologia cardiaca, consentendo una mappatura anatomica e cellulare precisa. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella validazione precoce dei bersagli per i meccanismi di aritmia e supporta la continuità traslazionale dalla scoperta agli studi cardiaci preclinici. La preservazione dell'integrità del tessuto e la possibilità di analizzare contemporaneamente diversi tipi cellulari posizionano questo flusso di lavoro come un asset riutilizzabile per i portafogli di ricerca e sviluppo cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette un'analisi dettagliata delle popolazioni cellulari del pacemaker e del sistema di conduzione in situ.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando le relazioni struttura-funzione dei nodi.
- Facilita l'identificazione affidabile di bersagli rilevanti per la malattia nell'aritmogenesi.
- Fornisce un contesto anatomico per studi funzionali e verifica di ipotesi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sistemi di tessuto cardiaco integro e validato per flussi di lavoro successivi di imaging e analisi.
- Fornisce risultati quantitativi riproducibili di immunofluorescenza per marcatori nodali e miocardici.
- Consente etichettatura multiplex con anticorpi per valutare più tipi cellulari all'interno dello stesso campione.
- Supporta la standardizzazione e la scalabilità dei saggi per studi comparativi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea dati anatomici 3D a modelli preclinici rilevanti per le malattie dei disturbi della conduzione cardiaca.
- Mantiene la continuità dalla scoperta molecolare alla validazione a livello tissutale.
- Permette un avanzamento mirato dei bersagli candidati in base a evidenze strutturali e cellulari.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori mappando le interazioni tra cellule nodali e non miocitarie.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di immunofluorescenza su preparati interi e di imaging confocale integra la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la ricerca cardiaca preclinica fornendo dati anatomici quantitativi ad alto contenuto informativo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nella ricerca sulla conduzione cardiaca.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili di immunofluorescenza per l'identificazione dei nodi.
- Analisi: Consente la ricostruzione tridimensionale e l'analisi comparativa delle regioni nodali e miocardiche.
- Ricerca traslazionale: Offre continuità anatomica e cellulare per modelli preclinici di aritmia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata di imaging e analisi per i team di ricerca e sviluppo cardiovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cardiaci.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei tessuti e l'acquisizione delle immagini per ottenere risultati riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale nei programmi di scoperta cardiaca.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi e modelli del sistema di conduzione.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella dissezione cardiaca, nell'immunofluorescenza e nella microscopia confocale.
- Richiede l'accesso a piattaforme di imaging avanzate e a software per l'analisi delle immagini.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la gestione dei tessuti e i protocolli con gli anticorpi.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per modelli o specie cardiache diverse.
- La dimensione del campione e la penetrazione degli anticorpi potrebbero limitare la produttività in studi su larga scala.
