Visualizzazione di SARS-CoV-2 utilizzando l'ibridazione immuno RNA-fluorescenza in situ
December 23rd, 2020
Qui descriviamo un metodo semplice che combina la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione situ (RNA-FISH) con l'immunofluorescenza per visualizzare l'RNA della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Questo protocollo può aumentare la comprensione delle caratteristiche molecolari delle interazioni RNA-host SARS-CoV-2 a livello di singola cellula.
Questo protocollo ha reso possibile la visualizzazione dell'RNA di SARS-CoV-2 in linee cellulari e in colture di epitelio delle vie aeree umane tridimensionali completamente differenziate, fornendo uno strumento per comprendere meglio la patogenesi virale e la replicazione a livello di singola cellula. Grazie alla sua elevata specificità, sensibilità e risoluzione, questo metodo è utile non solo per gli studi scientifici di base sul SARS-coronavirus-2, ma anche per progetti applicativi, come la diagnostica. A dimostrare la procedura sarà Agnieszka Suder, una dottoranda del mio laboratorio.
Dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule come descritto nel manoscritto del testo, rimuovere la soluzione 1X PBS dai pozzetti e aggiungere almeno 300 microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto. Incubare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Preparare ogni forcina HCR raffreddando a scatto il volume desiderato in provette separate.
Per preparare 300 microlitri di soluzione di amplificazione, utilizzare 18 picomoli di ogni forcina. Trasferire la soluzione a forcina in provette e incubarle a 95 gradi Celsius per 90 secondi. Quindi raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
Preparare una miscela di forcine aggiungendo le forcine H1 e H2 raffreddate a scatto al tampone di amplificazione. Versare gocce da 30 a 50 microlitri di miscela di forcine su Parafilm. Posizionare i vetrini coprioggetti con le cellule sulle gocce di miscela di forcine e incubare i campioni per una notte al buio a temperatura ambiente.
Per montare i vetrini, posizionare due gocce da 10 microlitri di terreno di montaggio su un vetrino, assicurandosi che le gocce siano sufficientemente separate da consentire il posizionamento di due vetrini coprioggetti su un singolo vetrino. Rimuovere il liquido in eccesso picchiettando i vetrini coprioggetti su un asciugamano pulito. Quindi posizionarli in un mezzo di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso il basso.
Posizionare i campioni montati su una superficie asciutta e piana al buio e lasciarli indurire. Dopo aver fissato e permeabilizzato le cellule HAE come descritto nel manoscritto del testo, preamplificare i campioni incubandoli con un tampone di amplificazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare 30 picomoli di ogni forcina per preparare 500 microlitri di soluzione di amplificazione.
Trasferire la soluzione di forcina nelle provette e incubarle a 95 gradi Celsius per 90 secondi. Quindi raffreddarli a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Preparare la soluzione per forcine aggiungendo tutte le forcine raffreddate a scatto a 500 microlitri di tampone di amplificazione a temperatura ambiente.
Rimuovere la soluzione di preamplificazione e aggiungere la soluzione completa di forcina. Quindi incubare i campioni per una notte a temperatura ambiente al buio. Posizionare la membrana ritagliata dagli inserti Transwell su 10 microlitri di terreno di montaggio antisbiadimento con le celle rivolte verso l'alto e aggiungere ulteriore mezzo di montaggio alla membrana.
Quindi coprire le membrane con vetrini. Questo protocollo immuno-RNA-FISH è stato condotto in due sistemi cellulari, una linea cellulare Vero e una coltura 3D di epitelio delle vie aeree umane. Qui è mostrata la localizzazione dell'RNA subgenomico di SARS-coronavirus-2 nelle cellule Vero infettate e inoculate in modo simulato.
L'RNA virale può essere visto in rosso. Qui viene mostrata la localizzazione dell'RNA subgenomico di SARS-coronavirus-2 in cellule epiteliali delle vie aeree umane infette e fintamente inoculate. Il protocollo di permeabilizzazione è stato ottimizzato nelle cellule Vero.
La permeabilizzazione con detergente produce un segnale chiaro e specifico per l'RNA subgenomico del SARS-coronavirus-2, mentre l'uso dell'etanolo produce un'immagine sfocata e sfocata. Quando si montano i vetrini con le celle Vero, è importante posizionare un vetrino coprioggetti con le celle rivolte verso il basso. Quando si montano i vetrini HAE, la membrana deve essere posizionata con le celle rivolte verso l'alto.
Questa tecnica può essere facilmente modificata per consentire il rilevamento di qualsiasi RNA, compresi gli RNA non codificanti e i virus a RNA che potrebbero emergere in futuro. Accoppiato con l'immunofluorescenza, può essere utilizzato per studiare le interazioni proteina-RNA a livello di singola cellula.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo che integra l'ibridizzazione in situ con fluorescenza dell'RNA (RNA-FISH) con l'immunofluorescenza per visualizzare l'RNA del SARS-CoV-2. Questo approccio migliora la comprensione delle interazioni tra l'RNA del SARS-CoV-2 e l'ospite a livello di singola cellula.
Componenti principali dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Virologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Comprendere la patogenesi virale è cruciale per sviluppare diagnostiche e trattamenti efficaci.
- Il SARS-CoV-2 ha implicazioni significative per la salute pubblica.
- Visualizzare l'RNA a livello di singola cellula può fornire informazioni sulla replicazione virale.
- Combinare RNA-FISH con immunofluorescenza offre alta specificità e sensibilità.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare l'RNA del SARS-CoV-2 in vari modelli cellulari.
- Migliorare la comprensione delle interazioni virali all'interno delle cellule ospiti.
- Fornire uno strumento sia per la ricerca di base che applicata in virologia.
Metodi utilizzati
- Fissazione e permeabilizzazione delle cellule.
- Applicazione di tampone di amplificazione per la visualizzazione dell'RNA.
- Utilizzo di capelli HCR per il rilevamento specifico dell'RNA.
- Tecniche di immunofluorescenza per complementare l'RNA-FISH.
Risultati principali
- L'RNA del SARS-CoV-2 è stato visualizzato con successo in linee cellulari e colture di epitelio delle vie aeree umane.
- Il metodo ha dimostrato alta specificità e sensibilità.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della patogenesi virale.
- Questo protocollo è applicabile sia per scopi di ricerca che diagnostici.
Conclusioni
- Il metodo combinato è efficace per studiare il SARS-CoV-2 a livello di singola cellula.
- Fornisce preziose informazioni sulle interazioni RNA-ospite.
- Questo approccio può aiutare nello sviluppo di strumenti diagnostici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
