Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Il verme del cotone è uno dei parassiti più distruttivi in tutto il mondo. L'editing del genoma con la tecnologia CRISPR / Cas9 consente ulteriori ricerche sulla funzione genica e l'interazione tra diversi geni in questo organismo. I due principali vantaggi di questa tecnica sono che ha un'alta specificità ed è hereditable.

Per scegliere i bersagli sgRNA, visitare il sito Web online CRISPR per cercare possibili siti guida e gli esoni vicini alla regione primaria non tradotta del gene. Inserisci la sequenza dell'esone nella casella di testo e seleziona il genoma target in Helicoverpa armigera. Scegli l'opzione PAM per 20 BPNGG e lascia le altre impostazioni sui parametri predefiniti, secondo i manuali utente del sito web.

Confronta le sequenze di guida previste dal software e scegli una sequenza guida di 20 coppie di basi contenenti uno o due guanini vicino alla regione dei cinque primi non tradotti con la massima efficienza prevista e il minor numero di disallineamenti per migliorare l'efficienza di editing e ridurre l'editing fuori bersaglio. Per la preparazione degli embrioni, selezionare 50 individui sani da maschi di tre giorni e femmine di due giorni e mescolarli in una gabbia di rete pulita. Mettere un pezzo di cotone umido contenente una soluzione di zucchero al 10% nella gabbia.

Coprire le gabbie della rete con una garza e fissare la garza con un elastico. Spruzzare acqua sulla garza per mantenerla umida. Tagliare un panno nero in una dimensione appropriata e sostituire la garza umida con questo panno nero per consentire la posizione libera degli ovuli per 30 minuti.

Incollare del nastro biadesivo su un vetrino per microscopio. Usando la pinza, incolla le patch con le uova di fila sulla superficie del nastro biadesivo. Premere il margine di ogni cerotto per assicurarsi che si attacchino saldamente al nastro.

Raccogliere da 50 a 100 uova per vetrino al microscopio. Prima della microiniezione, tenere il vetrino del microscopio sul ghiaccio per ritardare lo sviluppo degli embrioni. Preparare l'ago tirando un vetro capillare usando un micro estrattore di pipette come descritto nel manoscritto di testo.

Macinare la punta dell'ago usando una micro smerigliatrice su una punta affilata. Preparare soluzioni di iniezione aggiungendo due microlitri di proteina Cas9 e sgRNA commercializzati all'acqua priva di RNace in un tubo PCR per ottenere una miscela di volume di 10 microlitri. Mescolare bene con il pipettaggio e metterlo sul ghiaccio.

Impostare i parametri del microiniettore elettronico. Caricare due microlitri della miscela in un ago utilizzando una punta della pipetta del microloader, esaurendo quanta più aria residua possibile nella punta dell'ago. Collegare l'ago per iniezione a un micromanipolatore e garantire una stretta connessione tra le due parti.

Metti un vetrino in una capsula di Petri e mettilo sul palco del microscopio. Inserire con attenzione la punta dell'ago nell'emisfero superiore di un embrione con un angolo di 45 gradi. Premere il pedale per consegnare la miscela nell'embrione, portando ad una leggera espansione dell'embrione.

Ritrarre immediatamente l'ago dall'embrione e spostare la capsula di Petri con una mano fino a quando l'embrione successivo è in prossimità dell'ago. Iniettare almeno 300 embrioni utilizzando la stessa procedura per garantire una quantità di schiusa sufficiente. Coprire il coperchio delle piastre di Petri dopo l'iniezione.

Quando il colore superficiale degli embrioni si è oscurato, metti la dieta artificiale nella capsula di Petri attorno al vetrino del microscopio. Preparare piatti di coltura a 24 pozzetti e riempire ogni pozzo a 1/3 della sua capacità volumetrica con dieta artificiale. Scegli la larva da cova usando un piccolo pennello e trasferiscile nella piastra di coltura a 24 pozzetti, in modo tale che uno abbia una larva.

Quando le larve crescono fino al terzo stadio instar, trasferiscile in un nuovo ethrae duttile di vetro. Trasferire gli adulti maschi G-zero appena chiusi e le femmine selvatiche in una gabbia netta fresca con un rapporto uguale. Fornire loro una soluzione di zucchero al 10% lasciata cadere in batuffoli di cotone.

Insetti allevati usando metodi di routine fino alla pupa di G-one. Utilizzare una pinza per rimuovere con cura una zampa posteriore e mettere ogni gamba in un tubo Lysing Matrix. Omogeneizzare la zampa posteriore usando un omogeneizzatore di tessuto.

Estrarre il DNA genomico del campione omogeneizzato utilizzando un kit di estrazione gDNA commerciale secondo le istruzioni del produttore. Amplificare il segmento genico utilizzando primer di genotipizzazione e le condizioni di reazione PCR dal manoscritto di testo. Confermare il genotipo con un servizio di sequenziamento genico.

Metti gli individui G-one dello stesso genotipo in una gabbia netta, attraversa le progenie G-one e continua a fare screening usando gli stessi metodi. Il sito bersaglio del gene di interesse si trovava nel suo secondo esone. Questo sito è stato altamente conservato e il frammento di banda bersaglio di sgRNA sintetizzato è stato confermato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.

Il rilevamento mutante di un singolo bersaglio sgRNA è stato eseguito sequenziando i prodotti PCR da unità parentali G-one. L'efficacia dell'uso di coppie di sgRNA non sovrapposte su diversi esoni è stata dimostrata poiché la grande delezione dei mutanti è stata facilmente distinta dalle padelle wild-type. Dopo aver ottenuto un certo numero di individui mutanti, possono essere eseguiti esperimenti elettrofisiologici o comportamentali per chiarire la funzione genica e l'interazione tra geni diversi.