Name: Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri come generare monostrati epiteliali da organoidi intestinali per studiare la funzione di barriera in vitro. Questo protocollo riproduce caratteristiche specifiche del paziente per ricerca personalizzata e sviluppo di farmaci mirati.

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Questo lavoro è supportato dal Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) public-private partnerships (PPP) allowances del settore olandese LSH con numero di progetto LSHM16021 Organoids come nuovo strumento per la modellazione tossicologica alla Hubrecht Organoid Technology (HUB) e finanziamenti interni HUB al dipartimento di modellazione e tossicologia delle malattie. Ringraziamo i laboratori di Sabine Middendorp (Divisione di Gastroenterologia Pediatrica, Wilhelmina Children's Hospital, UMC, Utrecht) e Hugo R. de Jonge e Marcel J.C. Bijvelds (Dipartimento di Gastroenterologia ed Epatologia, Erasmus MC, Rotterdam) per aver fornito il supporto tecnico iniziale per la realizzazione di monostrati su inserti a membrana.

<ol><li>Haegebarth, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling%2C+lgr5%2C+and+stem+cells+in+the+intestine+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).</li>
<li>Schoultz, I., Keita, ÅV. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909(2020).</li>
<li>Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMart%C3%ADnez-Maqueda%2C+D+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%3A+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%28%2B%29+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 11 (2), 179-194 (2013).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Van De Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>d'Aldebert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+colon+organoids+from+inflammatory+bowel+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363(2020).</li>
<li>Dotti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+epithelial+stem+cell+compartment+could+contribute+to+permanent+changes+in+the+mucosa+of+patients+with+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis.</a> Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Noel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+human+macrophage-enteroid+co-culture+model+to+investigate+mucosal+gut+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions.</a> Scientific Reports. 7, 45270(2017).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+induces+maturation+of+Paneth+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts.</a> Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1+marks+early+secretory+progenitors+in+gut+crypts+that+can+revert+to+stem+cells+upon+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R-spondin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The R-spondin protein family.</a> Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).</li>
<li>Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+quiescence+of+Lgr5%2B+stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+switch+hormone+expression+along+the+crypt-to-villus+BMP+signalling+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient.</a> Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).</li>
<li>Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+high-purity+cultures+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny.</a> Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+swelling+in+intestinal+organoids%3A+An+in+vitro+assay+for+assessing+drug+response+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+surrogate+Wnts+support+organoid+growth+and+deconvolute+Frizzled+pleiotropy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).</li>
<li>Lea, T. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bio-Actives+on+Gut+Health%3A+In+Vitro+and+Ex+Vivo+Models%22">The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Questo protocollo descrive la manipolazione generale e il mantenimento degli organoidi intestinali, nonché la preparazione e le possibili applicazioni di monostrati epiteliali derivati da questi organoidi. Ad oggi, i monostrati sono stati preparati con successo dal duodeno, dall'ileo e da diverse regioni di organoidi del colon derivati dal tessuto intestinale normale e precedentemente e attivamente infiammato (dati non pubblicati). L'applicazione di monostrati organoidi derivati dal paziente facilita lo studio della funz...

L'epitelio intestinale agisce come una barriera fisica tra il contenuto luminale dell'intestino e il tessuto sottostante. Questa barriera comprende un singolo strato epiteliale di enterociti principalmente assorbenti che sono collegati da giunzioni strette, che stabiliscono forti connessioni intercellulari tra cellule adiacenti. Queste cellule formano un rivestimento epiteliale polarizzato che separa i lati apicale (lume) e basolaterale dell'intestino, regolando contemporaneamente il trasporto paracellulare di nutrienti e metaboliti digeriti. Oltre agli enterociti, anche altre importanti cellule epiteliali come calice, paneth e cellule enteroendocrine contribuiscono all'omeostasi intestinale producendo rispettivamente muco, peptidi antimicrobici e ormoni. L'epitelio intestinale viene costantemente reintegrato dividendo le cellule staminali del recettore 5-positivo (LGR5+) contenenti ripetizioni ricche di leucina nel fondo delle cripte intestinali producendo cellule che amplificano il transito (TA) che migrano verso l'alto e si differenziano in altri tipi di cellule1. L'interruzione dell'omeostasi epiteliale intestinale da parte di fattori genetici e ambientali, come l'esposizione ad allergeni alimentari, composti medicinali e agenti patogeni microbici, porta all'interruzione della funzione di barriera intestinale. Queste condizioni causano diverse malattie intestinali tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD), la celiachia e la tossicità GI indotta da farmaci2.
Gli studi sull'epitelio intestinale vengono eseguiti utilizzando diversi sistemi di piattaforma in vitro come inserti a membrana, sistemi organ-on-a-chip, camere di Ussing e anelli intestinali. Queste piattaforme sono adatte per stabilire monostrati epiteliali polarizzati con accesso sia ai lati apicali che basolaterali della membrana, utilizzando linee cellulari trasformate o tessuto primario come modelli. Sebbene le linee cellulari trasformate, come le linee cellulari del carcinoma del colon-retto (adeno)Carcinoma Caco-2, T84 e HT-29, siano in grado di differenziarsi in enterociti intestinali polarizzati o cellule produttrici di muco in una certa misura, non sono rappresentative dell'epitelio in vivo poiché mancano diversi tipi di cellule e vari recettori e trasportatori sono espressi in modo aberrante3 . Inoltre, poiché le linee cellulari sono derivate da un singolo donatore, non rappresentano l'eterogeneità interpaziente e soffrono di ridotta complessità e rilevanza fisiologica. Sebbene i tessuti primari utilizzati nelle camere di Ussing e come anelli intestinali siano più rappresentativi della situazione in vivo, la loro limitata disponibilità, vitalità a breve termine e mancanza di espandibilità li rendono inadatti come mezzo per studi ad alto rendimento (HT).
Gli organoidi sono colture epiteliali in vitro stabilite da diversi organi come intestino, rene, fegato, pancreas e polmone. Hanno dimostrato di avere espandibilità stabile a lungo termine e stabilità genetica e fenotipica e quindi sono miniature biologiche rappresentative dell'epitelio dell'organo originale con risposte fedeli agli stimoli esterni 4,5,6,7,8,9. Gli organoidi sono stabiliti in modo efficiente da tessuto resecato o biopsiato normale, malato, infiammato o canceroso, rappresentando risposte eterogenee specifiche del paziente 10,11,12,13,14,15,16. Questo articolo dimostra come stabilire monostrati epiteliali intestinali derivati da colture organoidiche. I monostrati sono stati stabiliti con successo da colture organoidi dell'intestino tenue e del colon e del retto. Questo modello crea l'opportunità di studiare il trasporto e la permeabilità delle cellule epiteliali ai farmaci, nonché i loro effetti tossicologici sull'epitelio. Inoltre, il modello consente la co-coltura con cellule immunitarie e batteri per studiare le loro interazioni con l'epitelio intestinale 17,18,19. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare le risposte alle terapie in modo specifico per il paziente e avviare gli sforzi di screening per cercare la prossima ondata di terapie focalizzate sulla barriera epiteliale. Un tale approccio potrebbe essere esteso alla clinica e aprire la strada a trattamenti personalizzati.
Sebbene i monostrati epiteliali in questo protocollo siano preparati da organoidi intestinali normali umani, il protocollo può essere applicato e ottimizzato per altri modelli organoidi. I monostrati organoidi epiteliali vengono coltivati in un mezzo di espansione organoide intestinale contenente Wnt per supportare la proliferazione delle cellule staminali e rappresentare la composizione cellulare della cripta intestinale. Gli organoidi intestinali possono essere arricchiti per avere diversi destini epiteliali intestinali, come enterociti, Paneth, calice e cellule enteroendocrine, modulando le vie Wnt, Notch e fattore di crescita epidermico (EGF). Qui, dopo la costituzione di monostrati nel mezzo di espansione, sono spinti verso cellule epiteliali intestinali più differenziate, come descritto in precedenza 20,21,22,23,24,25. Ai fini dello screening, a seconda della modalità d'azione del composto di interesse, delle sue cellule bersaglio e delle condizioni sperimentali, i monostrati possono essere guidati verso la composizione cellulare scelta per misurare gli effetti del composto con letture funzionali pertinenti.

<table><tbody><tr><td>100% etanolo</td><td>Fisher Emergo</td><td>10644795</td><td></td></tr><tr><td>1250, 300 e 20 &micro; L puntali filtranti a bassa ritenzione</td><td>Greiner bio-one</td><td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>piastra HTS Fluoroblok Transwell a 24 pozzetti Corning</td><td></td> <td>351156</td><td></td></tr><tr><td>piastre HTS Transwell a 24 pozzetti (Tabella 1)</td><td>Corning</td><td>3378</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti con inserti Transwell</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro cellulare m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50040-01</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>piastre per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>piastra nera a 96 pozzetti fondo trasparente</td><td>Greiner bio-one</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>piastre a ciclo termico rapido a 96 pozzetti</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Piastra HTS Fluoroblok Transwell a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>351162</td><td></td></tr><tr><td>Piastre HTS Transwell a 96 pozzetti (Tabella 1)</td><td>Corning</td><td>7369</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura trasparente a 96 pozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare accutasio</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>A11105-01</td><td>Cell reagente di dissociazione 2</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>integratore B27</td><td>Life Technologies Europe BV BV</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per colture cellulari (microscopio ottico)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO2</td><td>PHCBI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DEPC trattato con H2O</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>750024</td><td></td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco con Ca2+ e Mg2+</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio del lisozima EnzChek</td> Life <td>Technologies Europe BV</td><td>E22013</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore EVOM2 con elettrodo STX</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro</td><td>Volac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies Europa BV</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Human Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>Human Rspo3</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3500-RS/CF</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-335</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 anticorpo primario</td><td>Sanbio</td><td>BSH-7302-100</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 anticorpo secondario</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Kova International Glasstic Slide con griglie di conteggio</td><td>Fisher Emergo</td><td>10298483</td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Thermo scientifico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucifero giallo CH sale di dilitio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, fattore di crescita ridotto ( GFR)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>matrice extracellulare (ECM)</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 mL</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4358293</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-Cap Strips</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette (1000, 200 e 20 &micro; L)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUC2 anticorpo primario</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15334</td><td></td></tr><tr><td>MUC2 anticorpo secondario</td><td>VWR</td><td>VWRKS/DPVR-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale (200 &micro; L)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NGS Wnt</td><td>U-Protein Express</td><td>N001-0.5mg</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide ALPI1/Forward</td><td>Su misura</td><td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide ALPI1/Reverse</td><td>Su misura</td><td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide LGR5/Forward</td><td></td><td>ACACGTACCCACAGAAGCTC</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide LGR5/Reverse</td><td></td><td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide MUC2/Forward</td><td></td><td>AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG Oligonucleotide</td><td></td></tr><tr><td>MUC2/Reverse</td><td></td><td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide TBP/Forward</td><td></td><td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide TBP/Reverse</td><td></td><td>AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG</td><td></td></tr><tr><td>Coperture adesive ottiche Life</td><td>Technologies Europe BV</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72184</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore per piastre</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Fisher Emergo</td><td>A25776</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-2</td> formulazione <td>antimicrobica per cellule primarie</td></tr><tr><td>Kit di saggi Qubit RNA HS</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>Q32852</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio reagente per pipetta multicanale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4870</td><td></td></tr><tr><td>REMS AutoSampler con sonda a 24 sonde o 96C</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit</td><td>Thermo scientific</td><td>87023</td><td></td></tr><tr><td>Set DNasi senza RNasi</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore sierologico (Pipet-Aid)</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio a filo singolo</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript 1st strand system per RT-PCR</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>11904018</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Spark 10M lettore di piastre</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue, 0,4%</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>12605-010</td><td>Reagente di dissociazione cellulare 1 Bagno</td></tr><tr><td>d'acqua</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632 (inibitore ROCK)</td><td>AbMole</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In passato, i sistemi modello epiteliali intestinali erano limitati alle linee cellulari trasformate e al tessuto primario. Questi sistemi modello hanno limitazioni intrinseche in quanto i primi non rappresentano fedelmente la fisiologia tissutale originale e la disponibilità del secondo è limitata. Quindi, la loro applicazione ostacola la ricerca fondamentale e lo sviluppo di farmaci. Gli organoidi a base di cellule staminali adulte (d'ora in poi denominati organoidi) sono miniature di tessuto epiteliale normale o malato da cui derivano. Possono essere stabiliti in modo molto efficiente da diverse regioni del tratto gastrointestinale (GI), avere espandibilità a lungo termine e simulare risposte tessuto-specifiche e del paziente ai trattamenti in vitro. Qui, è stata dimostrata la creazione di monostrati epiteliali derivati da organoidi intestinali insieme a metodi per misurare l'integrità della barriera epiteliale, la permeabilità e il trasporto, la secrezione proteica antimicrobica e l'istologia. Inoltre, i monostrati derivati dagli organoidi intestinali possono essere arricchiti con cellule staminali proliferanti e che amplificano il transito, nonché con cellule epiteliali differenziate chiave. Pertanto, rappresentano un sistema modello che può essere adattato per studiare gli effetti dei composti sulle cellule bersaglio e la loro modalità d'azione. Sebbene le colture organoidi siano tecnicamente più esigenti delle linee cellulari, una volta stabilite, possono ridurre i fallimenti nelle fasi successive dello sviluppo del farmaco in quanto rappresentano veramente la complessità dell'epitelio in vivo e l'eterogeneità interpaziente.

La Figura 1A mostra un'immagine rappresentativa in campo luminoso degli organoidi intestinali dopo averli scongelati da una crioviale. È importante scongelare gli organoidi ad alta densità per garantire un recupero ottimale. Gli organoidi sono placcati in piastre a 24 o 6 pozzetti in cupole ECM di circa 10 μL (Figura 1B). La maggior parte degli organoidi intestinali normali ha una morfologia cistica. Dopo il recupero dal processo di scongelamento, gli organoidi ...

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

I monostrati di derivazione organoide ricapitolano la funzione di barriera epiteliale intestinale del paziente e consentono di testare l'effetto delle terapie volte a migliorare la disfunzione in ciascun paziente per identificare strategie di trattamento personalizzate. I monostrati organoidi forniscono l'accesso al lato apicale dell'epitelio, che è il lato in cui si verifica il danno, ed è normale e accessibile negli organoidi che crescono come strutture 3D. Ogni organoide è diverso, da qui la lotta.Per formare monostrati stretti, utilizzare organoidi in fase di proliferazione e digerire rapidamente per formare gruppi da due a quattro cellule. Titolare la semina cellulare per ogni modello. La dimostrazione della procedura sarà eseguita da Wies Van Dooremalen, un ricercatore associato senior di HUB.Inizia rivestendo gli inserti a membrana con matrice extracellulare o ECM. Lavorando in un armadio di biosicurezza, posizionare gli inserti della membrana nella piastra di supporto. Diluire l'ECM 40X in DPBS ghiacciato con calcio e magnesio, quindi pipettare 150 microlitri dell'ECM diluito nel compartimento apicale di ciascun inserto.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per almeno un'ora. Per preparare le cellule per la semina, prima della guerra un'aliquota del reagente di dissociazione cellulare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Utilizzare due millilitri del reagente per ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Trasferire la piastra di coltura contenente gli organoidi dall'incubatore all'armadio di biosicurezza. Elaborare gli organoidi come descritto nel manoscritto di testo, ma non raggruppare più tubi in un tubo. Dopo aver raccolto gli organoidi, aggiungere il mezzo basale o BM a 12 millilitri e centrifugare a 85 volte G, quindi aspirare il surnatante.Riempire il tubo contenente gli organoidi con un massimo di 12 millilitri di DPBS, quindi pipettare su e giù 10 volte usando una pipetta da 10 millilitri. Centrifugare a 85 volte G per cinque minuti a otto gradi Celsius e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet organoide. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare preriscaldato agli organoidi e risospese, quindi incubare i tubi diagonalmente o orizzontalmente per cinque minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, pipettare su e giù 10 volte usando una pipetta di plastica sterile da cinque millilitri o una pipetta P1000. Controllare la sospensione organoide al microscopio per vedere se si è formata una miscela di singole cellule e alcuni grumi cellulari costituiti da due o quattro cellule. Arrestare la dissociazione cellulare aggiungendo fino a 12 millilitri di BM con inibitore ROCK alla sospensione cellulare.Centrifugare le cellule, quindi aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quando si maneggia la stessa coltura organoide in più tubi, raggruppare i pellet di cella prima di risospenderli in 12 millilitri di BM. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 40 micrometri pre-bagnato con BM e raccogliere il flusso attraverso un tubo conico da 50 millilitri, quindi lavare il filtro con 10 millilitri di BM e raccogliere il flusso attraverso lo stesso tubo. Trasferire la sospensione di celle tese in due nuovi tubi conici da 15 millilitri e ripetere la centrifugazione.Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospesciare le cellule in quattro millilitri di IEM integrati con 10 inibitori ROCK micromolari per piastra di coltura completa utilizzata come materiale di partenza. Mescolare una piccola quantità di sospensione cellulare in un rapporto uno a uno con Trypan Blue per il conteggio, quindi contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule vive, contando ogni singola cellula in piccoli grumi. Preparare una sospensione cellulare contenente da 3X 10 a sesta cellula viva per millilitro di IEM integrata con 10 inibitori ROCK micromolari.Per seminare le cellule, aspirare accuratamente DPBS dagli inserti rivestiti in ECM, mantenendo la piastra orizzontale. Pipetta 800 microlitri di IEM integrati con inibitore ROCK in ciascun compartimento basolaterale e 150 microlitri della sospensione cellulare preparati sulla membrana rivestita di ECM nel compartimento apicale a goccia. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Una volta che le cellule si sono sedimentate sulla membrana, misurare la resistenza elettrica transepiteliale o TEER ogni giorno e visualizzare gli inserti della membrana usando un microscopio. Per rinfrescare i monostrati, rimuovere il mezzo dai compartimenti basolaterali della piastra contenente gli inserti a membrana, quindi aspirare accuratamente il mezzo dai compartimenti apicali. Aggiungi 150 microlitri di IEM fresco a goccia a ciascun compartimento apicale e aggiungi 800 microlitri di IEM fresco a ciascun compartimento basolaterale.Se si utilizza un misuratore TEER manuale, pulire l'elettrodo con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'aria all'interno dell'armadio di biosicurezza, quindi posizionare l'elettrodo in un tubo contenente BM. Collegare l'elettrodo al misuratore TEER manuale e ruotare l'interruttore funzione per misurare in ohm e accendere l'interruttore di alimentazione. Posizionare l'elettrodo corto nel compartimento apicale dell'inserto e l'elettrodo lungo nel compartimento basolaterale senza toccare il monostrato. Misurare la resistenza nel pozzo bianco, quindi nei campioni rimanenti.Lavare l'elettrodo con BM tra campioni con condizioni diverse. Al termine, pulire l'elettrodo con acqua demi e con etanolo al 70%, quindi lasciarlo asciugare all'aria. Questo protocollo è stato utilizzato per raccogliere organoidi intestinali e preparare monostrati di cellule epiteliali.Un monostrato che è stato coltivato per otto giorni in IEM è mostrato qui. Una struttura può essere osservata quando si espongono monostrati al mezzo di differenziazione degli enterociti o EDM, mentre i monostrati esposti al mezzo combinato o CDM mostrano una struttura più liscia. La formazione di monostrati è stata quantitativamente seguita dalla misurazione del TEER.Un monostrato completamente confluente aveva un valore TEER di circa 100 ohm centimetri quadrati che aumentava se esposto a entrambi i mezzi di differenziazione. I monostrati in tutte le condizioni medie hanno mostrato una minore permeabilità apparente al giallo lucifero. La secrezione di lisozima da parte di monostrati ileali coltivati in IEM è stata superiore a quella dei monostrati coltivati in IEM fino alla confluenza e per altri quattro giorni in EDM o CDM.I monostrati coltivati in IEM, IEM e successivamente EDM, o IEM e successivo CDM mostrano differenze nella morfologia osservate con le colorazioni H&E, Ki67, MUC2 e Alcian Blue. Dopo la differenziazione, le cellule proliferative sono diminuite, mentre l'espressione genica delle cellule caliciari e dei marcatori enterociti è aumentata rispetto a quella osservata in condizioni IEM come mostrato dall'espressione genica LGR5, MUC2 e fosfatasi alcalina. Quando si preparano monostrati, è importante prevenire l'anoikis negli organoidi dopo averli digeriti.Inoltre, l'ECM nelle cellule deve essere distribuito uniformemente sulle membrane Transwell. I monostrati derivati da organoidi consentono la valutazione dei trasporti molecolari utilizzando diversi substrati fluorescenti in modo specifico per il paziente.

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Biologia

Fonte: In, J. G., et al. Monostrati colonoidi umani per studiare le interazioni tra patogeni, commensali ed epitelio intestinale ospite. J. Vis. Esp. (2019).Questo video mostra la procedura per la coltivazione di cellule epiteliali derivate dal colon su un sistema Transwell rivestito di collagene per generare uno strato monostrato che produce muco e modella la barriera intestinale e consente studi di interazione ospite–patogeno.

Generazione di un monostrato colonoide umano con funzione barriera per studiare le interazioni ospite–patogeno

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Qui, presentiamo un protocollo alla cultura umana enteroid o colonoid monostrati che hanno funzione di barriera intatta per studiare le interazioni epiteliali-microbiota ospite a livello cellulare e biochimico.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Qui descriviamo una tecnica per quantificare l'integrità della barriera di piccoli organoidi intestinali. Il fatto che il metodo si basi su organoidi viventi consente l'indagine sequenziale di diverse sostanze o combinazioni di integrità della barriera in modo risolto nel tempo.

Indagare la rottura della barriera intestinale negli organiidi viventi

In questo protocollo, descriviamo come generare monostrati epiteliali primari murini direttamente dalle cripte intestinali. Forniamo approcci sperimentali per generare monostrati confluenti su filtri permeabili, monostrati confluenti per la guarigione delle ferite da graffio e studi biochimici e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.

Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Qui descriviamo la costruzione di un sistema modello di linea cellulare intestinale tridimensionale (3D) di base e un protocollo di inclusione della paraffina per la valutazione microscopica ottica di equivalenti intestinali fissi. La colorazione di proteine selezionate consente l'analisi di più parametri visivi da un singolo esperimento per un potenziale utilizzo in studi preclinici di screening farmacologico.

Sistema modello intestinale tridimensionale (3D) di base con una componente immunitaria

Gli enteroidi stanno emergendo come un nuovo modello per lo studio della fisiologia e della fisiopatologia dei tessuti, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. Qui, descriviamo un sistema di coltura derivato da enteroidi 2D di cellule primarie bovine che consente la co-coltura con i tipi di cellule tissutali rilevanti. Questo modello offre un vantaggio traslazionale per la modellazione della ricerca gastrointestinale.

Generazione di un sistema di coltura monostrato bidimensionale di derivazione enteroide primaria bovina per applicazioni nella ricerca biomedica traslazionale

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

Scopri come generare monostrati epiteliali da organoidi intestinali per studiare la funzione di barriera in vitro. Questo protocollo riproduce caratteristiche specifiche del paziente per ricerca personalizzata e sviluppo di farmaci mirati.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

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