Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Il nostro protocollo consente un'identificazione efficiente di combinazioni geniche o geniche che bloccano l'invasione del cancro nel visualizzatore. over culture non richiede strutture avanzate per gli animali per la manutenzione. Nel complesso, come generico o generale librerie speciali possono essere proiettate nel giro di diverse settimane nel visualizzatore.

Questo sistema di screening aiuterà i ricercatori a scoprire nuovi bersagli genetici terapeutici o combinazioni di bersagli genici che possono essere utilizzati per bloccare le metastasi del cancro. Per l'iniezione endovenosa, concentrare le cellule a 0,5-1 milione di cellule per millilitro, utilizzando 1X PBS ghiacciato per diluire o ri-sospendere le cellule. Aspettatevi che sarà necessario circa un millilitro di sospensione cellulare per ogni 10 embrioni.

Per assemblare l'apparecchio di iniezione, montare un ago sulla siringa e quindi estendere l'ago della siringa con un pezzo di tubo lungo da tre a cinque centimetri. Rompere la punta dell'ago borosilicato usando una pinna fine. Caricare la siringa con 50-200 microlitri della sospensione delle cellule tumorali.

E inserire l'ago borosilicato nel tubo. Ispezionare l'ago per l'intasamento delle cellule e le bolle d'aria. Se si osserva l'intasamento cellulare all'interno del capillare, rimuovere il capillare, sospendere nuovamente le cellule e sostituirlo con un nuovo capillare.

Usa lo stantuffo per spingere fuori eventuali bolle. Rimuovere il coperchio di copertura e trasferire l'embrione sotto lo stereoscopio. Identificare la vena appropriata da iniettare sulla superficie CAM, che normalmente è solo leggermente più larga del diametro della punta dell'ago borosilicato e si trova a metà strada tra l'embrione e la parete del piatto di pesatura.

È generalmente più facile iniettare nel punto immediatamente adiacente alla biforcazione venosa. Premere la punta dell'ago contro la parete dei vasi sanguigni e applicare una leggera pressione nella stessa direzione del flusso sanguigno. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone per aiutare ad ancorare o stabilizzare la nave che viene iniettata.

Premere delicatamente lo stantuffo della siringa per 2-10 secondi fino a quando non viene iniettato il volume desiderato. Scartare l'embrione se nel sito di iniezione appare un sanguinamento eccessivo o un chiaro accumulo di liquidi. Rimuovere l'ago dal CAM e tamponare delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue o le cellule tumorali in eccesso.

Coprire l'embrione iniettato nella pesata con il coperchio e riportarlo all'incubatrice. Ripetere la procedura fino a quando tutti gli embrioni vengono iniettati. Ispezionare visivamente gli embrioni per la contaminazione o la morte di batteri o muffe.

E scartare gli embrioni contaminati secondo le procedure di smaltimento di laboratorio. Assicurarsi che le colonie metastatiche appaiano di forma uniforme durante i primi uno o tre giorni dopo l'iniezione. E identificare colonie metastatiche invasive o non invasive nei giorni da quattro a cinque dopo l'iniezione.

Al quinto giorno dopo l'iniezione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e ispezionare e localizzare i CAR embrionali per la distribuzione della colonia metastatica. Sotto il microscopio di dissezione, tirare delicatamente il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica di interesse verso l'alto usando una pinza fine e tagliarlo con forbici chirurgiche. Trasferire il tessuto CAM in un tubo vuoto e sterile da 1,5 millilitro e chiudere il coperchio del tubo.

Ripetere la procedura di escissione fino a quando tutte le colonie di interesse sono raccolte in tubi separati. Tritare delicatamente il tessuto CAM in un tubo di micro centrifuga, utilizzando un ago sterile separato da 18 gauge per ogni colonia. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di collagene-A 1X e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Abbassare le cellule e il tessuto CAM a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di collagene-A e ri-sospendere i mezzi incompleti delle cellule per la linea cellulare di interesse. Quindi ruotare di nuovo le cellule e il tessuto.

Ri-sospendere le cellule e i pezzi di tessuto in un millilitro di media completo e fattore di selezione, se presente. Quindi trasferire in un singolo piatto di coltura tissutale a 12 pozzedi bene. Per le prossime una o tre settimane, monitorare quotidianamente le cellule tumorali per la crescita e la contaminazione.

Quando le cellule raggiungono il 70-80% della confluenza, trasferiscile in un piatto di coltura di volume più grande. Procedere al sequenziamento o al successivo ciclo di selezione, non appena viene raggiunto un numero adeguato di cellule tumorali. Gli embrioni che mostrano un accumulo di cellule tumorali a causa di un'iniezione non riuscita, possono essere visti nella maggior parte dei capillari.

Quando si raggiunge la concentrazione cellulare ottimale e la durata dell'iniezione, le cellule trasdotte post-iniezione del quinto giorno dovrebbero produrre un'ampia varietà di fenotipi di colonia, con la maggior parte delle colonie invasive come determinato dalle cellule tumorali che appaiono sparse nel tessuto CAM. Si dovrebbe prestare attenzione alle colonie metastatiche che appaiono compatte e si trovano abbastanza lontane dalle colonie vicine da poter essere asportate con pinza e forbici e un pezzo di tessuto CAM. Uno schermo positivo isolato dovrebbe visualizzare il fenotipo della colonia compatta al momento della reiniezione.

Per la misurazione dei contatti dei vasi sanguigni delle cellule tumorali, si deve prestare attenzione alla luminosità della macchia della parete vascolare e la quantità appropriata di lectine deve essere iniettata per il segnale della parete vascolare. Quando si tenta questo protocollo evitare sotto o sopra l'iniezione e rimuovere sanguinamento eccessivo o accumulo di liquidi. Diversi nuovi geni che stanno guidando l'invasione delle cellule tumorali nello spettatore sono stati identificati utilizzando questa tecnica.