Name: Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Impara a creare un modello murino di pancreatite cronica mediante infusione di TNBS nel dotto biliare. Questo metodo ottimizzato consente di studiare dolore neuropatico e fibrosi pancreatica nei topi C57BL/6.

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Questo studio è stato supportato dal Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR& D Merit I01BX004536) e dal National Institute of Health che concede # 1R01DK105183, DK120394 e DK118529 a HW. Ringraziamo il Dr. Hongju Wu per aver condiviso l'esperienza tecnica.

Tutte le procedure sono state condotte con l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali presso la Medical University of South Carolina e il Ralph H. Johnson Medical Center. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J di età compresa tra 8-10 settimane. I topi erano alloggiati sotto un ciclo standard di 12 luci / 12 oscuri con accesso ad libitum al cibo e all'acqua.
1. Preparazione della soluzione iniettabile di TNBS
<ol><li>Preparare il 10% di etanolo in soluzione salina allo 0,9%. Sciogliere lo stock TNBS (vedi Tabella dei materiali)in etanolo al 10% ad una concentrazione finale di 7,5 mM aggiungendo 7,5 μL di TNBS in 1 mL di etanolo al 10%. ATTENZIONE: TNBS presenta un rischio chimico. Preparare la soluzione all'interno di una cappa aspirante e utilizzare dispositivi di protezione individuale come guanti, occhiali e un camice da laboratorio per evitare il contatto diretto con TNBS.</li>
	<li>Caricare 50 μL di soluzione di TNBS al 0,75% in una siringa da insulina con un ago calibro 31. Caricare 50 μL di etanolo al 10% in soluzione salina in una siringa delle stesse dimensioni del controllo del veicolo. Posizionare le siringhe sul ghiaccio e proteggerle dalla luce fino a quando necessario.</li>
</ol>2. Preparazione e chirurgia del topo
<ol><li>Rasare i capelli dall'area chirurgica addominale.</li>
	<li>Iniettare una dose preventiva dell'analgesico (ad es. buprenorfina 0,1 mg/kg p.i.) prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Indurre e mantenere il topo in anestesia generale con l'1,5-2% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno. Confermare l'anestesia pizzicando le dita dei piedi e osservando l'animale per mancanza di riflesso.</li>
	<li>Posizionare il mouse su un pad chirurgico riscaldato durante l'intervento chirurgico. Applicare un unguento veterinario su ciascun occhio quando il topo è sotto anestesia.</li>
	<li>Disinfettare il sito chirurgico pulendo l'area chirurgica 3x con il 2% di iodio, seguito dal 70% di alcol (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire una laparotomia con micro forbici per generare un'incisione di 0,5-1 cm.</li>
	<li>Esporre delicatamente il duodeno e individuare il dotto biliare comune utilizzando tamponi di cotone (Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare una micro clip emo-retta (Tabella dei materiali) sul condotto comune prossimale per impedire il flusso di TNBS o soluzioni di veicoli nel fegato e nella cistifellea ( Figura1A, B).</li>
	<li>Esporre delicatamente il duodeno e inserire l'ago nel dotto pancreatico attraverso la papilla di Vater.</li>
	<li>Una volta che l'ago è all'interno del condotto, posizionare una micro clip emo-emo curva (Tabella dei materiali) sopra il duodeno che circonda l'ago ( Figura1A) per fissare l'ago in posizione e impedire alla soluzione iniettata di entrare nel duodeno.</li>
	<li>Infondere gradualmente la soluzione (TNBS o veicolo) nel dotto pancreatico nel corso di un minuto. NOTA: TNBS deve essere infuso lentamente per un minuto di tempo ed è facile controllare la velocità di infusione quando il pancreas viene perfuso con una siringa da insulina con un ago da 5/16 pollici e 31G. Mantenere la mano il più stabile possibile per evitare di pungere il dotto biliare. Se TNBS viene iniettato con successo, il colore giallo può essere visibile all'interno del pancreas.</li>
	<li>Dopo l'infusione, rimuovere con attenzione il micro morsetto vicino al fegato, quindi rimuovere il micro morsetto che tiene l'ago e il duodeno.</li>
	<li>Riportare con attenzione il duodeno nella sua posizione originale.</li>
	<li>Lasciare 0,5 ml di soluzione salina sterile calda (36-37 °C) nella cavità addominale prima della chiusura, per aiutare il duodeno a tornare nella sua posizione originale e aiutare con il recupero della peristalsi.</li>
	<li>Chiudere l'incisione nello strato muscolare usando la sutura continua con un punto 5-0. Chiudere la pelle usando la sutura interrotta con un punto 4-0.</li>
	<li>Posizionare la gabbia contenente topi su una piastra riscaldante per consentire il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Confermare che i topi sono caldi e capaci di movimento spontaneo prima di riportarli nella stanza di attesa.</li>
	<li>Continuare a fornire un analgesico (ad esempio, buprenorfina 0,1 mg / kg i.p.) ogni 12 ore e calore supplementare per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
</ol>3. Monitoraggio del comportamento del mouse
<ol><li>Rimuovere le suture al giorno 7 post-operatorio.</li>
	<li>Monitorare la salute e il comportamento del topo ogni giorno durante la prima settimana post-operatoria. Fai attenzione ai segni di angoscia come vocalizzazione, postura della schiena curva o locomozione ridotta. Misura il peso corporeo a giorni alterni.</li>
	<li>Utilizzare monofili di Von Frey (VFF) per misurare l'ipersensibilità meccanica addominale prima e 2, 3 settimane dopo l'intervento chirurgico come descritto9,14.<ol>
<li>Applicare VVFF di diverse forze applicate in ordine crescente alla zona addominale superiore 10 volte ogni 1-2 s. Considera l'innalzamento, la retrazione o la leccatura dell'addome (risposta di astinenza) come una risposta positiva.</li>
		<li>Applicare uno stimolo più forte se non si osserva una risposta positiva e uno stimolo più debole se si osserva una risposta positiva. La soglia di prelievo è la forza alla quale il mouse risponde il 50% delle volte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Raccolta e analisi istologica del tessuto pancreatico
<ol><li>Sacrificare i topi in anestesia per lussazione cervicale e sezionare attentamente il pancreas dall'intestino e da altri organi.</li>
	<li>Fissare il pancreas in paraformaldeide al 10% per 24 ore, incorporarlo nella paraffina, tagliare sezioni di tessuto di 5 μm di spessore e posizionarle su vetrini per la colorazione.</li>
	<li>Eseguire l'ematossilina-eosina e la colorazione tricroma di Masson utilizzando metodi standard come precedentemente riportato4.</li>
</ol>

<ol><li>Klauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+induced+vs.+classical+animal+models+of+chronic+pancreatitis%3A+a+critical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22The+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetically induced vs. classical animal models of chronic pancreatitis: a critical comparison.</a> The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32, 5778-5792 (2018).</li>
<li>Liao, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+is+involved+in+%C2%B5-opioid+receptor+suppression+in+the+spinal+dorsal+horn+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 is involved in µ-opioid receptor suppression in the spinal dorsal horn in a rat model of chronic pancreatitis pain.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (2), 2803-2810 (2018).</li>
<li>Gui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+activity+governs+increased+susceptibility+to+pancreatitis+in+mice+expressing+human+PRSS1R122H%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Trypsin activity governs increased susceptibility to pancreatitis in mice expressing human PRSS1R122H.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 189-202 (2020).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Stem+Cell+Therapy+Mitigates+Chronic+Pancreatitis+via+Differentiation+into+Acinar-like+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adipose Stem Cell Therapy Mitigates Chronic Pancreatitis via Differentiation into Acinar-like Cells in Mice.</a> Molecular Therapy. 25 (11), 2490-2501 (2017).</li>
<li>Aghdassi, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+investigating+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+and+Tissue+Repair%22%5BJournal%5D)">Animal models for investigating chronic pancreatitis.</a> Fibrogenesis and Tissue Repair. 4 (1), 26(2011).</li>
<li>Scoggins, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-dependent+acinar+cell+apoptosis+triggers+epithelial+proliferation+in+duct-ligated+murine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">p53-dependent acinar cell apoptosis triggers epithelial proliferation in duct-ligated murine pancreas.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 279 (4), 827-836 (2000).</li>
<li>Bradley, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+duct+pressure+in+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Pancreatic duct pressure in chronic pancreatitis.</a> The American Journal of Surgery. 144 (3), 313-316 (1982).</li>
<li>Zhao, J. B., Liao, D. H., Nissen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pancreatitis%3A+can+it+be+translated+to+human+pain+study%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Animal models of pancreatitis: can it be translated to human pain study.</a> World Journal of Gastroenterology. 19 (42), 7222-7230 (2013).</li>
<li>Winston, J. H., He, Z. J., Shenoy, M., Xiao, S. Y., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+behavioral+changes+in+nociception+in+a+novel+rat+model+of+chronic+pancreatitis+for+the+study+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular and behavioral changes in nociception in a novel rat model of chronic pancreatitis for the study of pain.</a> Pain. 117 (1-2), 214-222 (2005).</li>
<li>Cattaruzza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+receptor+potential+ankyrin+1+mediates+chronic+pancreatitis+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient receptor potential ankyrin 1 mediates chronic pancreatitis pain in mice.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (11), 1002-1012 (2013).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+insular+cortex+mediates+hyperalgesia+induced+by+chronic+pancreatitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Anterior insular cortex mediates hyperalgesia induced by chronic pancreatitis in rats.</a> Molecular Brain. 12 (1), 76(2019).</li>
<li>Puig-Diví, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX4+Gene+Transfer+Induces+alpha-to-beta+Cell+Phenotypic+Conversion+and+Confers+Therapeutic+Benefits+for+Diabetes+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">PAX4 Gene Transfer Induces alpha-to-beta Cell Phenotypic Conversion and Confers Therapeutic Benefits for Diabetes Treatment.</a> Molecular Therapy. 24 (2), 251-260 (2016).</li>
<li>Ceppa, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+proteases+mediate+inflammatory+pain+in+acute+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serine proteases mediate inflammatory pain in acute pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (6), 1033-1042 (2011).</li>
<li>Puig-Divi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+pancreatic+disease+by+trinitrobenzene+sulfonic+acid+infusion+into+rat+pancreatic+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic pancreatic disease by trinitrobenzene sulfonic acid infusion into rat pancreatic ducts.</a> Pancreas. 13 (4), 417-424 (1996).</li>
<li>Xu, G. Y., Winston, J. H., Shenoy, M., Yin, H., Pasricha, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitability+and+suppression+of+A-type+K%2B+current+of+pancreas-specific+afferent+neurons+in+a+rat+model+of+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitability and suppression of A-type K+ current of pancreas-specific afferent neurons in a rat model of chronic pancreatitis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 291 (3), 424-431 (2006).</li>
<li>Drewes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+in+chronic+pancreatitis%3A+the+role+of+neuropathic+pain+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Pain in chronic pancreatitis: the role of neuropathic pain mechanisms.</a> Gut. 57 (11), 1616-1627 (2008).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

L'infusione del dotto biliare di TNBS per indurre pancreatite cronica è tecnicamente impegnativa nei topi, poiché fino al 22,5% dei topi può morire entro 3-4 giorni dall'infusione del farmaco10. Qui, questo rapporto ha perfezionato la procedura sulla base di studi precedenti e ha ridotto la mortalità precoce dei topi a <10%. Ad esempio, l'aumento del volume del farmaco (da 35 μL a 50 μL) può garantire che i farmaci raggiungano l'intero pancreas. L'uso di una siringa da insulina e di una dimensione...

La pancreatite cronica (CP) è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata da atrofia del pancreas, fibrosi, dolore addominale ed eventuale perdita delle funzioni sia esocrine che endocrine1. Gli attuali trattamenti medici e chirurgici non sono curativi ma vengono intrapresi per alleviare i sintomi che sono la conseguenza della malattia: dolore addominale refrattario, disfunzione endocrina ed esocrina. Pertanto, sono urgentemente necessari trattamenti più efficaci2. I modelli animali forniscono uno strumento essenziale per sviluppare una migliore comprensione della malattia e studiare potenziali terapie3. Sono stati sviluppati diversi modelli murini per CP, di cui modelli di ceruleina e/o alcol sono comunemente usati. Ceruleina, un oligopeptide che stimola la secrezione pancreatica, ha dimostrato di indurre in modo riproducibile un modello CP con atrofia pancreatica, fibrosi, tra gli altri4. Un altro modello comune utilizza iniezioni seriali di L-arginina, che produce insufficienza esocrina simile a quella osservata nei pazienti umani5. La CP può anche essere indotta dalla legatura completa o parziale del dotto pancreatico, così come dall'ipertensione del dotto pancreatico6,7. Nonostante la varietà di modelli animali disponibili per CP, nessuno di questi modelli riproduce efficacemente il dolore addominale sperimentato dai pazienti CON CP8.
Studi precedenti hanno dimostrato che l'iniezione pancreatica locale di acido solfonico 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS) replica il dolore persistente sperimentato dai pazienti CON CP9,10,11. I topi trattati con TNBS hanno dimostrato ipersensibilità addominale e aumento dei comportamenti correlati al dolore, nonché una "ipersensibilità generalizzata" agli stimoli dolorosi, un fenomeno che è stato osservato nei pazienti con CP10. Oltre a imitare accuratamente il dolore CP, il modello TNBS replica anche altre caratteristiche patologiche della condizione umana come la fibrosi, l'infiltrazione di cellule mononucleate e la sostituzione delle cellule acinari con tessuto adiposo10,12. Tuttavia, l'infusione di TNBS attraverso il dotto biliare è una procedura tecnicamente impegnativa nei topi che può causare la morte. Per quanto ne sappiamo, non esiste un protocollo visivo per mostrare come viene eseguita l'infusione del dotto biliare. In questo articolo, dimostriamo la procedura dell'infusione di duzione biliare di TNBS per generare un modello murino CP. Questa procedura aiuterà a generare preziosi modelli animali per lo studio della CP e di altre malattie pancreatiche e può essere utilizzata per infondere altri materiali (ad esempio, virus, cellule) nel pancreas13.

<table><tbody><tr><td>10% Formalina neutra tamponata v/v</td><td>Fisher Scientific</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol, sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Sistema per anestesia animale</td><td>VetEquip, Inc.</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>Buprenorfina cloridrato, iniezione</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, assoluto (200 proof), grado di biologia molecolare</td><td>Fisher Scientific BP2818500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione extra fini Roboz</td><td>Surgical da 4" Strumento Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe 4" punta extra delicata</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldato</td><td>Amazon</td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartner Porta aghi 5.25"</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>Siringa da insulina RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>con ago calibro 31</td><td>BD</td><td>324909</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetti per la preparazione dello iodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Micro clip per l'applicazione di pinze da 5,5"</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>Micro clip, dritto forte curvo 1x6mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5433</td><td></td></tr><tr><td>Micro clip, diritta, larghezza clip 0,75 mm</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido picrilsolfonico, TNBS, 1M in H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>92822-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in polipropilene 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, soluzione endovenosa allo 0,9%</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>Telo chirurgico, sterile</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta tissutale</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Filamenti Von Frey</td><td>Bioseb</td><td>EB2-VFF</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di tnbs del dotto biliare

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

La pancreatite cronica (CP) è una malattia complessa che coinvolge l'infiammazione pancreatica e la fibrosi, l'atrofia ghiandolare, il dolore addominale e altri sintomi. Diversi modelli di roditori sono stati sviluppati per studiare la CP, di cui il modello di infusione del dotto biliare acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS) replica le caratteristiche del dolore neuropatico osservato nella CP. Tuttavia, l'infusione di farmaci per i dotti biliari nei topi è tecnicamente impegnativa. Questo protocollo dimostra la procedura di infusione di TNBS del dotto biliare per la generazione di un modello murino CP. La TNBS è stata infusa nel pancreas attraverso l'ampolla di Vater nel duodeno. Questo protocollo ha ottimizzato il volume del farmaco, le tecniche chirurgiche e la gestione del farmaco durante la procedura. I topi trattati con TNBS hanno mostrato caratteristiche di CP riflesse da riduzioni del peso corporeo e del pancreas, cambiamenti nei comportamenti associati al dolore e morfologia pancreatica anormale. Con questi miglioramenti, la mortalità associata all'iniezione di TNBS è stata minima. Questa procedura non è solo fondamentale nella generazione di modelli di malattia pancreatica, ma è anche utile nella somministrazione locale di farmaci pancreatici.

Le procedure di infusione del dotto biliare sono state ottimizzate per ridurre la mortalità dei topi associata a questa procedura10. TNBS è stato somministrato per la prima volta in un volume totale di 35 μL o 50 μL. L'iniezione di TNBS in un volume di 50 μL potrebbe raggiungere l'intero pancreas e indurre un fenotipo di malattia più omogeneo (Figura 1B). Inoltre, l'iniezione di TNBS utilizzando siringa da insulina con ago 31G potrebbe controllare meglio la velocità d...

La pancreatite cronica (CP) è una malattia caratterizzata da infiammazione e fibrosi del pancreas, spesso associata a dolori addominali intrattabili. Questo articolo si concentra sul perfezionamento della tecnica per generare un modello murino di CP tramite infusione del dotto biliare con acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS).

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

La pancreatite cronica è una malattia complessa che coinvolge l'infiammazione pancreatica, la fibrosi, il dolore addominale e altri sintomi. Il modello di infusione TNBS del dotto biliare replica il dolore neuropatico osservato nei pazienti con pancreatite cronica. Questo protocollo di infusione TNBS del dotto biliare è stato ottimizzato per indurre la generazione di un modello di pancreatite cronica nei topi.Poiché la fusione di farmaci per i dotti biliari nei topi è tecnicamente impegnativa, la sua visualizzazione sarà utile ai ricercatori nuovi al metodo. Prima e due e tre settimane dopo l'intervento chirurgico, utilizzare i monofili di Von Frey per applicare diversi livelli di forza in ordine crescente alla zona addominale superiore di un topo da otto a 10 settimane, C57 nero sei, 10 volte per uno o due secondi per applicazione. Considera di aumentare la retrazione o la leccatura dell'addome come risposta positiva.Quindi, caricare una siringa da insulina dotata di un ago calibro 31 con 50 microlitri di una soluzione TNBS al 0,75% appena preparata. Caricare una seconda siringa con 50 microlitri di etanolo al 10% in soluzione salina come controllo del veicolo e posizionare entrambe le siringhe sul ghiaccio al riparo dalla luce. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, rimuovere i peli dalla regione addominale del topo anestetizzato radendosi o applicando la crema per la depilazione e posizionare il mouse su un pad chirurgico riscaldato sotto un microscopio sezionante.Applicare un unguento veterinario su ciascun occhio e disinfettare il sito chirurgico con tre salviette sequenziali al due percento di iodio e tre salviette al 70 percento di etanolo utilizzare micro forbici per praticare un'incisione da 0,5 a un centimetro in un movimento continuo e utilizzare tamponi di cotone per esporre delicatamente il duodeno e per individuare il dotto biliare comune. Per impedire il flusso del trattamento nel fegato e nella cistifellea, utilizzare il microscopio per posizionare una micro emoclip diritta sul dotto comune prossimale e inserire l'ago della siringa caricata TNBS attraverso la papilla di vater nel dotto pancreatico. Utilizzare una micro emoclip curva per fissare l'ago e infondere la soluzione nel dotto pancreatico nel corso di un minuto.Quando tutta la soluzione è stata consegnata, rimuovere con attenzione i micro morsetti e confermare che il duodeno è tornato nella sua posizione originale. Prima della chiusura della cavità addominale, aggiungere 500 microlitri da 36 a 37 gradi Celsius soluzione salina sterile per aiutare il duodeno a tornare nella sua posizione originale e per aiutare con il recupero della peristalsi. Utilizzare una sutura continua con un punto cinque O per chiudere l'incisione nello strato muscolare e chiudere la pelle usando una sutura interrotta con un punto quattro-O.Quindi posizionare il mouse in una gabbia di recupero su una piastra riscaldante con monitoraggio fino alla completa reclinenza. Monitorare la salute e il comportamento del topo ogni giorno durante la prima settimana post-operatoria per segni di disagio, come vocalizzazione, una postura della schiena curva o ridurre la locomozione e misurare il peso corporeo a giorni alterni. Come osservato, l'iniezione di 50 microlitri di inchiostro come dimostrato provoca l'infiltrazione dell'intero pancreas, consentendo l'induzione di un fenotipo di malattia più omogeneo.In questa analisi rappresentativa, nei primi tre giorni dopo l'intervento chirurgico, i topi nel gruppo di controllo hanno perso circa il sei percento del loro peso corporeo originale prima di recuperare gradualmente e guadagnare oltre il 100% del loro peso corporeo originale entro il giorno 21. Al contrario, i topi che hanno ricevuto TNBS hanno perso circa il 15% del loro peso corporeo originale durante i primi cinque giorni dopo l'intervento chirurgico e hanno riacquistato poco meno del 100% del loro peso corporeo originale entro il giorno 21. Rispetto ai topi di controllo, gli animali iniettati con TNBS hanno mostrato un aumento dell'ipersensibilità meccanica addominale durante la seconda e la terza settimana dopo l'intervento chirurgico.Le dimensioni e il peso per peso corporeo dei pancreas sono stati significativamente ridotti nei topi TNBS rispetto ai pancreas raccolti da animali di controllo, suggerendo una marcata atrofia pancreatica negli animali trattati con TNBS coerente con i risultati negli esseri umani con pancreatite cronica grave e a lungo termine. L'analisi istologica delle sezioni di tessuto pancreatico di topi trattati con etanolo di controllo ha mostrato una morfologia normale, mentre le sezioni di tessuto di topi trattati con TNBS hanno mostrato una realizzazione vacua con una massiccia perdita di cellule acinari che sono state sostituite da infiltrazione di cellule adipose e fibrosi. Impedire al TNBS iniettato di entrare nella vescica gal e nell'intestino è importante in quanto un TNBS ha effetti dannosi per i tessuti.Durante l'infusione, mantenere la mano il più stabile possibile per evitare di agire in puntura sul dotto biliare. Oltre a indurre lo sviluppo di pancreatite cronica, questa arte dei topi per infusione del dotto biliare può essere utilizzata per lo sviluppo di altri modelli di malattia pancreatica. Questo modello murino di pancreatite cronica TNBS può essere utilizzato per studiare sia la patogenesi che il trattamento della pancreatite cronica e di altre malattie pancreatiche.

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Questo video descrive la procedura per la generazione di un modello murino con pancreatite biliare acuta tramite infusione pancreatica di taurocolato di sodio. Questo modello aiuta a studiare i cambiamenti fisiopatologici indotti dal taurocolato di sodio nel pancreas.

Modello di pancreatite biliare acuta: un metodo per generare un modello murino di pancreatite biliare acuta tramite infusione del dotto pancreatico

Modelli animali per la pancreatite acuta grave consentono lo studio dei cambiamenti fisiopatologici nella fase iniziale, facilitando l'osservazione dell'evoluzione degli eventi infiammatori. Qui forniamo un protocollo per l'induzione della pancreatite biliare acuta grave mediante infusione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto pancreatico di topi C57BL/6 anestetizzati.

Pancreatite acuta grave indotta da taurocolato di sodio nei topi C57BL/6

Un modello murino di pancreatite acuta grave è descritto qui. La procedura qui presentata è molto rapida, semplice e accessibile, consentendo così potenzialmente lo studio dei meccanismi molecolari e dei diversi interventi terapeutici nella pancreatite acuta in modo conveniente.

Creazione di un modello di pancreatite acuta grave del topo mediante iniezione retrograda di taurocolato di sodio nel dotto biliopancreatico

Abbiamo stabilito un modello murino di fibrosi epatica cronica, che fornisce un modello animale adatto per lo studio meccanicistico della fibrosi epatica indotta da virus dell'atresia biliare (BA) e una piattaforma per futuri trattamenti BA.

Un modello murino di fibrosi epatica cronica per lo studio dell'atresia biliare

La somministrazione intraperitoneale di farmaci è un approccio non invasivo sicuro ed efficace per indurre lesioni pancreatiche. Questo studio ha confrontato cinque distinti protocolli di iniezione intraperitoneale sui topi per indurre vari gradi di danno pancreatico e ha stabilito un modello di grave danno pancreatico per studiare i cambiamenti patologici e le strategie di trattamento per la pancreatite acuta grave (SAP).

Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

Il presente protocollo descrive un nuovo approccio alla modellazione della pancreatite cronica ostruttiva, che prevede la visualizzazione del dotto pancreatico e l'elettrocoagulazione del dotto pancreatico per causare l'ostruzione del dotto pancreatico.

Un modello di pancreatite cronica ostruttiva stabilito attraverso l'elettrocoagulazione

Un protocollo per l'incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il dotto di Wharton è descritto. Per questo esperimento, la soluzione trypan blu è usato come un tintore per dimostrare quanto questa tecnica offre efficacemente infusi nella ghiandola mirati, e di suggerire l'affidabilità di questo nuovo approccio clinico come un potenziale farmaco / terapia cellulare per la rigenerazione delle ghiandole salivari.

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Un metodo di visualizzare e quantificare il 3-dimensionale struttura vena porta mouse o dotto biliare intraepatica è descritto. Questa tecnica resina può anche essere applicata ad altri sistemi duttali o vascolare e...

3-Dimensional Casting resina e imaging di Vena mouse portale o sistema biliare intraepatica Duct

Un protocollo per infusioni cronici di glucosio e Intralipid nei ratti è descritto. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'impatto di un eccesso di nutrienti in funzione degli organi e dei parametri fisiologici.

Un modello del Chronic Infusion nutrienti nel ratto

Ipertensione oculare cronica è indotta mediante fotocoagulazione laser del trabecolato negli occhi del mouse. La pressione intraoculare (IOP) è elevato per diversi mesi dopo il trattamento laser. La diminuzione di acuità visiva e la sensibilità al contrasto di animali da esperimento sono monitorati utilizzando il test optomotor.

Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Impara a creare un modello murino di pancreatite cronica mediante infusione di TNBS nel dotto biliare. Questo metodo ottimizzato consente di studiare dolore neuropatico e fibrosi pancreatica nei topi C57BL/6.

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

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