Valutazione funzionale della permeabilità intestinale e della migrazione transepiteliale neutrofila nei topi utilizzando un modello standardizzato di loop intestinale

Il modello intestinale è un modo ampiamente adattabile e fisiologico per misurare quanto sia perdente l'intestino e come i leucociti migrano nell'intestino nei topi, in vivo. Questo metodo aiuta a comprendere meglio i meccanismi alla base dell'aumento della permeabilità intestinale e dell'infiammazione intestinale patologica. La tecnica può essere utilizzata per aiutare nei nostri meccanismi di comprensione alla base della funzione barriera intestinale e infiammazione patologica, come si vede nella colite ulcerosa e nella malattia di Crohn.

Questo modello utilizza un segmento intestinale ben vascolarizzato ed esteriore, sia del colon ileo che del colon prossimale, per l'esame della funzione barriera intestinale o il reclutamento delle cellule immunitarie nel topo. Con questa ampia applicazione, il modello di loop intestinale può fornire informazioni sulle malattie derivanti da una barriera intestinale che perde e dalla risposta infiammatoria. Le lotte possono essere superate praticando i passaggi chirurgici.

È di fondamentale importanza esternalizzare un segmento intestinale completamente vascolarizzato e selezionare posizioni appropriate per le legazioni per evitare sanguinamento. Il modello ad anello intestinale è una tecnica microchirurgica, quindi, come per altre procedure chirurgiche, beneficia notevolmente della dimostrazione visiva e di una presentazione passo-passo del metodo. Dopo aver raggiunto un piano chirurgico di anestesia, iniziare pulendo la pelliccia della linea mediana addominale con tamponi di alcol o una spugna di garza imbevuta di 70%etanolo.

Non bagnare un'ampia area di pelliccia con alcool per prevenire l'ipotermia. Usando le forbici, eseguire una laparotomia di media linea. Fai un'incisione orizzontale nel mezzo dell'addome ed esponi il peritoneo, facendo attenzione a non ferire gli organi intra-addominali.

Posizionare una garza di cotone bagnata pretagliata sulla cavità intra-addominale esposta. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per mobilitare ed esternaizzare il cieco e posizionarlo con cura su una garza di cotone bagnata. Quindi, mobilita e esternaizza delicatamente l'ileo.

Dispiegare almeno sei centimetri di ileo terminale sulla garza di cotone bagnata senza interrompere i vasi mesenterici e l'apporto di sangue. Mantenere i tessuti esposti sempre umidi con HBSS caldo. Identificare l'arteria principale che fornisce l'ileo nel mesenterio, vicino al cieco.

Quindi, individua due siti di litigazione nel mesentere che sono liberi da vasi sanguigni critici. Afferrare saldamente l'ileo terminale con forcelle di tessuto smussato e utilizzare forcelle a punta fine per respingere il mesentere, evitando i vasi sanguigni. Posizionare la sutura di seta sulla perforazione e legare un nodo chirurgico per creare la prima legatura.

Utilizzare il righello per misurare quattro centimetri di distanza dalla prima legatura e creare la seconda legatura. Tagliare con cura accanto a ogni legatura con forbici fini per isolare l'anello ileale di quattro centimetri, mantenendo intatti l'apporto di sangue e la membrana mesenterica. Sciacquare delicatamente il contenuto del segmento del loop ileale con HBSS caldo utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 millilitri.

Assicurarsi di sciacquare il contenuto luminare dalla cavità addominale per mantenere pulito il sito chirurgico. Ligate le due estremità tagliate del passante ileale arrossato con sutura di seta. Utilizzare una siringa da millilitro con un ago calibro 30 per iniettare lentamente 250 microlitri di reagente, come FITC-dextrans o chemiochina, nel lume intestinale.

L'anello ileale si gonfierà, causando una moderata distensione della mucosa. Chiudi la parete addominale usando un portaaghi, pini anatomici e 3,0 suture di seta non assorbibili con un ago da taglio inverso. Dopo aver asciugato l'animale per prevenire l'ipotermia, posizionarlo in una camera di anestesia regolata dalla temperatura per il periodo di incubazione.

Preparare il mouse per l'intervento chirurgico ed esternaizzare il cieco come dimostrato in precedenza. Utilizzando tamponi di cotone bagnati, esternalizza l'intero ileo e posizionalo sopra una garza di cotone bagnata. Identificare il colon prossimale e l'apporto di sangue situato nel mesocolone.

Mobilitare il colon prossimale e creare la prima legatura in un'area priva di vasi nel mesocolone a circa 0,5 centimetri distali dal cieco. Misurare due centimetri dalla prima legatura e creare una seconda legatura in un'area priva di apporto di sangue nel mesocolone. Usando forbici fini, tagliare con cura accanto a ogni legatura per isolare un pcLoop lungo due centimetri.

Sciacquare delicatamente il pcLoop con HBSS caldo per rimuovere le feci utilizzando un tubo di alimentazione giallo flessibile collegato a una siringa da 10 millilitri. Assicurarsi di sciacquare il contenuto luminare dalla cavità addominale per mantenere pulito il sito chirurgico. Quindi, ligate le due estremità tagliate del pcLoop lavato usando la sutura di seta.

Utilizzare una siringa millilitro con un ago calibro 30 per iniettare lentamente 200 microlitri di reagente, come FITC-dextran o chemiochina, nel lume intestinale. Il pcLoop si gonfierà, causando una moderata distensione della mucosa. Utilizzare tamponi di cotone bagnati per rimettere delicatamente il pcLoop legato, l'ileo e il cieco.

Chiudi la parete addominale usando un portaaghi, pini anatomici e 3,0 suture di seta non assorbibili con un ago da taglio inverso. Dopo il periodo di incubazione, eutanasia il topo anestetizzato e raccogli i tessuti per l'analisi. Al fine di verificare l'accuratezza del modello a ciclo I per la valutazione della permeabilità intestinale, è stato eseguito un test FITC-dextran pcLoop per valutare il ruolo della proteina associata alla giunzione stretta Jam-a nella regolazione della funzione barriera intestinale in vivo.

Con il modello pcLoop, un aumento di 2,5 volte dei livelli di siero FITC-dextran è stato quantificato nei topi Jam-a null rispetto ai controlli. Risultati simili sono stati ottenuti con topi che ospitano una perdita selettiva di Jam-a sulle cellule epiteliali intestinali. Il modello pcLoop è stato utilizzato per studiare il neutrofilo polimorfonucleare, o PMN, il reclutamento nella mucosa intestinale e la successiva migrazione transepiteliale in vivo.

Il numero di PMN nel contenuto luminale del pcLoop è stato quantificato dall'analisi della citometria del flusso. Il numero di PMN presenti nel segmento del colon prossimale era basso in condizioni fisiologiche. Il pretrattamento con citochine pro-infiammatorie, TNF alpha e IFN gamma, prima dell'intervento chirurgico, ha portato a un numero aumentato di PMN reclutati nel pcLoop lumen.

La somministrazione dell'attrattore di chemio PMN LTB4 ha portato a un drammatico aumento del numero di PMN. La colorazione immunoistochimica della PMN nella mucosa colonica conferma l'elevato reclutamento di PMN a seguito della stimolazione con citochine e LTB4. Il contributo di Jam-a alla migrazione transepiteliale PMN è stato studiato utilizzando il modello pcLoop sui topi che ospitano una perdita selettiva di Jam-a sulle cellule epiteliali intestinali.

La perdita di Jam-a epiteliale portò ad un numero ridotto di PMN trasmigrate nel lume colonico rispetto ai controlli dei littermate. Un aspetto critico per questa tecnica è ricordare di preservare l'apporto di sangue al segmento intestinale esteriore durante l'esecuzione dell'intervento chirurgico. Seguendo questo protocollo, altri metodi come un saggio di permeabilità intestinale e un saggio di migrazione transepiteliale neutrofilo possono essere eseguiti per indagare la perdita di integrità della barriera e infiammazione intestinale in vivo.